固相萃取-HPLC法檢測(cè)熟肉制品中合成色素

畢小玲，宋娟，莊曉洪，王艷

（成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川成都610045）

固相萃取-HPLC法檢測(cè)熟肉制品中合成色素

畢小玲，宋娟，莊曉洪，王艷

（成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川成都610045）

建立固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定熟肉制品中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃4種合成色素的方法。熟肉制品絞碎后加入乙醇+氨水（75+25）溶液，經(jīng)渦旋分散、超聲提取，固相萃取柱凈化后，采用一臺(tái)液相儀器、兩根KromasilC18柱串聯(lián)分離，以甲醇和5mmol/L乙酸銨水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，用二極管陣列檢測(cè)檢測(cè)器在254 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。該方法在10 ng～160 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.999 8）；4種色素回收率為87.0%～95.5%，檢出限為0.04mg/kg～0.05mg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.37%～6.76%。該方法能同時(shí)分析熟肉制品中4種合成色素，并能得到穩(wěn)定準(zhǔn)確的結(jié)果，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間。

固相萃取；高效液相色譜法；合成色素；熟肉

熟肉制品以其營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美而深受人們喜愛(ài)，市面上銷(xiāo)售的熟肉制品具有食用方便、味道鮮美及色澤誘人等特點(diǎn)，是廣大消費(fèi)者熱衷的熟食制品。然而不法生產(chǎn)商為降低成本，采用質(zhì)量相對(duì)較差的原料，通過(guò)添加檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃等合成著色劑制作出色澤誘人的產(chǎn)品，從而實(shí)現(xiàn)改善產(chǎn)品色澤、提高銷(xiāo)量的目的[1-2]。

合成著色劑因其成本低、著色效果好，被生產(chǎn)商用于食品的制作過(guò)程。隨著研究的不斷深入，人們開(kāi)始逐漸認(rèn)識(shí)到人工合成著色劑大多是偶氮類型化合物，許多偶氮類型化合物在人體內(nèi)可代謝生成有毒副作用的物質(zhì)[3]。鑒于其不安全因素，國(guó)內(nèi)外對(duì)合成著色劑的使用制定了嚴(yán)格的規(guī)定，GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》也對(duì)合成著色劑的使用范圍和用量做了規(guī)定，其中熟肉制品中不得使用檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃等合成著色劑[4]。

現(xiàn)行的食品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)未涵蓋熟肉制品中這4種合成著色劑的檢驗(yàn)[5-6]。熟肉制品基質(zhì)復(fù)雜，合成著色劑著色力強(qiáng)，需用超聲等強(qiáng)化提取方法進(jìn)行提取，并進(jìn)行凈化方可進(jìn)行下一步分析。文獻(xiàn)中提取方法對(duì)與基質(zhì)相結(jié)合的著色劑提取不能保證，且用聚酰胺粉和抽濾漏斗進(jìn)行凈化，步驟繁瑣，對(duì)批量檢測(cè)造成了一定困難[2，7-12]。該研究采用超聲提取、全自動(dòng)固相萃取凈化相結(jié)合的方法，并用雙柱同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，為高效液相色譜法檢測(cè)熟肉制品中多組分著色劑提供了快速有效的方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

樣品（鹵豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉等熟肉制品）：市場(chǎng)抽檢；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)品溶液：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；莧菜紅、胭脂紅、日落黃標(biāo)準(zhǔn)品溶液：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；甲醇（色譜純）：德國(guó)Merck；甲醇、乙醇、乙酸銨、氨水、甲酸等均為分析純；超純水（電阻18.3 MΩ/cm2）；Cleanert PWAX固相萃取柱（500 mg，3 mL）：北京Agela公司。

1.2儀器與設(shè)備

Ultimate 3000雙三元高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器和Chromeleon 7.0工作站）：美國(guó)熱電公司；GX-274全自動(dòng)固相萃取儀：法國(guó)Gilson公司；實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：Kromasil100-5C18（4.6mm×250mm）；柱溫：35℃；流動(dòng)相：甲醇（A）和5mmol/L乙酸銨（B）；梯度洗脫程序見(jiàn)表1和表2；進(jìn)樣體積：10μL；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度Table1 Gradientelution program

表2 流動(dòng)相洗脫梯度Table2 Gradientelution program

1.3.2樣品提取

稱取2.00 g絞碎樣品于50 mL離心管中，加入10mL提取溶劑（乙醇+氨水=75+25），渦旋分散1min，超聲提取20min，室溫10 000 r/min離心5min，傾出上清液，加入10mL提取溶劑重復(fù)提取1次，合并上清液并搖勻。取上清液10mL于雞心瓶，于50℃濃縮至4 mL～5mL，于70℃恒溫30 s，分別加入1mL硫酸溶液（濃硫酸∶水=1∶9，體積比，）和1mL鎢酸鈉溶液（100 g/L），搖勻，繼續(xù)于70℃水浴恒溫5min，取出放至室溫，轉(zhuǎn)移雞心瓶?jī)?nèi)物質(zhì)并用水定容至10mL，搖勻，10 000 r/min離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至50mL離心管并用氨水調(diào)pH=5.0，待凈化。

1.3.3凈化

分別用6 mL甲醇、6 mL水活化固相萃取柱；取8 mL待凈化液以0.5mL/min速度過(guò)柱；依次用6mL 0.5%甲酸甲醇溶液、6mL水淋洗小柱；最后用6mL 25%氨水甲醇以0.5mL/min速度洗脫，洗脫液于50℃氮?dú)獯蹈?，加水超聲溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?mL，10 000 r/ min離心10min，上清液待測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1目標(biāo)檢測(cè)物的選擇

GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)可用于熟肉制品中的色素做了明確規(guī)定，其中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃禁止在熟肉制品中使用[4]。但是，由于這4種色素在市面使用較多，著色后的食物顏色自然，能夠刺激消費(fèi)者的食欲，同時(shí)，熟肉制品本身的顏色多為紅色或黃色，因此這4種色素易被生產(chǎn)商用來(lái)改善熟肉制品的感官，減少劣質(zhì)產(chǎn)品的損失，以較低的成本獲得好的銷(xiāo)量。另外，在以往報(bào)道出的食品安全事故中，檸檬黃和日落黃在餐飲店熟肉制品中被檢出?；谝陨闲畔?，選擇了這4種著色劑進(jìn)行研究。

2.2色譜條件的優(yōu)化

2.2.1流動(dòng)相的選擇

所選合成色素偏極性，根據(jù)極性差別，4種物質(zhì)在反相色譜分離條件下流出時(shí)間也不同，采用甲醇-乙酸銨溶液體系作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，可以使4種物質(zhì)得到很好的分離，并得到較好的峰形。當(dāng)乙酸銨濃度為0.02mol/L[2，5-6，8-10]，甲醇初始比例為5%時(shí)，最后出峰時(shí)間為15min；當(dāng)乙酸銨濃度降為0.005mol/L，甲醇初始比例為5%時(shí)，最后出峰時(shí)間可縮短到13.2min，此時(shí)4種物質(zhì)也可以實(shí)現(xiàn)基線分離，且峰形對(duì)稱。目標(biāo)峰全部流出后將甲醇比例增加到90%，在6min內(nèi)可將色譜柱中的雜質(zhì)沖出，然后切換到初始濃度進(jìn)行平衡，整體分析時(shí)間為25min。

2.2.2 色譜儀器的選擇

當(dāng)使用Ultimate 3000液相色譜儀的雙三元泵系統(tǒng)，串聯(lián)兩根相同型號(hào)的色譜柱進(jìn)行分析，在4種目標(biāo)物全部由柱1流出后，對(duì)色譜柱進(jìn)行切換，使柱1的沖柱程序在后臺(tái)運(yùn)行，用柱2開(kāi)始分析下一個(gè)樣品。此時(shí)完成一個(gè)樣品的分析時(shí)間為14min，在很大程度上提高分析效率。

2.2.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器對(duì)4種物質(zhì)在190 nm至600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，檸檬黃在196、259、427 nm處有最大吸收，莧菜紅在217、521 nm有最大吸收，胭脂紅在216、248、335、509 nm處有最大吸收，日落黃在236、315、482 nm處有最大吸收，綜合掃描結(jié)果、國(guó)標(biāo)方法，選擇254 nm作為唯一檢測(cè)波長(zhǎng)，既減少波長(zhǎng)設(shè)置數(shù)、又可實(shí)現(xiàn)較低的檢測(cè)限。

最佳色譜條件下，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1和圖2。

圖1 合成色素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液分離色譜圖Fig.1 Chromatogram for them ixed 4 synthetic pigmentsstandards

圖2 樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram for sam ple

2.3樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1提取條件的選擇

這4種色素極性較強(qiáng)，易溶于水，微溶于乙醇。用水作為提取溶劑較難得到與蛋白質(zhì)結(jié)合的色素，并且將提取出較多水溶性雜質(zhì)。因此比較了氨水乙醇水溶液（20+70+10）[6，9，13]、氨水乙醇溶液（25+75）[8]對(duì)熟肉制品中色素的提取效率。結(jié)果表明，氨水乙醇溶液（25+ 75）提取率相對(duì)高。標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)[6，11，13]中先用石油醚去除油脂，然后加提取溶劑提取，研究對(duì)其進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示用與不用石油醚對(duì)提取結(jié)果影響較小。

將樣品粉碎，加入提取溶劑，渦旋分散樣品并超聲提取10min，所得樣品提取率高于不超聲。勻漿提取與超聲比較，提取效率接近，均為90%左右，因此選擇超聲提取，可簡(jiǎn)化提取步驟。

分別對(duì)樣品提取2次與3次，每次加入提取溶劑10mL。提取次數(shù)為2次與提取3次結(jié)果接近，因此選擇2次提取。

提取指標(biāo)的回收率數(shù)據(jù)比較見(jiàn)表3。

表3 提取指標(biāo)考察Table3 Research of extraction items

2.3.2凈化條件的優(yōu)化

標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)[5-6，15]方法采用聚酰胺粉吸附法進(jìn)行凈化，控制操作溫度為60℃～70℃，用漏斗抽濾，經(jīng)至少3次淋洗，需淋洗液和洗脫液體積大，過(guò)程繁瑣。研究選用PWAX固相萃取柱凈化，將待凈化液用氨水調(diào)節(jié)pH=5.0，上樣后用5%甲酸甲醇溶液、水依次淋洗，然后用25%氨水甲醇洗脫，氮?dú)獯蹈?，用水定容即可。極大地簡(jiǎn)化了操作步驟，同時(shí)能進(jìn)行批處理，提高了檢驗(yàn)效率。

2.3.3針頭過(guò)濾器的選擇[11]

研究顯示，尼龍膜和聚醚砜膜對(duì)莧菜紅和胭脂紅均有吸附，為了避免損失，檢驗(yàn)過(guò)程采用高速離心代替過(guò)濾。經(jīng)試驗(yàn)，未經(jīng)過(guò)膜的樣品并未顯著影響色譜柱的使用壽命。因此，選擇高速離心后直接上機(jī)測(cè)試。

2.4分析方法特性

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別吸取4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用水稀釋成質(zhì)量濃度為100mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再用水將儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度為1、2、4、8、16mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列，分別取10μL注入液相色譜儀測(cè)定，得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法檢出限，各著色劑峰面積與濃度的線性關(guān)系方程、相關(guān)系數(shù)、及檢出限如表4所示。

2.4.2加標(biāo)回收和精密度

平行稱取9份陰性粉碎樣品于50mL離心管，分為3組，分別加入相當(dāng)于4、10、20μg色素含量的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，渦旋分散，并放置30min。按照樣品提取與凈化方法對(duì)9個(gè)樣品進(jìn)行處理，測(cè)定，計(jì)算回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表5和圖3。

表4 色素各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table4 Calibration equations，linerity range，correlation coefficientsand detection lim its for the4 synthetic pigments

表5 加標(biāo)回收率（n=3）Table5 Recovery and RSD for the4 synthetic pigmentsin spiked sample（n=3）

圖3 樣品加標(biāo)色譜圖Fig.3 Chrom atogram for spiked sam ple

3結(jié)論

通過(guò)對(duì)熟肉制品中合成著色劑的提取、凈化、色譜分析，建立了適用于檢驗(yàn)熟肉制品中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃含量的方法。方法中超聲提取、批處理凈化、流動(dòng)相優(yōu)化、雙柱同時(shí)分析等步驟，確保提取效果的同時(shí)，縮短了分析時(shí)間，檢出限優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T5009.35-2003《食品中合成著色劑的測(cè)定》，且方法重現(xiàn)性、精密度、穩(wěn)定性良好。試驗(yàn)表明，該方法適用于熟肉制品中合成著色劑的檢驗(yàn)。

采用此檢測(cè)方法共檢出抽檢熟肉制品中濫用合成色素23批次，其中檸檬黃18批次，添加范圍0.000 59 g/kg～0.014 g/kg；胭脂紅3批次，添加范圍0.000 76 g/kg～0.005 2 g/kg；檸檬黃2批次，添加范圍0.010 g/kg～0.015 g/kg。

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Determ ination of Synthetic Pigments in Cooked M eat by Solid Phase Extraction and HPLC

BIXiao-ling，SONG Juan，ZHUANGXiao-hong，WANGYan
（Chengdu Center for Food and DrugControl，Chengdu 610045，Sichuan，China）

Amethod ofsolid phase extraction（SPE）and high performance liquid chromatography（HPLC）for determining synthetic pigments in cooked meatwas developed.It included lemon yellow，amaranth，carmine and sunsetyellow.Cookedmeatwasminced.By adding ethanol-ammonium hydroxide solvent（75±25），eddying，supersonic extracting and SPE purifying，the synthetic pigments was extracted.Then the 4 components could beeluted and seperated in KromasilC18 column bymobile phasemadeup ofmethanoland 5mmol/Lammonium acetate.Theywere detected in 254 nm by diode array detector.There could be 2 same columns paralled forsimultaneousanalysis.Themethod exhibited excellent linearity overa rangeof10 ng-160 ng（r≥0.999 8）. The recovery rate，detection limit，and relative standard deviation（RSD）were 87.0%-95.5%，0.04mg/kg-0.05mg/kg，2.37%-6.76%.Themethod can providessimultaneously steady and accurate results for the 4 synthetic pigments in cookedmeat，and save the detection time.

solid phase extraction（SPE）；high performance liquid chromatography（HPLC）；synthetic pigment；cookedmeat

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.038

2016-05-03

畢小玲（1982—），女（漢），工程師，碩士，從事食品理化檢驗(yàn)工作。