乳山灣近海沉積物潛在硝化速率的測定

賀 惠,甄 毓,米鐵柱*,于志剛(1.中國海洋大學海洋生命學院,山東 青島 266003；2.中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室,山東 青島 266100；3.青島海洋科學與技術國家實驗室,海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室,山東 青島 266071；4.中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院,山東 青島 266100；5.中國海洋大學海洋化學理論與教育部重點實驗室,山東 青島 266100)

乳山灣近海沉積物潛在硝化速率的測定

賀 惠1,2,3,甄 毓2,3,4,米鐵柱2,3,4*,于志剛3,5(1.中國海洋大學海洋生命學院,山東 青島 266003；2.中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室,山東 青島 266100；3.青島海洋科學與技術國家實驗室,海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室,山東 青島 266071；4.中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院,山東 青島 266100；5.中國海洋大學海洋化學理論與教育部重點實驗室,山東 青島 266100)

在測定乳山灣近海沉積物潛在硝化速率(PNR)的過程中發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)前后溶解無機氮(DIN)含量顯著下降,表明體系中存在DIN損失,且損失的溶解無機氮含量與硝化總量的比值為 2.72%～40.02%.進一步通過實時熒光定量 PCR技術測定培養(yǎng)過程中亞硝酸鹽還原酶基因(nitrite reductase gene, nirK)的表達情況,發(fā)現(xiàn)氨氧化古菌(AOA)和好氧氨氧化細菌(AOB)均有nirK基因的表達,表明硝化微生物的反硝化過程(ND)是導致無機氮損失的原因之一.若僅根據(jù)測得的硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度估算乳山灣近海沉積物的潛在硝化速率會低估 PNR(C0和C2 2個站位,考慮ND過程得到的總PNR分別是未考慮ND過程的15.9倍和22.1倍,而對于AOA的PNR則是22.3倍和46.1倍),因此在計算時,必須將體系中損失的無機氮計算在內.

乳山灣；潛在硝化速率；硝化微生物的反硝化過程；亞硝酸鹽還原酶

沉積物潛在硝化速率(potential nitrification rates, PNR)是表征好氧氨氧化微生物硝化作用的重要化學指標.潛在硝化速率的測定方法主要有15N同位素法[1]和培養(yǎng)法[2-3],其中培養(yǎng)法由于方法簡單易于施行,是最常用的測定方法[4-5].潛在硝化速率可以比較不同環(huán)境樣品中微生物將銨鹽轉化為硝酸鹽的最大硝化能力,反映微生物的豐度和活性[6-7].通過添加氨芐青霉素抑制氨氧化細菌的活性,可以進一步區(qū)分氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)和氨氧化細菌(aerobic ammonia-oxidizing bacteria, AOB)在硝化作用中的相對貢獻,如 Zheng等[4]通過測定長江口潮間帶沉積物的PNR推測該環(huán)境中的氨氧化過程主要由AOA推動.

硝化作用是氮素循環(huán)的重要過程,不僅影響銨態(tài)氮的轉化,同時也與過量氮素導致的水體富營養(yǎng)化和溫室氣體N2O釋放等環(huán)境問題直接相關[8].隨著技術手段的不斷進步,越來越多的研究表明好氧氨氧化微生物在進行氨氧化的同時也存在反硝化過程[9-10],即硝化微生物的反硝化作用(nitrififer denitrification, ND).該過程能將亞硝酸鹽轉化為N2O等氣體,導致培養(yǎng)體系中氮元素損失.然而,關于硝化微生物的反硝化作用對測定和計算潛在硝化速率的影響鮮見報道.

乳山灣位于山東半島,為一半封閉的淺水海灣,是重要的經濟貝類養(yǎng)殖區(qū).隨著近年來工農業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,大量氮、磷營養(yǎng)鹽的輸入使得乳山灣近海水質環(huán)境發(fā)生了一系列變化,富營養(yǎng)化趨勢明顯,2008年該海域暴發(fā)了海洋卡盾藻(Chattonella marina)為主要原因種的赤潮[11].基于以上考慮,本研究選擇受人類活動擾動大、富營養(yǎng)化現(xiàn)象突出的乳山灣為研究海域,通過實時熒光定量PCR技術和潛在硝化速率模擬培養(yǎng)實驗,對硝化微生物的反硝化過程進行研究,為準確計算該海域沉積物潛在硝化速率提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015年2月采集乳山灣鄰近海域表層沉積物樣品,采樣站位為C0站(121.47°E, 36.74°N)和C2站(121.49°E, 36.66°N) (圖1).沉積物樣品置于4°C低溫保存,立即帶回實驗室進行潛在硝化速率測定的培養(yǎng)實驗.

1.2 潛在硝化速率測定

按照 Bernhard等[3]的方法測定潛在硝化速率.取1.0g沉積物加入30mL配制的水樣(現(xiàn)場海水經0.22μm濾膜過濾后,加入NH4Cl和KH2PO4使其終濃度分別為300,60μmol/L)中,黑暗條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng),每個樣品設置 3個平行培養(yǎng)組.0,1,2,3d分別取樣、離心、過濾,水樣于-20°C保存,用于NH4-N、NO3-N和NO2-N的測定.共設置2個培養(yǎng)組,一組加入1.0g/L氨芐青霉素[4],抑制AOB活性,計算AOA的PNR;另一組不添加氨芐青霉素,計算AOA與AOB的PNR之和,兩組相減即為AOB的PNR.

圖1 乳山灣近海采樣站位示意Fig.1 Sampling sites in surface sediments from adjacent waters of Rushan Bay

1.3 沉積物微生物RNA提取

培養(yǎng)過程中于第0,1,2,3d分別取沉積物樣品2.0g,置于液氮中保存.利用 RNA PowerSoil?Total RNA Isolation kit(MOBIO,USA)提取沉積物中微生物總 RNA,以 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit(Roche,Germany)將RNA反轉錄為cDNA.將得到的cDNA置于-80℃保存.

1.4 nirK基因質粒標準曲線的建立及樣品測定

利用引物分別擴增AOA和AOB nirK基因(表1).PCR產物經電泳分離,檢測目的條帶.將目的條帶純化、連接到pMD18-T載體(寶生物,大連)后轉化到Escherichia coli Trans 5α感受態(tài)細胞中,通過藍白斑篩選含有目的基因片段的陽性克隆.快速質粒小提試劑盒(康為,北京)制備質粒后,送測序公司測序(華大基因,北京).用超微量紫外分光光度計(Picodrop,UK)測定重組質粒的濃度,計算重組質粒的拷貝濃度.將得到的質粒 10倍梯度稀釋后于-80℃保存,用于構建定量 PCR體系的標準曲線.

表1 AOA和AOB nirK基因引物Table 1 Primers for AOA and AOB nirK gene

以梯度稀釋的質粒標準品為模板,利用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑盒(Roche,Germany)在ABI 7500實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,USA)上進行檢測,反應體系中加入 0.20μg/μL牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)[14].退火溫度如表1.每個質粒濃度3個平行樣,實驗體系中同時添加陰性對照.以質?？截悢?shù)對數(shù)值為橫坐標,Ct值為縱坐標,繪制標準曲線.

樣品測定時,定量PCR的體系和條件與標準曲線相同,實驗體系中同時包括陽性對照和陰性對照,每個樣品測定3個平行樣.通過標準曲線換算樣品中nirK基因的拷貝數(shù).

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)過程中溶解無機氮含量的變化

圖2 培養(yǎng)過程中硝酸鹽與亞硝酸鹽、銨鹽及溶解無機氮含量的變化Fig.2 The content variations of nitrate and nitrite, ammonium, dissolved inorganic nitrogen during cultivation

計算無機氮損失量與硝化總量的比值發(fā)現(xiàn)(圖 3),該比值較高.由此表明,計算潛在硝化速率時無機氮的損失量不可忽略.在潛在硝化模擬培養(yǎng)條件下,導致無機氮損失的生物過程主要有好氧反硝化過程和硝化微生物的反硝化過程等.

圖3 培養(yǎng)過程中無機氮損失量與硝化總量的比值Fig.3 The ratio of inorganic nitrogen loss to nitrified nitrogen accumulation during cultivation

2.2 硝化微生物的反硝化過程中nirK基因表達 量的變化

圖4 培養(yǎng)過程中AOB亞硝化單胞菌屬和AOA nirK基因拷貝數(shù)的變化Fig.4 The variations of Nitrosomonas and AOA nirK gene copy numbers during cultivation

對含有目的基因的質粒標準品進行定量PCR反應后,得到不同質粒濃度對應的 Ct值.以質?？截悢?shù)的對數(shù)值為橫坐標,Ct值為縱坐標計算回歸方程.AOA nirK基因的回歸方程為y=-3.230x+38.511,回歸系數(shù) r=-0.999;熔解曲線只在78.1℃處有一單峰出現(xiàn),說明qPCR反應過程中無引物二聚體或其他非特異性擴增.AOB亞硝化單胞菌屬Nitrosomonas nirK基因的回歸方程為y=-3.179x+37.569,回歸系數(shù) r=-0.998;熔解曲線只在81.6℃處有一單峰出現(xiàn),說明qPCR反應過程中無引物二聚體或其他非特異性擴增.

cDNA定量結果顯示,培養(yǎng)過程中 AOA和AOB的nirK基因均有表達(圖4).未添加氨芐青霉素組,C0和C2 2個站位AOB亞硝化單胞菌屬Nitrosomonas nirK 基因的表達量分別為(1.1×103)～(2.8×103)copies/g和(9.4×102)～(1.9×103) copies/g,并隨時間呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢;AOA nirK 基因的表達量分別為(4.5×105)～(4.1× 106)copies/g和(5.1×105)～(3.4×106)copies/g,且分別在第2d和第3d達到最大值.

添加氨芐青霉素組,C0和 C2 2個站位中AOA nirK 基因表達量分別為(5.0×105)～(2.3× 106)copies/g和(1.2×106)～(2.4×106)copies/g,在第2d達到最大值.

2.3 潛在硝化速率分析

潛在硝化速率的計算分別采用2種方法.方法 1是通過測得的硝酸鹽和亞硝酸鹽增加量計算PNR(以N/g沉積物計,式1).

式中:ΔC(NO3+NO2)表示測得的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的變化值,μmol N;t表示培養(yǎng)時間,d.

方法2則是在方法1的基礎上,考慮無機氮的損失(損失的溶解無機氮)計算PNR(以N/g沉積物計,式2).

式中:ΔCDIN表示培養(yǎng)過程中溶解無機氮含量變化值的絕對值,μmol N.若整個系統(tǒng)沒有無機氮的損失,則ΔCDIN為零,與式(1)的結果一致.

表層沉積物的潛在硝化速率如圖5所示.若不考慮反硝化過程的存在,即實際生成的硝酸鹽和亞硝酸鹽沒有損失時,由式(1)計算PNR,C0和C2兩個站位的總潛在硝化速率分別為0.019和0.018μmol N/(d·g沉積物),添加氨芐青霉素組抑制細菌活性后得到的AOA的PNR分別為0.008和0.006μmol N/(d·g沉積物),差減得到AOB的PNR分別為0.011和0.012μmol N/(d·g沉積物).若將硝化微生物的反硝化過程考慮在內,根據(jù)式(2)校正DIN損失后,C0和C2兩個站位的總PNR分別為0.295和0.398μmol N/(d·g沉積物),AOA的PNR分別為0.174和0.290μmol N/(d·g沉積物),AOB的 PNR分別為 0.121和 0.108μmol N/(d·g沉積物).

圖5 乳山灣近海表層沉積物的潛在硝化速率Fig.5 Potential nitrification rates in surface sediments from adjacent waters of Rushan Bay

3 討論

通常在計算潛在硝化速率時有以下幾個方面的假設條件:(1)培養(yǎng)體系中不存在有機氮和無機氮間的相互轉化(氨化作用與氨同化作用),(2)培養(yǎng)過程中不存在反硝化過程,(3)硝化過程不受銨鹽及其它營養(yǎng)元素的限制.通過設置適宜的培養(yǎng)時間、避光抑制光合作用以及較高的氨氮濃度,可基本滿足第1個和第3個條件;而對于第2個假設,早期的研究中認為通過攪拌充氣等措施,將培養(yǎng)體系保持在富氧狀態(tài),即可避免反硝化過程.近年來有研究表明,好氧反硝化過程和硝化微生物的反硝化過程都能在有氧條件下將亞硝酸鹽轉化為N2O或N2等氣體[9,15-16],使得這一問題變得復雜.AOA和AOB均存在亞硝酸鹽還原酶基因nirK[12,16-19],可以進行反硝化作用;采用15N同位素技術對土壤中N2O的來源進行研究,發(fā)現(xiàn)硝化微生物的反硝化過程對其平均貢獻率為34%～80%[20-21],說明該過程在N2O釋放過程中發(fā)揮了重要作用.

在PNR測定的培養(yǎng)實驗中,添加的NH4+濃度遠高于背景值,可認為其是硝化作用的主要氮源.根據(jù)氮元素物質的量守恒,消耗的銨鹽應全部轉化為硝酸鹽和亞硝酸鹽,對于整個培養(yǎng)系統(tǒng),溶解無機氮的含量應保持穩(wěn)定.而本研究中,消耗的銨鹽量大于生成的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量,溶解無機氮含量降低,說明培養(yǎng)體系中存在無機氮損失.進一步以硝化微生物的反硝化過程關鍵酶nirK基因為目的基因,采用特異引物進行定量PCR反應,在培養(yǎng)過程中檢測到 AOA和 AOB nirK基因的大量表達.微生物基因組 DNA中存在nirK基因說明其具有反硝化能力,但可能由于環(huán)境不適宜而不會轉錄表達,不發(fā)揮相應的生理生化功能,而在RNA水平上檢測到nirK基因的表達則可以明確表明微生物正在進行反硝化作用.微生物的轉錄和翻譯過程是同時進行的,通常在轉錄RNA之后即合成具有相應功能的蛋白質(酶).本研究在RNA水平上檢測到AOA與AOB nirK基因的表達,說明培養(yǎng)體系中正在進行反硝化作用,硝化微生物的反硝化作用是造成無機氮損失的原因之一.

由于乳山灣近海沉積物中硝化微生物的反硝化過程的存在,培養(yǎng)體系中存在亞硝酸鹽向N2O的轉化,導致DIN損失.若只根據(jù)測得的硝酸鹽和亞硝酸鹽的增加量計算PNR,會低估該海域實際的潛在硝化速率,因此必須考慮DIN的損失量加以校正,即上文提出的式(2).本研究中C0和C2 2個站位校正后的總 PNR是未校正數(shù)值的15.9倍和22.1倍,校正后AOA的PNR是未校正數(shù)值的22.3倍和46.1倍,考慮無機氮損失前后潛在硝化速率差異較大.

分析AOA amoA基因與nirK基因表達量發(fā)現(xiàn),二者存在顯著的正相關關系(未發(fā)表數(shù)據(jù)),并且 nirK基因表達量約為 amoA基因表達量的10～40倍,說明培養(yǎng)體系中ND過程強烈,這與較高的DIN損失相一致;Lund等[12]對Monterey海灣的研究結果亦是如此,表明AOA中nirK基因和amoA基因關系密切,相伴而生.乳山灣近海沉積物中能夠檢測到硝化微生物的反硝化過程的存在,并且其強度可能隨氨氧化作用的增強而增高,由此導致的無機氮損失必須加以關注.

4 結論

4.1 乳山灣近海沉積物的潛在硝化速率培養(yǎng)試驗中存在無機氮損失,且損失的溶解無機氮含量與硝化總量的比值為2.72%～40.02%.

4.2 培養(yǎng)過程中AOA和AOB nirK基因活性較高,表明硝化微生物的反硝化過程是造成無機氮損失的原因之一.

4.3 對于C0和C2 2個站位,考慮硝化微生物的反硝化過程得到的總PNR分別是未考慮硝化微生物的反硝化過程的 15.9倍和 22.1倍,而對于AOA的PNR則分別是22.3倍和46.1倍.因此,若僅根據(jù)測得的硝酸鹽和亞硝酸鹽的增加量計算該海域沉積物潛在硝化速率會導致計算結果偏低,計算時應將培養(yǎng)過程中無機氮的損失納入其中.

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致謝：感謝中國海洋大學海洋生命學院王華龍同學和國家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心劉軍同學在野外采樣中給予的幫助,感謝中國海洋大學化學化工學院谷文艷同學在溶解無機氮測定中給予的幫助.

Measurement of potential nitrification rates in sediments from adjacent waters of Rushan Bay.

HE Hui1,2,3, ZHEN Yu2,3,4, MI Tie-zhu2,3,4*, YU Zhi-gang3,5(1.College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China；2.Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China；3.Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China；4.College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China；5.Key Laboratory of Marine Chemical Theory and Technology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China). China Environmental Science, 2017,37(3)：1082～1088

In this paper, dissolved inorganic nitrogen (DIN) contents declined significantly when potential nitrification rates (PNR) were measured in sediments from adjacent waters of Rushan Bay, which indicated DIN loss occurred during cultivation, and the ratio of dissolved inorganic nitrogen loss to nitrification content ranged from 2.72% to 40.02%. Moreover, the expressions of copper-containing nitrite reductase gene (nirK) were analyzed with real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR), and the results showed that the gene expressed in both ammmonia-oxidizing archaea (AOA) and aerobic ammonia-oxidizing bacteria (AOB), and nitrifier denitrification was one of the reasons that led to DIN loss. PNR would be underestimated if only nitrate and nitrite concentrations were taken into account. For station C0 and C2, total PNR considered ND was 15.9 and 22.1 times of that not considered ND, respectively; and PNR of AOA considered ND was 22.3 and 46.1 times of that not considered ND, respectively. Therefore, DIN loss should be considered when PNR in sediments from adjacent waters of Rushan Bay were calculated.

Rushan Bay；potential nitrification rates；nitrifier denitrification；copper-containing nitrite reductase

X55,Q89,Q938.1

A

1000-6923(2017)03-1082-07

賀 惠(1987-),女,山東日照人,博士,主要從事海洋生態(tài)學研究.發(fā)表論文4篇.

2016-07-08

國家自然科學基金資助項目(41620104001,41521064);中國科學院海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室、青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學開放課題(KLMEES201601)

* 責任作者, 副教授, mitiezhu@ouc.edu.cn