北方高寒地帶生物堆肥中高溫纖維素分解菌的篩選及分離純化研究

張勝男　張浩洋　張躍華

摘 要：對生物堆肥中的高溫纖維素分解菌進(jìn)行篩選及分離純化，探索其對纖維素的降解能力及生物學(xué)特性，研究對應(yīng)的菌種特性，使其純化利用于現(xiàn)代堆肥技術(shù)中以促進(jìn)東北黑土地的修復(fù)，改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)。采用透明圈法，篩選出此生物堆肥中的高溫纖維素分解菌；純化培養(yǎng)后比較其纖維素分解效率。通過篩選及分離純化共獲得有效菌種5種，分別命名為G1到G5，其中G2的濾紙失重率最高，可達(dá)70%，G1的濾紙失重率最低，為25%。生物堆肥中存在多種高溫纖維素分解菌，不同菌株對纖維素類物質(zhì)的分解能力具有一定的差異。

關(guān)鍵詞：堆肥；高溫纖維素分解菌；篩選；分離

中圖分類號：Q89 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170331001

引言

生物堆肥是利用微生物的特性生產(chǎn)具有優(yōu)異性能的有機(jī)肥料，是農(nóng)業(yè)固體有機(jī)廢棄物的有效利用重要方式[1]。堆肥秸稈中的纖維素是一種由葡萄糖組成的多糖，常溫下較為穩(wěn)定，是植物細(xì)胞壁的主要成分，由于其本身的結(jié)構(gòu)致密且難于降解，從而阻礙了堆肥技術(shù)的發(fā)展[2]。為推進(jìn)堆肥技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，目前，主要采用利用纖維素分解菌或其產(chǎn)生的酶來降解纖維素的生物手段對纖維素加以降解利用。在各種堆肥中，高溫放線菌是高溫條件下有機(jī)物的旺盛分解者，真菌對纖維素的分解和穩(wěn)定起重要角色[3]，其在堆肥的快速腐熟中具有重要作用。相對于其它微生物類群而言，現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的高溫放線菌的種類較少[4]。因此，篩選和分離純化高效纖維素分解菌的工作凸顯尤為迫切。佳木斯市地處中國東北部，屬北方高寒地帶。本文通過對該地區(qū)生物堆肥樣品中的高溫纖維素降解菌進(jìn)行篩選及分離的研究，篩選出5個耐高溫纖維素降解菌株，并用于降解堆肥中的纖維素成分，可促進(jìn)東北黑土地的修復(fù)，對于改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，增加土壤保水、保肥的能力，改善生物堆肥中纖維素的降解效率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌種采集

供試菌種分離于高溫堆肥（作物秸稈（玉米、水稻）、馬糞、牛糞等均按一定比例5：1：1混合而成，內(nèi)部溫度最高時可接近60℃），在此堆肥中選取帶有白色菌絲的作物秸稈，置于冰箱保存。

1.2 培養(yǎng)基

纖維素剛果紅培養(yǎng)基：K2HPO4 1.0g，CMC-Na 3.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，（NH4）2SO4 2.0g，胰蛋白胨1.0g，剛果紅0.0692g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，pH=7.0。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮） 200.0g，葡萄糖 20.0g，

瓊脂 20.0g，蒸餾水1000mL。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉浸膏5.0g，蛋白胨10g，

NaCl 5.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4。

高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0g，KNO3 1.0g，

K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4。

1.3 高溫纖維素分解菌的篩選

將采集的樣品置于無菌操作臺中，用消毒鑷子挑取白色菌絲，放入潔凈培養(yǎng)皿中，白色菌絲接于培養(yǎng)基中，置于50℃左右的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24h觀察1次，拍照并做相應(yīng)的實驗記錄，持續(xù)5d。觀察是否有透明圈出現(xiàn)。若出現(xiàn)透明圈，則證明為有分解纖維素能力的菌株，其中透明圈的通透度和直徑與該菌種的降解纖維素的效率呈正相關(guān)。

1.4 高溫纖維素分解菌的分離

選取培養(yǎng)基中出現(xiàn)透明圈的菌種，將其分別接在真菌、細(xì)菌、放線菌的培養(yǎng)基上，置于上述溫度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d，觀察菌種生長狀況用鏡檢手段幫助判斷。將菌種純化培養(yǎng)并保存。

1.5 CMC酶相對活性的計算及比較

參照文獻(xiàn)蔡燕飛等人的方法[5]，測量上述產(chǎn)生透明圈菌種的透明圈直徑，利用公式（1）計算不同菌種CMC酶的相對活性，數(shù)值越大代表該種菌CMC酶的相對活性越高。

1.6 濾紙崩解試驗

參照文獻(xiàn)中張淑彬的方法[6]，將篩選出的菌株接種到以濾紙為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，同時做不接種的對照處理，在45℃下培養(yǎng)7d。進(jìn)行過濾操作，將殘留物在80℃下烘干稱重，用公式（2）計算出濾紙失重率。

1.7 秸稈分解效果測定

參照文獻(xiàn)蔡燕飛等方法[5]，將干秸稈切成3cm左右，將各菌株分別接種至以干秸稈為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為110r/min的搖床45℃下培養(yǎng)4d，將殘渣濾出，80℃烘至恒重，計算降解后每克干秸稈的殘重。

2 結(jié)果分析

2.1 菌種篩選結(jié)果

觀察5d內(nèi)纖維素剛果紅培養(yǎng)基內(nèi)透明圈產(chǎn)生情況，結(jié)果表明：此堆肥中主要存在5種高溫纖維素分解菌使培養(yǎng)基產(chǎn)生透明圈，且產(chǎn)生的透明圈直徑均在可測量的范圍內(nèi)。其它雜菌在碳源，溫度均符合其生長條件的情況下也可以在此培養(yǎng)基中正常生長，但是不會產(chǎn)生具有降解特性的透明圈出現(xiàn)。

2.2 菌種分離結(jié)果

分離結(jié)果表明：5種高溫纖維素分解菌的生長形態(tài)均不相同，若命名于G1到G5，則G1可在高氏一號培養(yǎng)基中正常生長，其他培養(yǎng)基中無明顯生長現(xiàn)象，結(jié)合鏡檢結(jié)果判斷其為放線菌，菌落始終為白色，無氣生菌絲產(chǎn)生，且長勢緩慢，初次觀察和3d后觀察到的菌落大小無明顯差別，相對其他直徑較小，而G2可在PDA培養(yǎng)基中正常生長，但其他培養(yǎng)基中無明顯生長現(xiàn)象，結(jié)合鏡檢結(jié)果判斷其為真菌，其菌絲呈叢枝狀、有隔，分生孢子為淺褐色，呈現(xiàn)頂生或側(cè)生，生長速率較其他快速，3d左右菌絲即可鋪滿整個培養(yǎng)皿。其他3種菌株均可在PDA培養(yǎng)基中正常生長（見表1）。

2.3 CMC酶相對活性的比較結(jié)果

比較結(jié)果比較表明，在培養(yǎng)3d的情況下，G2 的CMC酶的相對活性最高，G1的CMC酶的相對活性最低，且G2的CMC酶的相對活性約為G4的2倍（見表2）。

2.4 羧甲基纖維素鈉的分解能力比較結(jié)果

濾紙條崩解試驗的結(jié)果顯示，G2的濾紙失重率稍高，可達(dá)70%，G1的濾紙失重率小于其他4種，約為25%；G3的濾紙失重率約為35%，G4的濾紙失重率約為40%，G5的濾紙失重率也較低，可達(dá)28%。由此表明，G2具有較強(qiáng)的分解羧甲基纖維素鈉的能力，而G1的分解能力最弱（見表2）。

2.5 秸稈的分解能力比較結(jié)果

經(jīng)過4d的培養(yǎng)后，G2所在的培養(yǎng)基內(nèi)干秸稈殘重最小，為0.5230.025/g，而G1所在的培養(yǎng)基內(nèi)干秸稈殘重最大，為0.8360.013/g，表明G2的纖維素分解效果較其他菌株更為理想（見表2）。

3 結(jié)論分析

實驗用生物堆肥中獲得5種高溫纖維素分解菌，分別為G1到G5，且G2的CMC酶相對活性最高，分解纖維素的能力也相對出眾；分離純化后結(jié)合鏡檢結(jié)果判斷G1為放線菌，而G2為真菌，其他3種菌均可在PDA培養(yǎng)基中正常生長，但并未判斷出其具體種類。由此可以判斷，纖維素分解菌廣泛存在于生物堆肥中，且種類多樣；微生物對來源具有差異的纖維素降解能力也不相同。從以上分析結(jié)果可見，CMC酶活力高的菌株，其濾紙分解效果也比較明顯[7]；本實驗所篩選得到的高溫纖維素分解菌均可用于分解生物堆肥中的纖維素，將其用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，將會大幅度提高堆肥中纖維素的利用效率，并提高土壤肥力，推動堆肥技術(shù)的發(fā)展。由于纖維素的降解速率及效果受多方面因素的影響，在實際應(yīng)用中，還需在理論依據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行具體的多方面的研究。

參考文獻(xiàn)

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[6]張淑彬，王幼珊，鄒國元.不同纖維素分解菌纖維素酶活性比較試驗[J].北京農(nóng)業(yè)，2010，32（4）：47-49.

[7]晉昕，褚艷琴，晉小軍.堆肥中高效纖維素分解菌的分離與純化[J].中國沼氣，2011，29（6）：7-11.

作者簡介：張勝男（1996-）， 女， 黑龍江省大慶人， 研究方向： 環(huán)境科學(xué)； 馬軍（1981-）， 男， 黑龍江省哈爾濱人，博士， 助理研究員， 研究方向： 農(nóng)業(yè)環(huán)境分子生態(tài)學(xué)。