PKCε信號通路介導甘青鐵線蓮活性成分APG抗心肌缺血再灌注損傷的機制研究

馮穎達，馮建宇，楊 陽，狄守印，張 偉，陸云陽，湯海峰，朱艷榮

·基礎研究·

PKCε信號通路介導甘青鐵線蓮活性成分APG抗心肌缺血再灌注損傷的機制研究

馮穎達，馮建宇，楊 陽，狄守印，張 偉，陸云陽，湯海峰，朱艷榮

目的 研究不同濃度甘青鐵線蓮活性成分APG對H9C2大鼠心肌細胞缺血再灌注損傷的保護作用及其可能的機制。方法 體外培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細胞，經(jīng)2μM/L和4μM/L的APG預處理24 h后，建立缺氧復氧損傷模型(I/R)(缺氧45 min，復氧3 h)。采用CCK－8法檢測細胞活力，檢測細胞培養(yǎng)液乳酸脫氫酶(LDH)的釋放量、丙二醛(MDA)的釋放量和細胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的活力;采用Western Blot法檢測細胞內(nèi)蛋白激酶Cε(PKCε)、Caspase－3、Bax和Bcl－2表達情況，使用特異性PKCε抑制劑CHE觀察PKCε信號通路在此過程中的作用。結果 I/R處理可抑制H9C2細胞活性，細胞培養(yǎng)基中LDH、MDA含量升高，SOD活力降低(與Control組比較，P＜0.05)。抑制PKCε表達，上調(diào)Caspase－3表達，下調(diào)Bcl－2/ Bax比例(與Control組比較，P＜0.05)。2μM/L和4μM/L的APG預處理均可發(fā)揮細胞保護作用，降低LDH與MDA釋放量，提高SOD活力(與I/R組比較，P＜0.05)。此外，APG處理對抗了I/R損傷引起的PKCε表達下調(diào)，抑制Caspase－3表達，提高了Bcl－2/Bax比例(與I/R組比較，P＜0.05)。CHE處理后細胞活力下降，Caspase－3表達上調(diào)，Bcl－2/Bax比例下降，凋亡增加(與APG+I/R組比較，P＜0.05)。結論 甘青鐵線蓮中活性成分APG可減輕心肌缺血再灌注損傷，其機制可能是激活PKCε相關信號通路，最終抑制心肌細胞凋亡。

甘青鐵線蓮;心肌缺血再灌注損傷;蛋白激酶Cε;細胞凋亡

缺血性心臟病是威脅人類健康的一項重大疾病，心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是重要的損傷類型，其病理機制復雜，有很多信號通路和細胞因子參與其中［1－4］。心肌I/R損傷是指缺血期處于可逆損傷的心肌細胞，恢復血液供應后產(chǎn)生不可逆轉的損傷［5］。甘青鐵線蓮為藏藥材，其性辛、甘、溫，祛寒，增生胃火，活血通淤，破癖瘤積聚［6］，且其作為復方制劑益心康泰膠囊的主藥在臨床應用中療效顯著。本課題組前期從甘青鐵線蓮中分離并鑒定出一種主要活性成分:芹菜素－7－O－β－D－(－6＇－p－香豆?；?－吡喃葡萄糖(簡稱APG)，經(jīng)過藥理活性篩選，發(fā)現(xiàn)APG可減輕腦I/R損傷，且未見毒副作用(相關結果已申請國家發(fā)明專利，專利號:ZL201210425548.1)［7］，而APG是否能發(fā)揮抗凋亡作用從而減輕心肌I/R損傷及其具體作用機制尚未見報道。本實驗采用體外培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細胞模擬I/R損傷，探討APG對心肌I/R損傷的保護作用及作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株 大鼠H9C2心肌細胞，購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物與試劑 APG單體由本課題組分離所得。乳酸鈉、4－羥乙基哌嗪乙磺酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫氧葡萄糖、連二亞硫酸鈉(Sigma公司)，胎牛血清(FBS)(Gibco公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Hyclone公司)，CCK－8試劑盒購(七海復泰公司)，乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)(南京建成生物工程研究所)。兔抗蛋白激酶Cε(PKCε)、兔抗Caspase－3、兔抗Bax抗體，兔抗Bcl－2(CST公司)，鼠抗β－actin抗體(Santa Cruz公司)。辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔、羊抗鼠(北京中杉金橋生物技術公司)。抗體公司說明該來源抗體可很好識別此種蛋白。

1.3 儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)，超凈工作臺(蘇州富泰潔凈系統(tǒng)有限公司)，恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)，倒置顯微鏡(Olympus公司)，臺式低速離心機(Sigma公司)，細胞培養(yǎng)瓶(Corning公司)，96孔細胞培養(yǎng)板(Costar公司)，酶標儀(Thermo公司)，Western Blot電泳、轉膜及發(fā)光成像儀(Bio－Rad公司)。

1.4 大鼠H9C2心肌細胞的培養(yǎng) 在CO2培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)，以含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。待細胞融合度達90%進行傳代，每隔兩天換液，取對數(shù)生長期細胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板進行后續(xù)實驗。

1.5 心肌細胞I/R模型的建立 I/R損傷通過缺血液模擬缺血環(huán)境，缺血液組成為MgCl21mM/L、KCl 16 mM/L、NaCl 134 mM/L、CaCl2·H2O 0.9 mM/L、NaS2O31.2 mM/L、HEPES 2 mM/L、脫氧葡萄糖5 mM/L、乳酸鈉10 mM/L。加入缺血液的細胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶置于持續(xù)通氣密閉容器(95%N2，5%CO2)中缺氧45 min，更換正常DMEM后在培養(yǎng)箱(95%O2，5%CO2)中復氧孵育3 h。

1.6 心肌細胞存活率檢測 將大鼠H9C2心肌細胞制成9×104/ml的細胞懸液接種于96孔板，在CO2培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)孵育24 h，吸棄原培養(yǎng)液，用不同濃度(1μM/L、2μM/L、4μM/L、8μM/ L、16μM/L、32μM/L)APG處理24 h，每組設10個復孔。結束后每孔加入10μl CCK－8試液，于CO2培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中孵育2 h，酶標儀450 nm波長下檢測光密度OD值。

1.7 實驗分組 首先實驗分為4組，分別為正常對照組(Control)、I/R組、APG預處理組(I/R損傷前分別加入終濃度為2μM/L、4μM/L APG預處理24 h)，觀察APG對I/R損傷后心肌細胞的保護作用;隨后在I/R處理前加入PKCε阻斷劑CHE阻斷PKCε預處理2 h，濃度為5μM/L(已證實在該濃度對細胞無明顯毒性作用)，分為I/R組、APG+I/R組、APG+CHE+I/R組、CHE+I/R組，觀察PKCε信號通路在心肌細胞保護效應中的作用。

1.8 CCK－8法檢測各組心肌細胞活力 將大鼠H9C2心肌細胞制成9×104/ml的細胞懸液接種于96孔板，在CO2培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)孵育24 h。實驗各組處理結束后每孔加入10μl CCK－8試液，于CO2培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中孵育2 h，酶標儀450 nm波長下檢測光密度OD值，每組設10個復孔。

1.9 生化指標檢測 各組處理結束后取細胞培養(yǎng)液和提取細胞蛋白分別按照檢測試劑盒說明書，檢測LDH、MDA含量及SOD活力，各重復5次。

2.0 Western Blot法檢測PKCε蛋白及凋亡指標變化 各組處理后的細胞置于冰上(每組4個樣本)，用PBS洗一遍，收集細胞，加細胞裂解液裂解 20 min(4℃條件下)后，離心20 min(12 000 r/min，4℃)，收集細胞裂解產(chǎn)物，BCA蛋白定量后根據(jù)蛋白濃度加入相應量的5×loading buffer，煮沸8 min。以每孔30μg蛋白上樣進行電泳(SDS－PAGE)并用轉膜儀將蛋白轉到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，根據(jù)所需蛋白分子量切膜，條帶用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h。分別孵育PKCε(1∶800)、Caspase－3(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)和Bcl－2(1∶1 000)，4℃過夜。用TBST洗滌5遍，每遍6 min，常溫下用辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)孵育2 h。用TBST洗滌5遍，每遍6 min，配制發(fā)光液，用Bio－Rad發(fā)光成像，用Image Lab軟件進行分析。

2.1 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)結果均以±標準差(珋x± s)表示，采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析(ANOVA)，若總體差異顯著，再以t檢驗分析相應兩組間的顯著性差別。P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結果

2.1 不同濃度APG對心肌細胞增殖的影響 如圖1所示，當藥物濃度達到4μM/L時，細胞成活率最高，但隨著藥物濃度升高，細胞成活率逐漸降低，故后續(xù)實驗設定APG高低濃度分別為4μM/L和2μM/L。

2.2 APG預處理對I/R損傷后各組心肌細胞活力的影響 如圖2和圖3所示，實驗1中I/R處理顯著降低了H 9C2細胞活力(與Control組比較，P＜0.05)。APG預處理24 h顯著提高了細胞活力(與I/R組比較，P＜0.05)，其中4μM/L的APG保護效果更明顯(與APG 2μM/L+I/R組比較，P＜0.05)。在倒置顯微鏡下觀察，I/R損傷后H9C2細胞形態(tài)變圓皺縮，體積縮小，可見大量死細胞。APG預處理的細胞死亡減少，細胞形態(tài)顯著改善。

圖1 不同濃度APG對心肌細胞增殖的影響

圖2 APG對I/R損傷后H9C2細胞活力的影響

圖3 APG對I/R損傷后H9C2心肌細胞形態(tài)的影響(倒置顯微鏡，200倍)

2.3 APG預處理對I/R損傷后H9C2心肌細胞的影響 如圖4所示，實驗1中I/R損傷后的H9C2細胞乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)釋放量明顯升高，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力顯著降低(P＜0.05)。APG預處理24 h后，劑量依賴性降低LDH和MDA的釋放，提高和SOD活力(P＜0.05)。

圖4 APG對I/R損傷后各組心肌細胞LDH、MDA含量和SOD活力變化

2.4 APG預處理對I/R損傷后PKCε及凋亡相關蛋白表達的影響 實驗1Western Blot結果顯示(見圖5)，與Control組相比，I/R處理降低PKCε表達水平(P＜0.05)，明顯上調(diào)Caspase－3表達水平(P＜0.05)、下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl－2表達，上調(diào)凋亡蛋白Bax表達(P＜0.05);與I/R組相比，2μM/L和4 μM/L的APG處理對抗了I/R損傷引起PKCε表達下調(diào)(P＜0.05)，降低了Caspase－3表達(P＜0.05)，上調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl－2表達，下調(diào)凋亡蛋白Bax表達(P＜0.05)。且4μM/L APG保護效果更為明顯(P＜0.05)。

圖5 APG對I/R損傷后H9C2細胞PKCε、Bax、Bcl－2和Caspase－3蛋白表達影響

2.5 APG和CHE共處理對I/R損傷后各組心肌細胞活力的影響 前期結果顯示4μM/L的APG具有較好的保護效果。如圖6所示，實驗2中給予PKC抑制劑CHE后檢測細胞活力發(fā)現(xiàn)，與APG+ I/R相比，APG+CHE+I/R組細胞活力顯著降低(P＜0.05)。與I/R組相比，CHE+I/R對細胞活力沒有影響(P＞0.05)。

圖6 APG和CHE共處理對I/R損傷后H9C2細胞活力的影響

2.6 APG和CHE共處理對I/R損傷后PKCε及凋亡相關蛋白表達的影響 實驗2 Western Blot結果顯示(見圖7)，與I/R組相比，APG+I/R處理劑量依賴性對抗了I/R損傷引起的PKCε表達下調(diào)(P＜0.05)，導致了Caspase－3表達下降(P＜0.05)，抗凋亡蛋白Bcl－2表達增加，凋亡蛋白Bax表達下降(P＜0.05);與APG+I/R組相比，APG+CHE+ I/R組PKCε表達顯著降低(P＜0.05)，Caspase－3表達增加(P＜0.05)，抗凋亡蛋白Bcl－2表達下降，凋亡蛋白Bax表達增加(P＜0.05)。與I/R組相比，CHE+I/R組蛋白表達未顯著變化(P＞0.05)。

圖7 APG和CHE共處理對I/R損傷后H9C2細胞PKCε、Bax、Bcl－2和Caspase－3蛋白表達影響

3 討論

甘青鐵線蓮作為復方制劑益心康泰膠囊的主藥，具有養(yǎng)陰補血、化瘀通脈、清腑降濁的功效，而且該藏藥組方治療心肌缺血再灌注損傷原理與中醫(yī)治療思想一致。APG為芹菜素與對香豆酸經(jīng)葡萄糖苷相連的結構，其中芹菜素具有抗氧化、抗凋亡、抗炎及擴張血管調(diào)節(jié)血脂的作用［8－9］。Delazar等采用1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)分析其抗氧化活性，結果表明APG具有優(yōu)良的抗氧化效果，抗氧化值幾乎與槲皮素相當［10］。本實驗在H9C2心肌細胞缺血再灌注模型上探討了APG的心肌保護作用，發(fā)現(xiàn)了有類似的保護效果。結果顯示缺血再灌注處理的H9C2細胞凋亡明顯增加，而APG可抑制凋亡。

缺血再灌注損傷的機制目前尚未徹底闡明，一般認為，能量代謝障礙、自由基生成增多、細胞內(nèi)鈣超載等因素是其主要機制［11］。為了探討APG的抗心肌I/R損傷保護作用是否依賴于其對PKCε蛋白表達的上調(diào)，筆者采用特異性PKCε抑制劑CHE，在不影響基礎水平PKCε生理功能的濃度下，比較APG預處理組和APG加CHE組心肌細胞在I/R損傷后細胞活力、PKCε及凋亡相關蛋白表達的變化。結果顯示4μM/L的APG預處理24 h能有效減輕I/R對心肌細胞的損害，提高細胞存活率，上調(diào)Bcl－2/Bax比例且伴有PKCε表達的上調(diào)，該保護作用具有劑量依賴性。本研究亦證實，在經(jīng)I/R損傷的心肌細胞，APG預處理所產(chǎn)生的抗凋亡效應可被PKCε抑制劑CHE明顯削弱。

蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是一組具有單一肽鏈結構而又廣泛分布的絲氨酸－蘇氨酸激酶，在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，且是心肌缺血再灌注損傷中多種信號傳遞中的信號分子之一。PKC可轉位到胞核內(nèi)或者啟動細胞核內(nèi)的信號轉導，從而發(fā)揮心肌保護作用，但并非所有亞型均有作用，目前僅發(fā)現(xiàn)PKCε、δ、α、β和η(PKCε尤為突出)有心肌保護作用［12－13］。研究表明，PKCε在心肌缺血預處理、運動預處理、及多種藥物預處理抗MI/R損傷過程中發(fā)揮重要作用，缺血再灌注損傷后可引發(fā)線粒體氧化應激損傷［14－18］。有研究報道 PKCε可作為mKATP通道的上游激活分子，在缺血預處理的信號轉導中，PKCε激活后引起線粒體mKATP通道的開放，從而維持保護線粒體，發(fā)揮心肌保護作用［19］。

綜上所述，本實驗證實了APG預處理可以對抗I/R損傷引起的心肌細胞PKCε表達的下調(diào)，但仍需進一步探討PKCε發(fā)揮心肌保護作用的相關分子及上下游關系。APG的心肌保護作用涉及PKCε信號通路，這為筆者深入研究APG作為心血管保護藥物的作用機制提供了新的思路。

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Com pound APG derived from Clematis tangutica amelioratesm yocardial ischem ia/reperfusion injury via activating PKCεand inhibiting apoptosis

Feng Ying－da，F(xiàn)eng Jian－yu，Yang Yang，Di Shou－yin，Zhang Wei，Lu Yun－yang，Tang Hai－feng，
Zhu Yan－rong
Institute of Materia Medica，School of Pharmacy，F(xiàn)ourth Military Medical University，Shaan＇xi Xi＇an 710032，China Corresponding author:Tang Hai－feng，E－mail:tanghaifeng71@163.com Zhu Yan－rong，E－mail:zyr19830812@163.com

Ob jective To investigate the protective effects of APG on myocardial ischemia/reperfusion(I/R)injury(IRI) and its possiblemechanism.M ethods The cultured H9C2 cells were treated with APG for 24 h，and subjected to IRI(I 45min，R 3 h).After the 3 h reperfusion，cell viability，serum LDH and serum MDA，cell SOD activity，apoptotic index，PKCεexpression，Caspase－3 expression，Bax expression and Bcl－2 expression were detected，then the specific inhibitor of PKCεCHEwas applied to evaluate the roles of PKCεin this process.Results I/R treatment reduced cell viability significantly，decreased SOD activity and the Bcl－2/Bax ratio，down－regulated PKCεexpression，up－regulated LDH levels，MDA levels and Caspase－3 expression(vs the control group，P＜0.05).Moreover，APG treatment(both 2μM/L and 4μM/L)increased the cell viability，SOD activity and the Bcl－2/Bax ratio，down－regulated LDH levels，MDA levels and Caspase－3 expression，up－regulated PKCεexpression in a dose dependentmanner (vs the I/R group，P＜0.05).In addition，compared with the APG+IR group，CHE treatment reduced the cell viability，up－regulated Caspase－3 expression，decreased the Bcl－2/Bax ratio(vs the APG+I/R group，P＜0.05).Conclusion APG treatment ameliorates I/R injury via activating PKCεpathway and inhibiting apoptosis.

Clematis tangutica;Myocardial ischemia/reperfusion injury;PKCε;Apoptosis

2016-09-23)

2016-10-24)

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.01.11

國家自然科學基金(81403182，81503285，81570231)

710032西安，第四軍醫(yī)大學藥物研究所(馮穎達、陸云陽、湯海峰);710032西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心血管外科(馮建宇)，藥劑科(朱艷榮、張 偉);710032西安，第四軍醫(yī)大學生物醫(yī)學工程系(楊 陽);710032西安，第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院胸外科(狄守印)

湯海峰，E－mail:tanghaifeng71@163.com;朱艷榮，E－mail:zyr19830812@163.com