微乳液相色譜法同時(shí)分離7種水溶性維生素

吳宏星, 鄭艾妮, 蘇草茵, 余諾君, 李 寧

(廣東藥科大學(xué), 廣東 廣州 510006)

研究論文

微乳液相色譜法同時(shí)分離7種水溶性維生素

吳宏星, 鄭艾妮, 蘇草茵, 余諾君, 李 寧*

(廣東藥科大學(xué), 廣東 廣州 510006)

采用微乳液相色譜法同時(shí)分離7種水溶性維生素(VB1、VB2、VB6、VB12、葉酸、煙酰胺和VC)?？疾炝宋⑷榱鲃?dòng)相體系中表面活性劑、油相、助表面活性劑的種類以及流動(dòng)相的pH值、柱溫等對(duì)水溶性維生素分離的影響。優(yōu)化后微乳體系的組成為:十二烷基硫酸鈉(SDS)/聚氧乙烯月桂醇醚(Brij35)/正丁醇/乙酸乙酯/水(質(zhì)量比為2∶60∶66∶8∶864)。色譜柱為Agilent TC C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm),柱溫為30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,流速為0.5 mL/min。7種水溶性維生素在20 min內(nèi)達(dá)到基線分離。在4～36 mg/L范圍內(nèi),7種水溶性維生素的質(zhì)量濃度與峰面積的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 1。不同添加水平下,VB1、VB2、VB6、VC和煙酰胺的平均回收率為93.9%～102.9%。該方法可用于食品和藥品中的多種水溶性維生素的分離、鑒別及快速測(cè)定。

微乳液相色譜法;水溶性維生素;分離選擇性

維生素是維持人體正常物質(zhì)代謝和某些特殊生理功能不可缺少的低分子有機(jī)化合物,且人體不能合成或合成量很少,必須從食物或其他途徑獲取。根據(jù)其溶解性差異,維生素分為水溶性維生素和脂溶性維生素兩大類[1]。水溶性維生素主要包括B族維生素和VC(抗壞血酸)。B族維生素是多種輔酶的組成部分,參與有機(jī)體中的糖、脂肪、蛋白質(zhì)及核苷酸的合成代謝,常見(jiàn)的有VB1、VB2、VB6、VB12、葉酸和煙酰胺;VC作為強(qiáng)氧化劑參與氨基酸羥化反應(yīng)和去除自由基等過(guò)程[2]。

近年來(lái),已有許多關(guān)于水溶性維生素檢測(cè)分析的報(bào)道,主要包括微生物法[3]、分光光度法[4]、熒光法[5]、毛細(xì)管電泳法[6]、HPLC法[7]等。傳統(tǒng)的HPLC法流動(dòng)相需要使用大量的有機(jī)溶劑,耗費(fèi)較高,對(duì)環(huán)境污染大;采用梯度洗脫的方法對(duì)多種組分進(jìn)行分離,程序繁多復(fù)雜,耗時(shí)較長(zhǎng)。微乳液相色譜是在膠束液相色譜(MLC)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種液相色譜新技術(shù)[8],它以獨(dú)特的分離選擇性和廣泛的適用性引起了人們極大的關(guān)注。應(yīng)用較多的是水包油型反相微乳液相色譜法(MELC),其分離機(jī)制是溶質(zhì)在固定相、偽固定相(表面活性劑在固定相上的吸附層)、多相分散相(微乳液滴)和水相進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附-解吸過(guò)程。由于分離過(guò)程復(fù)雜,可控參數(shù)較多,具有不同極性的組分能在等度洗脫下于短時(shí)間內(nèi)達(dá)到有效分離。MELC主要應(yīng)用在中藥[9]、藥物制劑[10-13]以及生物樣品[14]的分析中。目前,MELC在水溶性維生素中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用微乳液相色譜法,通過(guò)對(duì)微乳溶液影響因素的優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了7種水溶性維生素的快速分離。此方法的研究為分析檢測(cè)食品和藥品中的多種水溶性維生素提供了很好的參考價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀:包括LC-15C泵、SPD-M20A檢測(cè)器、LC solution工作站、SIL-10AF自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10ASVP柱溫箱(日本島津有限公司); SB52000超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司); SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義予華儀器責(zé)任有限公司); FB-10T溶劑過(guò)濾瓶(天津奧特賽恩斯儀器有限公司); TD4臺(tái)式離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)。

VB1(純度100%)、VB2(純度98.7%)、VB6(純度100%)、VB12(純度95.7%)、葉酸(純度89.7%)、煙酰胺(純度98.5%)和VC(純度99.9%)(中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇(色譜純,Dikma公司);十二烷基硫酸鈉(SDS,分析純,美國(guó)Sigma公司);聚氧乙烯月桂醇醚(Brij35,純度99.9%,美國(guó)Amresco公司);善存佳維片(美國(guó)惠氏制藥有限公司);蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱為Agilent TC C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:SDS/Brij35/正丁醇/乙酸乙酯/水(質(zhì)量比為2∶60∶66∶8∶864);檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。

1.3 溶液的制備

1.3.1 微乳流動(dòng)相的制備

按順序添加表面活性劑(SDS、Brij35)、油相(乙酸乙酯)、助表面活性劑(正丁醇)及水(質(zhì)量比為2∶60∶66∶8∶864),混合,超聲30 min,形成透明穩(wěn)定的微乳液,經(jīng)0.45 μm微孔有機(jī)相濾膜過(guò)濾,靜置過(guò)夜,即得微乳流動(dòng)相。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取真空干燥至恒重的VB1、VB2、VB6、VB12、葉酸、煙酰胺和VC對(duì)照品各2 mg,加適量水溶解,定容至10 mL,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.3.3 供試品溶液的制備

精密稱取善存佳維片粉末約3.8 g(相當(dāng)于2 mg VB1、2 mg VB2、2 mg VB6、0.004 mg VB12、24 mg煙酰胺、0.003 mg葉酸和176.3 mg VC)。用微乳流動(dòng)相溶解,定容至10 mL,超聲20 min,在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min,取上清液,作為供試品儲(chǔ)備液。

圖 1 微乳液中不同表面活性劑及離子對(duì)濃度對(duì)7種水溶性 維生素分離的影響Fig. 1 Effects of different surfactants and ion pair concentrations on the separation of the seven water-soluble vitamins B: Brij35 (polyoxyethylene lauryl ether); S: SDS (sodium dodecyl sulfate).

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 不同表面活性劑以及離子對(duì)濃度對(duì)分離的影響

初始流動(dòng)相為Brij35/正丁醇/正辛醇/水(質(zhì)量比為60∶66∶8∶866),用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素考察和條件優(yōu)化。如圖1所示,分別采用Brij35、SDS和Brij35-SDS作為表面活性劑,考察其對(duì)7種水溶性維生素的分離效果。采用Brij35作為表面活性劑時(shí),葉酸出峰時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng),其余組分分離較差。當(dāng)用SDS作為表面活性劑時(shí),VB1出峰時(shí)間大于30 min,這是由于VB1噻唑環(huán)上的季銨基團(tuán)和嘧啶環(huán)上的氨基與部分陰離子表面活性劑SDS形成離子對(duì)。用Brij35-SDS作為表面活性劑時(shí),7種水溶性維生素的分離度有所提高。配制SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～0.3%的微乳流動(dòng)相,考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)SDS對(duì)分離選擇性的影響。結(jié)果表明隨著SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,VB1與VB6的保留時(shí)間有所增加,其余組分的保留時(shí)間變化不大,SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí),能實(shí)現(xiàn)較好的分離,并且峰形較好,分析時(shí)間也比SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)短,故選擇含6.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Brij35和0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的SDS作為表面活性劑。

圖 2 微乳液中不同油相對(duì)7種水溶性維生素分離的影響Fig. 2 Effects of different oil phases in microemulsion on the separation of the seven water-soluble vitamins

2.1.2 不同油相對(duì)分離的影響

在MELC中,油相的加入可以增加流動(dòng)相中有機(jī)相的比例,使保留時(shí)間縮短;另一方面,油相分子也可以部分分配到固定相上,使固定相的極性變小,化合物保留和選擇性的變化更復(fù)雜。Marsh等[15]的研究表明,油相在水包油型微乳中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為0～1.2%。當(dāng)油相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于1%時(shí),微乳系統(tǒng)不穩(wěn)定,色譜重現(xiàn)性較差;微乳中油相的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.8%。固定微乳其他組分不變,分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的正庚烷、環(huán)己烷、正辛醇、正辛烷和乙酸乙酯作為油相,考察其對(duì)分離選擇性的影響。結(jié)果如圖2所示,不同油相洗脫能力的大小順序?yàn)?正辛醇>正辛烷>正庚烷>環(huán)己烷>乙酸乙酯。這可能是由于水溶性維生素與正辛醇的結(jié)合能力更強(qiáng),在固定相上的保留減弱。分別用正庚烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯作為油相時(shí),7種水溶性維生素能實(shí)現(xiàn)較好的分離。以乙酸乙酯為油相時(shí),峰形可以得到明顯改善,這可能是由于乙酸乙酯在一定程度上阻礙了堿性基團(tuán)與硅醇基之間的靜電作用,消除拖尾,故選擇乙酸乙酯作為油相。

2.1.3 不同助表面活性劑對(duì)分離的影響

助表面活性劑一般為短鏈醇,常用的有異丙醇、正丁醇和戊醇等。本試驗(yàn)考察了異丙醇、正丁醇和異丙醇-正丁醇混合助表面活性劑對(duì)水溶性維生素分離的影響。結(jié)果表明,以異丙醇作為助表面活性劑時(shí),VB1保留時(shí)間接近40 min;以異丙醇-正丁醇作為助表面活性劑時(shí),VB2與VC不能達(dá)到基線分離,并且VB1保留時(shí)間較長(zhǎng);以正丁醇作為助表面活性劑時(shí),各組分分離較好。故選擇正丁醇作為助表面活性劑。

圖 3 微乳液中不同pH值對(duì)7種水溶性維生素分離的影響Fig. 3 Effects of different pH values of microemulsion on the separation of the seven water-soluble vitamins

2.1.4 不同pH值對(duì)分離的影響

在RP-HPLC中,物質(zhì)在固定相中的保留與其疏水性有關(guān)。如果物質(zhì)發(fā)生了解離,疏水性減弱,該物質(zhì)在固定相的保留減弱。本試驗(yàn)考察了不同pH微乳體系(pH 2.5～4.5)對(duì)水溶性維生素分離的影響。由圖3可知,隨著微乳體系pH值的增加,葉酸與VC的保留時(shí)間減小,這是由于葉酸和Vc解離成離子狀態(tài),極性增大,其在固定相上的保留減弱。VB1與VB6的保留時(shí)間呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),這可能由于流動(dòng)相pH值在2.5～4.0之間時(shí)抑制了VB1與VB6的電離,使其主要以分子形式存在,因此疏水性增加,保留時(shí)間也隨之增加;當(dāng)pH值達(dá)到4.0后,固定相上產(chǎn)生的負(fù)電荷(吸附的SDS)吸附VB1與VB6中帶正電的堿性基團(tuán),這在一定程度上促進(jìn)了其電離,更多地以離子形式存在,因此保留時(shí)間減小。減少其余組分的保留時(shí)間基本不受pH值的影響。當(dāng)pH=3.5時(shí),相比于其他pH值,各組分之間基本能達(dá)到基線分離。因此選擇微乳流動(dòng)相pH值為3.5。

2.1.5 不同柱溫對(duì)分離的影響

采用SDS-Brij35-正丁醇-乙酸乙酯-水微乳流動(dòng)相,分別在25、30、35和40 ℃的條件下考察柱溫對(duì)水溶性維生素分離的影響。由圖4可知,隨著柱溫的升高,VB1保留時(shí)間的減少較為明顯,其余組分的保留時(shí)間變化不大。這可能是由于在微乳液相色譜中存在兩種對(duì)立的機(jī)制,一方面堿性藥物的解離常數(shù)pKa會(huì)隨著溫度升高而減小,使堿性藥物更多以未解離狀態(tài)存在,因此在固定相上的保留增強(qiáng);另一方面,堿性藥物會(huì)隨著溫度的升高增加其在油滴中的分配,流動(dòng)相洗脫能力變強(qiáng),因而保留時(shí)間減小[12]。本試驗(yàn)中,VB1保留時(shí)間的減小受第二種機(jī)制的影響更多。在不同溫度下,各組分都能實(shí)現(xiàn)較好的分離。當(dāng)柱溫為30 ℃時(shí),7種水溶性維生素的拖尾因子均小于1.5,各組分的峰形相對(duì)較好,故選擇柱溫為30 ℃。

表 1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果以及各水溶性維生素的最大紫外吸收波長(zhǎng)(n=6)

-: not detected.

圖 4 不同柱溫對(duì)7種水溶性維生素分離的影響Fig. 4 Effects of different column temperatures on the separation of the seven water-soluble vitamins

通過(guò)考察微乳各組分類型,pH以及溫度等因素對(duì)水溶性維生素分離的影響,得出了能夠同時(shí)分離7種水溶性維生素的微乳流動(dòng)相,其組成為SDS/Brij35/正丁醇/乙酸乙酯/水(質(zhì)量比為2∶60∶66∶8∶864),流動(dòng)相pH為3.5,柱溫為30 ℃。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 系統(tǒng)適用性

精密量取各水溶性維生素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 mL,置于10 mL容量瓶中,加水至刻度,混勻,得0.02 g/L混合維生素溶液。按1.2節(jié)中方法檢測(cè),重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5,各色譜峰理論塔板數(shù)均大于2 000,拖尾因子小于1.5,重復(fù)進(jìn)樣6次,峰面積的RSD均小于2.0%,說(shuō)明系統(tǒng)適用性良好。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果以及各水溶性維生素的最大紫外吸收波長(zhǎng)見(jiàn)表1。

2.2.2 線性方程、檢出限、定量限及精密度

精密量取各水溶性維生素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量,用微乳流動(dòng)相稀釋成系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.2節(jié)中條件進(jìn)樣,記錄色譜圖,以峰面積y對(duì)質(zhì)量濃度x(單位g/L)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示各水溶性維生素的峰面積與質(zhì)量濃度在4～36 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按1.3.3節(jié)中的方法平行制備6份樣品溶液,按1.2節(jié)中的條件進(jìn)行分析,各水溶性維生素含量的RSD均小于2.0%,表明該方法的精密度良好。按照信噪比為10時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限(LOQ),信噪比為3時(shí)的質(zhì)量濃度為檢出限(LOD),結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取1 mL供試品儲(chǔ)備液,用流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度為0.02 g/L的溶液,分別在配制后0、2、4、6、8、16和24 h測(cè)定VB2、VB6、VB1、VC和煙酰胺的峰面積。結(jié)果顯示,VB2、VB6、VB1、VC和煙酰胺在24h時(shí)的峰面積與0 h時(shí)相比,RSD均小于2.0%,表明善存佳維片樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表 2 各水溶性維生素的線性方程、檢出限、定量限、相關(guān)系數(shù)(r2)和精密度(n=6)

y: peak area;x: mass concentration, g/L. -: not detected.

2.2.4 加標(biāo)回收率

精密量取0.5 mL 0.2 g/L供試品儲(chǔ)備液,置于10 mL容量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為本底溶液。另量取0.3、0.5、0.7 mL的0.2 g/L對(duì)照品儲(chǔ)備液(分別相當(dāng)于含量測(cè)定的80%、100%和120%)各3份,置于10 mL容量瓶中,分別準(zhǔn)確加入0.5 mL 0.2 g/L供試品儲(chǔ)備液,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,制成質(zhì)量濃度分別為16、20和24 mg/L的加標(biāo)回收樣品。按1.2節(jié)條件檢測(cè),記錄色譜圖,結(jié)果見(jiàn)表3。5種水溶性維生素回收率為93.9%～102.9%,表明它們?cè)谄瑒┲械幕厥章柿己谩?/p>

表 3 各水溶性維生素的加標(biāo)回收率(n=3)

2.2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

按1.3.3節(jié)方法平行配制3份供試品溶液,分別進(jìn)樣測(cè)定,按外標(biāo)法計(jì)算善存佳維片中VB1、VB2、VB6、VC和煙酰胺占標(biāo)示量的百分比,分別為92.3%、90.8%、90.2%、98.6%和95.1%。樣品中VB12的濃度低于檢出限,無(wú)法檢出。圖5為善存佳維片樣品及7種水溶性維生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖。

圖 5 (a)7種水溶性維生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和(b)善存佳維片的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of (a) the mixture of the seven water-soluble vitamins standards and (b) Centrum Tablets sample

3 結(jié)論

本研究通過(guò)考察微乳流動(dòng)相體系中表面活性劑的種類、油相的種類、助表面活性劑的種類、流動(dòng)相的pH值和柱溫等對(duì)7種水溶性維生素分離的影響,確定了微乳流動(dòng)相的組成。應(yīng)用優(yōu)化后的色譜條件,7種水溶性維生素能在20 min達(dá)到基線分離。該法可用于食品和藥品中多種水溶性維生素的分離鑒別及快速測(cè)定。由于MELC的理論研究及藥物分析方面的應(yīng)用較少,有待于在今后的工作中做進(jìn)一步研究。

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Simultaneous separation of seven water-soluble vitamins with microemulsion liquid chromatography

WU Hongxing, ZHENG Aini, SU Caoyin, YU Nuojun, LI Ning*

(GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

A novel method was developed for the separation of seven water-soluble vitamins (VB1, VB2, VB6, VB12, VC, folic acid and nicotinamide) with microemulsion liquid chromatography. The impacts of following factors on the separation selectivity were investigated: the type of surfactant, the type of oil phase, the type of co-surfactant, the pH of mobile phase and the column temperature. The optimal conditions for the separation of the seven water-soluble vitamins were as follows: Agilent TC C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used at 30 ℃; the microemulsion mobile phase was sodium dodecyl sulfate (SDS)/polyoxyethylene lauryl ether (Brij35)/n-butanol/ethyl acetate/water (2∶60∶66∶80∶864, mass ratio). Baseline separation of the seven water-soluble vitamins was achieved within 20 min with a flow rate of 0.5 mL/min and the detection wavelength of 254 nm. The calibration curve showed a good linearity with the correlation coefficients above 0.999 1 in the linear range from 4 to 36 mg/L. The mean recoveries of VB1, VB2, VB6, VCand nicotinamide were 93.9%-102.9% at different spiked levels. The optimized and validated method can be used for simultaneous determination of water-soluble vitamins in food and pharmaceuticals.

microemulsion liquid chromatography (MELC); water-soluble vitamins; separation selectivity

10.3724/SP.J.1123.2016.09037

2016-09-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173525).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 81173525).

O658

A

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