高效液相色譜法構(gòu)建定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系預測中藥肝腎毒性組分的正辛醇-水分配系數(shù)值

項洋洋, 俞慧敏, 鄧海山, 陳靜雅, 張愛華, 池玉梅, 韓疏影

(南京中醫(yī)藥大學, 江蘇 南京 210046)

研究論文

高效液相色譜法構(gòu)建定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系預測中藥肝腎毒性組分的正辛醇-水分配系數(shù)值

項洋洋, 俞慧敏, 鄧海山, 陳靜雅, 張愛華, 池玉梅*, 韓疏影*

(南京中醫(yī)藥大學, 江蘇 南京 210046)

反相高效液相色譜;搖瓶法;定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系;正辛醇-水分配系數(shù);馬兜鈴酸;白黎蘆醇

近年來,服用中藥引起的毒副作用,尤其是其對肝腎的毒性引起了廣泛關(guān)注[1-4]。目前,研究中藥中潛在肝腎毒性組分的方法主要有特異性標志物法、組學(包括基因組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學)技術(shù)、體外試驗法等[5-8]。特異性標志物法可在早期發(fā)現(xiàn)藥物引起的毒性,但缺乏靈敏性、特異性,且需要大量的生物樣品[5,9]。組學技術(shù)系統(tǒng)闡述了藥物的作用機制,但目前分析手段有限,無法對所有代謝產(chǎn)物進行分析,且其數(shù)據(jù)庫不完善,缺乏代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)的標準值[10-13]。體外試驗能控制環(huán)境因素,排除相互作用的系統(tǒng)影響,且具有簡便、快捷、經(jīng)濟、可直接利用人細胞等優(yōu)點,但體外試驗無法系統(tǒng)模擬體內(nèi)過程,難以預測物質(zhì)的慢性毒性[14-16]。無論特異性標志物法、組學技術(shù)或體外試驗,在確定新化合物毒性時均需借助各種分析技術(shù)[17,18],如核磁共振(NMR)、HPLC、超高效液相色譜(UPLC)與質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜(GC)與質(zhì)譜聯(lián)用等,時間和經(jīng)濟成本較高。定量-構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型是一種借助分子的理化性質(zhì)或結(jié)構(gòu)參數(shù),以數(shù)學和統(tǒng)計學手段定量研究有機小分子和生物大分子之間相互作用,以及有機小分子在生物體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄及毒性(ADMET)等生理相關(guān)性質(zhì)的方法,廣泛用于西藥的合成與設(shè)計中,以評價新藥物的毒性[19-21]。但是,QSAR甚少用于中藥組分的肝腎毒性篩選與評價,目前只有一篇利用QSAR模型篩選中藥中肝毒性活性組分的報道[22]。

正辛醇-水分配系數(shù)(Kow)作為QSAR模型中常用的重要參數(shù),表征了藥物在體內(nèi)的ADMET過程,因此Kow數(shù)據(jù)的準確測定對于藥物毒性的準確評價至關(guān)重要。由于中藥材組分復雜,難以分離提取,因此Kow測定的經(jīng)典方法,如搖瓶法(SFM)[23,24]和慢攪法(SSM)[25,26]難以實現(xiàn)對中藥材中各組分Kow的準確快速測定,相關(guān)Kow數(shù)據(jù)稀缺,目前只見搖瓶法測得紅景天中紅景天苷和酪醇[27]以及九節(jié)龍全草提取物九節(jié)龍皂苷-Ⅰ的Kow值的報道[28]。Kow還可通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)、薄層色譜(TLC)以及逆流色譜(CCC)等間接測定[29-34]。其中,RP-HPLC法應(yīng)用最廣泛。該法通過選取一組與待測化合物結(jié)構(gòu)相似并有準確可靠Kow數(shù)據(jù)的模型化合物,測定其保留因子(k),建立k與Kow之間的定量關(guān)系——定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系(QSRR)模型[35,36];利用此模型,根據(jù)保留時間即可簡單快速得到待測化合物的Kow值。目前,僅有以RP-HPLC法測定水解丹寧、丹參酮單體組分Kow的報道[37],尚未有對中藥材中各復雜組分Kow測定的報道。

本文采用RP-HPLC法,以中性和酸性苯系物為模型化合物構(gòu)建QSRR模型,快速準確地測定了中藥材中的腎毒性組分馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸內(nèi)酰胺及白藜蘆醇的Kow值。通過此模型,可由保留時間同時快速得到中藥材中多種目標組分的Kow值,解決了目標組分難以分離、無法獲得Kow值的問題,并為通過QSAR模型實現(xiàn)快速預測中藥組分的肝腎毒性提供了可靠的Kow數(shù)據(jù)支撐。

表 1 16種模型化合物的搖瓶法或慢攪法正辛醇-水分配系數(shù)(Kow)及解離常數(shù)(pKa)值

* Experimental logKowand pKavalues of model compounds were from ACD/Lab Database; # neutral compounds with no pKavalues.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Fisher U3000型高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司),配有DGP-3600RS雙三元泵、WPS-3000TRS自動進樣器、TCC-3000柱溫箱、DAD-3000RSDAD檢測器和Chromeleon 7.10工作站(美國Dionex公司); Sepax GP-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm,蘇州賽分科技有限公司); ACD/Labs Pro V10.0軟件(加拿大ACD公司)用于計算化合物的疏水常數(shù)。

表1為實驗所用的16種模型化合物(純度均大于95.0%),均購自上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司,用甲醇配制各物質(zhì)的儲備液(1 g/L),儲存于4 ℃冰箱中待用。甲醇(色譜純)購自德國Merck公司;高氯酸(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司;硫脲(分析純)購自海凌峰化學試劑有限公司;實驗用水為超純水(由Milli-Q系統(tǒng)制得,美國Millipore公司)。

1.2 色譜條件

色譜柱:Sepax GP-C18柱;流動相:甲醇-水(分別用高氯酸調(diào)節(jié)pH為2.80、3.20、3.60和4.00);流速:0.3 mL/min,進樣量:10 μL,檢測波長:250 nm,柱溫:30 ℃。

1.3 實驗方法

1.3.1 化合物100%水相保留因子kw的測定

在每一個水相pH(2.80、3.20、3.60和4.00)下,根據(jù)化合物各自疏水性的不同,選擇甲醇/水體積比在0.40～0.95之間的4個比例進行等度洗脫。在每個流動相比例下,測定各化合物的保留時間tR及死時間t0(t0由硫脲的甲醇溶液測得),以兩點校正法(DP-RTC)對tR及t0進行校正[38,39],由校正過的保留時間計算各化合物在不同流動相比例下的保留因子(k=(tR-t0)/t0)。根據(jù)Snyder-Soczewinski方程[40]得到化合物外推至100%水相的保留因子kw。實驗中所有化合物的tR均為至少兩次獨立進樣得到的平均值。

表 2 不同pH值下log Kow″-log kw QSRR線性擬合方程

F: Fister, the value of test statistic.y: logKow″;x: logkw.

1.3.2 化合物Kow的實驗測定

采用SFM測定馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸內(nèi)酰胺及白藜蘆醇的實驗Kow值。將上述4種化合物分別溶于水飽和的正辛醇中作為供試品溶液。以體積比1∶1、1∶2及2∶1將水飽和的正辛醇供試品溶液與正辛醇飽和的水溶液兩相混合。在每個體積比下,平行處理3份樣品,置于恒溫振蕩器上振搖24 h,靜置1 h,以3 000 r/min的速度離心10 min,各取適量兩相溶液,按1.2節(jié)條件進行測定,記錄峰面積。將馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸內(nèi)酰胺及白藜蘆醇分別用水飽和的正辛醇配制成7個不同濃度的標準溶液,進樣分析并繪制濃度與峰面積的標準曲線。采用標準曲線法分別測定兩相中各溶質(zhì)的濃度[23]。按正辛醇-水分配系數(shù)計算公式Kow=co/cw(co表示化合物在正辛醇相的濃度,cw表示化合物在水相的濃度)求得各化合物的Kow。

圖 1 16種模型化合物的表觀正辛醇-水分配系數(shù)對數(shù)值-100%水相保留因子對數(shù)值(log Kow″-log kw) 定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系(QSRR)模型(pH=2.80)Fig. 1 Quantitative structure-retention relationship (QSRR) model of logarithm values of the apparent n-octanol-water partition coefficient-logarithm values of the retention factor of 100% aqueous phase (log Kow″-log kw) (pH=2.80) of 16 model compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 logKow″-logkwQSRR模型的建立

對于弱解離化合物,通常將Kow校正為表觀正辛醇-水分配系數(shù)Kow″,建立logKow″-logkwQSRR模型預測待測化合物的Kow″,再由Kow″值求得其Kow數(shù)據(jù)[38,39]。本試驗選擇了16種已知準確Kow實驗數(shù)據(jù)的中性及酸性化合物作為模型化合物組(見表1),建立了logKow″-logkwQSRR模型(見圖1)。不同流動相pH下的logKow″-logkw線性擬合方程如表2所示,這些QSRR模型的截距和斜率基本一致且線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)R2=0.980～0.987),說明在試驗pH范圍內(nèi),以Kow″對kw建立的QSRR模型基本不受流動相pH變化的影響。同時,試驗發(fā)現(xiàn)不同pH下擬合得到的QSRR模型的斜率均稍偏離1,可能是溶質(zhì)與固定相/流動相之間除了疏水作用以外的次級相互作用的結(jié)果,如氫鍵作用、溶質(zhì)的立體幾何結(jié)構(gòu)的影響等;此外,不同流動相pH下得到的QSRR模型的截距均為負值,反映了溶質(zhì)與反相C18柱固定相之間的結(jié)合力比與正辛醇之間的作用力更強[38]。

表 3 log Kow″-log kw QSRR模型的外部驗證

RE: relative errors; /: neutral compounds without pKavalues.

表 4 4種待測化合物log Kow預測值及其SFM實驗值、ACD/Lab計算值的比較

2.2 logKow″-logkwQSRR模型準確性的驗證

2.3 logKow″-logkwQSRR模型應(yīng)用于中藥中潛在腎毒性組分Kow值的預測

利用上述QSRR模型測定了中藥馬兜鈴提取物中馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸內(nèi)酰胺及虎杖中白藜蘆醇的Kow值。如表4所示,馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B及白黎蘆醇的QSRR預測值與SFM測定值的相對誤差很小(分別為0.3%、2.2%和0.7%);而馬兜鈴內(nèi)酰胺的QSRR預測值與SFM測定值的相對誤差稍大(13.2%)。這可能是由于馬兜鈴內(nèi)酰胺為弱堿性化合物,導致本試驗以中性和酸性化合物建立的QSRR模型對其Kow預測的準確性降低。

表4還列出了4種待測化合物的軟件計算Kow值?？梢钥闯?對于中藥中結(jié)構(gòu)復雜的物質(zhì),其軟件計算值與實驗測定值之間偏差較大。馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴內(nèi)酰胺及白藜蘆醇的軟件計算值與實驗測得值的相對誤差分別為15.4%、4.4%、14.7%及15.0%?？呻x解弱酸性化合物馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B和白藜蘆醇存在分子內(nèi)、分子間氫鍵作用等,軟件計算很難將這些因素全面考慮;另外,馬兜鈴內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)及官能團較復雜,導致軟件計算誤差也較大。

圖 2 (a)3種馬兜鈴酸類對照品及其在馬兜鈴藥材提取物中和(b)白黎蘆醇對照品及其在虎杖藥材提取物中的HPLC色譜圖Fig. 2 HPLC chromatograms of (a) three aristolochics in mixed references and in Aristolochia extracts and (b) resveratrol reference substance and Polygonum cuspidatum extracts Peaks: 1. aristolochic acid B; 2. aristolochic acid A; 3. aristololactam; 4. resveratrol.

本試驗以準確測定待測組分保留時間的方法快速獲得其Kow值,對待測組分的純度要求不高,無需對復雜的中藥材進行分離得到各待測組分的單體,只需對含待測組分的中藥材直接RP-HPLC進樣分析即可,這解決了中藥組分復雜難分離,無法通過經(jīng)典SFM法準確測定其組分Kow值的問題。如圖2所示,以含馬兜鈴酸類組分的馬兜鈴和含白黎蘆醇組分的虎杖藥材作為研究對象,對其中的馬兜鈴酸類組分和白黎蘆醇組分進行RP-HPLC分析,同時得到各待測組分的保留時間,以QSRR模型直接預測了馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸內(nèi)酰胺及白藜蘆醇的Kow值。此法為快速預測中藥復雜組分的Kow值提供了可能性。

3 結(jié)論

本實驗以16種中性及酸性苯系物為模型化合物,建立了Kow″與kw的定量關(guān)系(QSRR模型)。采用內(nèi)部與外部驗證法評價了該模型的預測準確性,并成功預測了中藥材腎毒性組分馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸內(nèi)酰胺及白藜蘆醇的Kow值。本文構(gòu)建的QSRR模型通過RP-HPLC同時得到中藥材中各待測組分的保留時間,僅通過保留時間即可得到其Kow數(shù)據(jù)。這種預測中藥中各類復雜組分Kow值的簡便策略解決了中藥組分難以分離、無法通過經(jīng)典SFM法準確測定其組分Kow值的問題。其可測定對象范圍廣(0

[1] Teschke R. J Clin Transl Hepatol, 2014, 2(2): 80

[2] Zhong Y F, Deng Y Y, Chen Y P, et al. Kidney Int, 2013, 84(6): 1108

[3] Frenzel C, Teschke R. Int J Mol Sci, 2016; 17(5): 588

[4] Zhang P, Ye Y G, Yang X Z, et al. Evid-Based Compl Alt, 2016, 2016: 3560812

[5] Larrey D, Faure S. J Hepatol, 2011, 54: 599

[6] Lao Y M, Jiang J G, Yan L. Brit J Pharmacol, 2009, 157(7): 1128

[7] Suo T C, Wang H X, Li Z. Expert Rev Proteomics, 2016, 13(9): 873

[8] Gomez-Lechon M J, Lahoz A, Gombau L, et al. Curr Pharm Des, 2010, 16(17): 1963

[9] Zhou Y, Qin S Z, Wang K. Current Biomarker Findings, 2013, 3: 1

[10] Ji Q, Zhu F S, Liu X, et al. Evid-Based Compl Alt, 2015, 2015: 983139

[11] Liu P, Liu S L, Tian D Z, et al. Evid-Based Compl Alt, 2012, 2012: 945824

[12] Yang M, Chen J L, Shi X F, et al. Mol Pharmaceut, 2015, 12(10): 3691

[13] Nijoukubo D, Tanaka Y, Okuno Y. Chemsphere, 2016, 156: 111

[14] Wang X F, Zhang R W, Gu L Q, et al. PLoS One, 2015, 10(2): e0116601

[16] Wang M, Liu C X, Dong R R, et al. Evid-Based Compl Alt, 2015, 2015: 379586

[17] Huang H L, Liu M, Chen P. Anal Lett, 2014, 47(11): 1835

[18] Wang R, Xiong A Z, Teng Z Q, et al. Int J Mol Sci, 2012, 13(11): 14634

[19] Low Y, Uehara T, Minowa Y, et al. Chem Res Toxicol, 2011, 24(8): 1251

[20] Rodgers A D, Zhu H, Fourches D, et al. Chem Res Toxicol, 2010, 23(4): 724

[21] Cherkasov A, Muratov E N, Fourches D, et al. J Med Chem, 2014, 57(12): 4977

[22] Huang S H, Tung C W, Fül?p F. Food Chem Toxicol, 2015, 78: 71

[23] The OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Test No. 107: Partition Coefficient (n-Octanol/Water): Shake Flask Method. (1995-07-27) [2016-10-01]. http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-107-partition-coeffi-cient-n-octanol-water-shake-flask-method_9789264069626-en

[24] Purcell W P, Bass G E, Clayton J M. Strategy of Drug Design, New York: Wiley, 1973: 126

[25] Fisk A T, Rostenberg B, Cymbalisty C D, et al. Chemosphere, 1999, 39: 2549

[26] Bruijn J D, Busser F, Seinen W, et al. Environ Toxicol Chem, 1989, 8(6): 499

[27] Lin J Z, Zou L, Fu C M, et al. Chinese Traditional Patent Medicine, 2013, 35(3): 483

林俊芝, 鄒亮, 傅超美, 等. 中成藥, 2013, 35(3): 483

[28] Cao W Y, Feng B, Cheng L F. Chem Cent J, 2016, 10: 29

[29] Liang C, Han S Y, Lian H Z. J Sep Sci, 2014, 37(22): 3226

[30] Liang C, Lian H Z. TrAC-Trends Anal Chem, 2015, 68: 28

[31] Yu H M, Han S Y, Deng H S, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2016, 44(6): 958

俞慧敏, 韓疏影, 鄧海山, 等. 分析化學, 2016, 44(6): 958

[32] Liang C, Qiao J Q, Lian H Z, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(12): 1240

梁超, 喬俊琴, 練鴻振, 等. 色譜, 2016, 34(12): 1240

[33] Niestroj A, Pyka A, Klupsch J, et al. J Liq Chromatogr Relat Technol, 2004, 27(15): 2449

[34] Bhushan M N, Ito Y, Ma Y. J Liq Chromatogr Relat Technol, 1998, 21(1/2): 217

[35] Giaginis C, Theocharis S, Tsantili-Kakoulidou A. Anal Chim Acta, 2006(573/574): 311

[36] Balogh G T, Szántó Z, Forrai E, et al. J Pharm Biomed Anal, 2005, 39(5): 1057

[37] Shi Z H, He J T, Yao T T, et al. J Liq Chromatogr Relat Technol, 2004, 27(3): 465

[38] Han S Y, Qiao J Q, Zhang Y Y, et al. Talanta, 2012, 97: 355

[39] Han S Y, Liang C, Yu H M, et al. RSC Advance, 2015, 5(36): 28840

[40] Han S Y, Liang C, Qiao J Q, et al. Anal Chim Acta, 2012, 713: 130

Prediction ofn-octanol-water partition coefficients of hepatotoxicity/nephrotoxicity components in traditional herbs using quantitative structure-retention relationship models by high performance liquid chromatography

XIANG Yangyang, YU Huimin, DENG Haishan, CHEN Jingya, ZHANG Aihua,CHI Yumei*, HAN Shuying*

(NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210046,China)

reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC); shake-flask method (SFM); quantitative structure-retention relationship (QSRR);n-octanol-water partition coefficients (Kow); aristolochics; resveratrol

10.3724/SP.J.1123.2016.10044

2016-10-22

國家自然科學基金項目(81303311);江蘇省自然科學基金項目(BK20130958);江蘇省屬高校自然科學基金項目(13KJB150030);江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程項目(PAPD);江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項目(PPZY2015A070).

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