微流控芯片流體剪切力和腫瘤壞死因子-α共同作用對大鼠軟骨細(xì)胞表型的影響

石 楊, 盛 坤, 張 敏, 李洪敬*, 秦建華*

(1. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023; 2. 大連醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 遼寧 大連 116000)

研究論文

微流控芯片流體剪切力和腫瘤壞死因子-α共同作用對大鼠軟骨細(xì)胞表型的影響

石 楊1, 盛 坤2, 張 敏1, 李洪敬2*, 秦建華1*

(1. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023; 2. 大連醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 遼寧 大連 116000)

流體剪切力是生物體內(nèi)普遍存在的一種生物力學(xué)形式,是細(xì)胞微環(huán)境的重要組成部分,對細(xì)胞多種生物學(xué)行為有重要調(diào)節(jié)作用。該研究以微流控芯片技術(shù)為基礎(chǔ),建立了一種基于流阻原理能同時(shí)產(chǎn)生4個(gè)不同大小流體剪切力的微流控芯片平臺(tái),用以研究低流速的流體剪切力對大鼠原代軟骨細(xì)胞表型維持的影響。結(jié)果表明,流體剪切力可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的表型維持。還加入了腫瘤壞死因子-α(TNF-α),考察流體剪切力和TNF-α共同作用對軟骨細(xì)胞表型的影響。結(jié)果表明,在剪切力和TNF-α共同作用下,軟骨細(xì)胞的Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達(dá)明顯下調(diào)。該研究為軟骨組織工程和骨性關(guān)節(jié)炎的疾病研究提供有力的研究平臺(tái),為骨關(guān)節(jié)疾病治療和防治提供了理論依據(jù)。

微流控芯片;流體剪切力;腫瘤壞死因子-α;軟骨表型

關(guān)節(jié)軟骨是人體內(nèi)重要的組織結(jié)構(gòu),能夠承接和傳遞外力,維持關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[1]。關(guān)節(jié)軟骨的主要成分為透明軟骨[2],主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成。細(xì)胞外基質(zhì)主要作用為維持軟骨組織的機(jī)械性能和組織的完整性[3]。在透明軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)中,Ⅱ型膠原約占基質(zhì)膠原總量的90%以上[4]。Ⅱ型膠原和蛋白多糖的主要功能是減少外力對軟骨組織的沖擊力,起到保護(hù)關(guān)節(jié)的作用。由于軟骨組織缺少神經(jīng)、血管和淋巴組織的有效支配[5],代謝過程中的營養(yǎng)吸收和廢物排泄主要通過關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)時(shí)滑膜滑液的流動(dòng)完成。因此,軟骨細(xì)胞長時(shí)間處于流體剪切力、壓縮力和牽張力等機(jī)械力作用下,處于復(fù)雜的生物力學(xué)微環(huán)境中。

流體剪切力是生物體內(nèi)普遍存在的一種生物力學(xué)形式,是細(xì)胞微環(huán)境的重要組成部分,對于細(xì)胞的多種生物學(xué)行為,包括維持形態(tài)、增殖、凋亡、分泌等具有重要調(diào)節(jié)作用[6]。現(xiàn)階段,流體剪切力對于細(xì)胞層面的研究主要集中于血管模擬、骨組織及其微環(huán)境的模擬等方面[7,8]。人體內(nèi)的組織間隙流剪切力范圍約在10-6至102dyne/cm2之間。生理?xiàng)l件下,軟骨組織浸泡于滑膜組織分泌的滑液中。當(dāng)關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)時(shí),滑液隨著作用力會(huì)對軟骨組織產(chǎn)生剪切力的刺激。體外研究模型中,軟骨細(xì)胞處于靜態(tài)平面培養(yǎng)條件下,軟骨細(xì)胞特異性的細(xì)胞外基質(zhì)由Ⅱ型膠原逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)棰裥湍z原,失去軟骨特異性功能。而在流體剪切力存在的條件下,可一定程度地恢復(fù)軟骨細(xì)胞的特征性表型,對于軟骨細(xì)胞表型維持具有重要作用。然而,流體剪切力對軟骨細(xì)胞微環(huán)境影響的作用機(jī)制尚不完全明了,亟須建立合適的體外研究模型,進(jìn)一步確認(rèn)流體剪切力對軟骨細(xì)胞影響的機(jī)制。同時(shí),研究生物力學(xué)因素對軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制對于骨關(guān)節(jié)炎等疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。

微流控技術(shù)被認(rèn)為是21世紀(jì)重要的科學(xué)技術(shù)之一,因其具有同細(xì)胞大小相匹配的微米尺寸構(gòu)件、同生理環(huán)境接近的封閉環(huán)境、傳質(zhì)傳熱快和高通量等特點(diǎn),已成為細(xì)胞生物學(xué)研究的重要平臺(tái),也為開展生物物理因素細(xì)胞微環(huán)境構(gòu)建,特別是為生物力學(xué)中流體剪切力研究提供了一種全新的思路[9,10]。

本實(shí)驗(yàn)利用流體阻力原理構(gòu)建模仿軟骨細(xì)胞生物力學(xué)微環(huán)境的微流控芯片,建立了能夠同時(shí)產(chǎn)生4個(gè)不同大小流體剪切力的微流控芯片平臺(tái),用以研究低流速流體剪切力對軟骨細(xì)胞表型的影響。同時(shí),還加入了腫瘤壞死因子-α(TNF-α)來考察多種因素的共同作用下軟骨細(xì)胞表型的維持和變化情況。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Steri-Cycle CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron公司),IX71倒置熒光顯微鏡(Leica公司),L600臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(湖南湘儀公司),數(shù)顯水浴恒溫振蕩器(金壇市華峰儀器有限公司),勻膠機(jī)、烘膠機(jī)(北京創(chuàng)威納科技有限公司),紫外光刻機(jī)(Thermo Oriel公司),等離子體機(jī)(Harrick公司),聚四氟乙烯管(Microchem公司),微量精確注射泵(Microchem公司)。

DMEM/F-12(Dulbecco’s Modified Eagle Media/Nutrient Mixture F-12)培養(yǎng)基,美國Hyclone公司),胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶(美國Gibco公司),青霉素-鏈霉素溶液100×(上海碧云天生物技術(shù)公司), Ⅱ型膠原酶(美國Worthington公司),兔抗鼠Ⅰ型膠原單克隆抗體、兔抗鼠Ⅱ型膠原單克隆抗體和兔抗鼠蛋白多糖單克隆抗體(武漢博士德公司),細(xì)胞骨架蛋白抗體(F-actin,美國Acris公司),異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)、羅丹明(TRITC)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、封閉血清和抗體稀釋液(中杉金橋公司),細(xì)胞核藍(lán)色染料(DAPI,美國Sigma公司), live/dead細(xì)胞染色試劑盒(美國Invitrogen公司), Sylgard 184聚二甲基硅氧烷(PDMS)單體及引發(fā)劑(美國Dow Coring公司), SU-8 3035光刻膠(美國Micochem公司)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 軟骨原代細(xì)胞的提取和培養(yǎng)

根據(jù)文獻(xiàn)[11],取體重100～120 g雄性SD潔凈大鼠斷頸處理后,放入75%(體積分?jǐn)?shù))酒精中浸泡15 min消毒。用脫脂棉球消毒大鼠皮膚表面。分離出股骨,取出關(guān)節(jié)腔內(nèi)的股骨頭,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)多次沖洗,在培養(yǎng)皿中分離軟骨組織和軟骨下骨,將軟骨組織剪成1×1×1 mm3大小的組織塊,轉(zhuǎn)移至離心管中,以1 500 r/min的速度離心5 min,去上清。用體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶在37 ℃水浴消化30 min。終止消化后,離心去上清,加入質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.15%的Ⅱ型膠原酶,于37 ℃搖床中水浴振蕩消化過夜(約16 h)。次日,經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后收集細(xì)胞懸液,以800 r/min的速度離心3 min,用培養(yǎng)基重懸,接種在細(xì)胞瓶內(nèi)。觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)以及貼壁的情況。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%,進(jìn)行消化傳代(1∶3),采用3～6代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 微流控芯片的制作

在勻膠機(jī)上以1 000 r/min的速度在玻璃片上甩負(fù)性光刻膠SU-8 3035(30 s)。在95 ℃的烘膠機(jī)上進(jìn)行20 min前烘;室溫冷卻后將掩膜背面放置于光刻膠玻璃片上,紫外曝光30 s,取下芯片掩膜,于95 ℃的烘膠機(jī)上后烘20 min,冷卻,避光。再使用乳酸乙酯使芯片SU-8 3035模板顯影,使用氮?dú)庋杆俅蹈?在180 ℃堅(jiān)膜1 h,得到SU-8 3035模板。以10∶1的體積比混合PDMS單體與引發(fā)劑,混合均勻后將混合體倒在SU-8 3035模板上,抽真空20 min,取出置于烘箱中的水平臺(tái)上于85 ℃加熱30 min,固化。分離PDMS塊和SU-8 3035模板,將PDMS和清洗過的玻璃片放于等離子體中照射60 s,進(jìn)行芯片與玻璃的不可逆封接。

1.4 軟骨細(xì)胞在微流控芯片上的培養(yǎng)

將封接好的芯片浸泡于PBS中,高壓滅菌。灌注細(xì)胞懸液前用DMEM/F-12培養(yǎng)基潤洗,細(xì)胞懸液密度為5×106cells/mL,細(xì)胞懸液用量為70 μL。待細(xì)胞均勻鋪滿各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)池后,于37 ℃培養(yǎng)箱孵育,5～6 h后細(xì)胞貼壁,次日用于灌流實(shí)驗(yàn)。灌注液體前于入口處放置四氟管,與精密注射泵相連,以流速24 μL/h進(jìn)行灌流,出口處連接廢液口。

1.5 軟骨細(xì)胞在微流控芯片上培養(yǎng)的活性鑒定

大鼠軟骨細(xì)胞在靜態(tài)和流體剪切力條件下培養(yǎng)24 h后,進(jìn)行細(xì)胞活性鑒定。用PBS沖洗2次,用live/dead細(xì)胞染色試劑盒染色,避光,于37 ℃孵育30 min; PBS沖洗2次后,進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)采集。

1.6 軟骨細(xì)胞的細(xì)胞免疫熒光染色

對培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中和芯片中的軟骨細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色,分別檢測F-actin、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、蛋白多糖的表達(dá)情況。吸去培養(yǎng)液,用PBS沖洗3次,用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定細(xì)胞15 min,用PBS沖洗3次,每次3～5 min。用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.2%的Triton X-100常溫孵育15 min,用PBS沖洗3次。加入封閉血清200 μL,于4 ℃冰箱保存1～2 h。吸去封閉血清,加入100 μL一抗工作液(按體積比1∶100稀釋),于4 ℃孵育18～24 h。次日,吸去一抗工作液,用PBS沖洗3次,加入稀釋的二抗工作液,避光孵育1 h。用PBS沖洗3次,每次3～5 min。吸去PBS,加入100 μL DAPI溶液,孵育15 min。用PBS沖洗3次,熒光顯微鏡下拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析(ANOVE)。p<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 微流控芯片的設(shè)計(jì)與制備

微流控芯片設(shè)計(jì)如圖1所示,芯片包含4個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)池(CH1、CH2、CH3和CH4)、1個(gè)灌流液入口、2個(gè)細(xì)胞進(jìn)樣口(細(xì)胞接種)和3個(gè)廢液排出口。當(dāng)細(xì)胞接種后需使用橡膠塞塞住細(xì)胞進(jìn)樣口,防止細(xì)胞懸液外流和保持灌流時(shí)芯片內(nèi)部流體的連續(xù)性。每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)池連接不同長度的阻力通道。每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)池的長、寬、高分別為4 264.6、1 264.6和100 μm。各出口的直徑大小均為1 mm。芯片為PDMS和玻璃的雜交芯片,其中上層為包含有流體通道、細(xì)胞進(jìn)樣口、細(xì)胞培養(yǎng)池、灌流口、廢液口的PDMS芯片,下層為玻璃材質(zhì)的基片。

圖 1 多梯度流體剪切力微流控芯片設(shè)計(jì)圖Fig. 1 Design drawing of the microfluidic device with multi fluid shear stress

2.2 極低流體剪切力的形成原理與數(shù)值模擬

傳統(tǒng)方法中對細(xì)胞施加流體剪切力一般采用平行平板流動(dòng)小室進(jìn)行研究。平行平板流動(dòng)小室技術(shù)是根據(jù)流變學(xué)原理研制的一種細(xì)胞加力裝置,其基本原理是利用流動(dòng)的培養(yǎng)液對附著在培養(yǎng)基底上的細(xì)胞產(chǎn)生剪切力。實(shí)驗(yàn)中利用微流控技術(shù)流體控制原理也可以簡便地實(shí)現(xiàn)這種細(xì)胞加力方式。本試驗(yàn)利用不同寬度與長度微通道形成不同流體阻力的原理,成功地在同一個(gè)芯片中的不同區(qū)域同時(shí)形成多個(gè)強(qiáng)度的流體剪切力。該芯片平臺(tái)包含了微通道網(wǎng)絡(luò)和4個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)池,通過微流控芯片流路設(shè)計(jì),4個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)池中的細(xì)胞能夠同時(shí)受到4個(gè)不同大小的流體剪切力的作用。在圓柱形細(xì)胞微培養(yǎng)池中,Poiseuille流體模型能夠直接評估微細(xì)胞培養(yǎng)池壁上的剪切力大小。微流控網(wǎng)絡(luò)的3D流場可以通過微裝置出入口處的已知壓力和CFD(計(jì)算流體力學(xué))模擬獲得。位于細(xì)胞微池中的流體是層流(雷諾系數(shù)Re<1),因此能夠在電路中類推出微流控的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),得到方程式如下:

(1)

其中Ri是細(xì)胞培養(yǎng)池不同位置的水阻力(單位Pa5s/m2),η代表動(dòng)態(tài)液體的黏度(單位Pa5s),L、h、w分別代表細(xì)胞培養(yǎng)池的長度、高度和寬度(單位m)。微流控芯片網(wǎng)絡(luò)和電路的類比存在這樣一個(gè)等式:

ΔP=ΔRtotQtot

(2)

此等式中ΔP表示出入口之間的壓力損耗(單位Pa),Qtot表示當(dāng)出入口被液體灌滿時(shí)液體的流速(單位mL/s)。ΔRtot為入口與出口之間的流阻(單位Pa5s/m2)。由于出口處常與置于空氣中的廢液相連接,出口處的標(biāo)準(zhǔn)壓力常被認(rèn)為是0。當(dāng)芯片入口的流速大小設(shè)定為24 μL/h時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)池1～4的平均底部流體剪切力大小為0.576、0.127、0.031和0.005 dyne/cm2。細(xì)胞培養(yǎng)池中流體剪切力大小的理論模擬結(jié)果如圖2所示。通過在細(xì)胞進(jìn)樣口中加入細(xì)胞懸液,使細(xì)胞停留在細(xì)胞培養(yǎng)池中。待細(xì)胞貼壁后(一般為24 h),用精密注射泵由灌流進(jìn)液口施加液流刺激,貼壁后的細(xì)胞將受到流經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)池的液體所造成的流體剪切力。流體剪切力模擬圖(見圖2)顯示,在細(xì)胞培養(yǎng)池內(nèi),除靠近液體進(jìn)口和出口的位置及矩形細(xì)胞培養(yǎng)池邊緣處的區(qū)域流體剪切力有所改變外,培養(yǎng)池內(nèi)其他區(qū)域的流體剪切力差別不明顯,具體數(shù)值見圖2b。

圖 3 大鼠原代軟骨細(xì)胞在靜態(tài)和流體剪切力條件下的細(xì)胞活性Fig. 3 Activities of rat primary chondrocytes under the static and fluid shear stress (FSS) conditionsGreen represents for living cells and red represents for dead cells.

圖 2 微流控芯片流體剪切力大小的理論模擬結(jié)果Fig. 2 Theoretical simulation result of fluid shear stress on microfluidic device a. theoretical simulation of computational fluid dynamics (CFD); b. calculated value of fluid shear stress on microfluidic chip.

2.3 微流控芯片上大鼠原代軟骨細(xì)胞在流體剪切力作用下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定

軟骨細(xì)胞是一種力效應(yīng)細(xì)胞,在力學(xué)刺激下可能會(huì)產(chǎn)生多種生物學(xué)行為的變化。本試驗(yàn)研究了大鼠原代軟骨細(xì)胞的存活與增殖、細(xì)胞形態(tài)及表型維持。流體剪切力作用下細(xì)胞的存活是進(jìn)行其他生物學(xué)行為研究的基礎(chǔ)。為考察流體剪切力對軟骨細(xì)胞活性的影響,采用live/dead細(xì)胞染色試劑盒檢測軟骨細(xì)胞的活性。如圖3所示,細(xì)胞在不同的流體剪切力刺激24 h后,細(xì)胞活性均保持在90%以上,說明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的流體剪切力梯度并不影響細(xì)胞的活性。F-actin是細(xì)胞維持特定形態(tài)的重要蛋白,考察了流體剪切力存在與否情況下,F-actin的表達(dá)強(qiáng)度與分布情況對軟骨細(xì)胞形態(tài)變化的影響。結(jié)果如圖4所示,隨著剪切力的增加,大鼠原代軟骨細(xì)胞的F-actin表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢。在施加大小為0.127 dyne/cm2的流體剪切力刺激后,細(xì)胞F-actin的表達(dá)有明顯增強(qiáng),且細(xì)胞面積增大。結(jié)果表明,一定程度的流體剪切力可促進(jìn)F-actin的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞的黏附。有研究[12-15]表明,一定程度的流體剪切力能夠刺激F-actin的表達(dá),增加細(xì)胞的黏附效應(yīng),本試驗(yàn)結(jié)果與已有報(bào)道相符。

圖 4 大鼠原代軟骨細(xì)胞在靜態(tài)和流體剪切力條件下細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)Fig. 4 F-actin protein expression of rat primary chondrocytes under the static and FSS conditionsFSS treated for 24 h. Green represents for the F-actin and blue represents for the nucleus.

2.4 流體剪切力對大鼠原代軟骨細(xì)胞表型的影響

圖 6 大鼠原代軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的蛋白質(zhì)水平表達(dá)Fig. 6 Expression of collagen Ⅱ in rat primary chondrocytes at protein level a. expression of collagen Ⅱ in rat primary chondrocytes under static, different FSS and FSS with TNF-α conditions. Red represents for collagen Ⅱ and blue represents for the nucleus; b. quantitative expression of collagen Ⅱ in rat primary chondrocytes under static condition and in CH4; c. quantitative expression of collagen Ⅱ in rat primary chondrocytes under different FSS (CH1, CH2, CH3 and CH4) conditions; d. quantitative expression of collagen Ⅱ in rat primary chondrocytes under FSS and FSS with TNF-α conditions. The concentration of TNF-α was 10 μg/L and cells were treated for 24 h. The other conditions were the same as those in Fig. 5.

適宜大小的流體剪切力有益于軟骨細(xì)胞的增殖[16]、蛋白多糖和膠原含量的穩(wěn)定[17]。Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原和蛋白多糖是軟骨表型維持的重要標(biāo)志,同時(shí)也是檢驗(yàn)軟骨細(xì)胞維持特異功能的標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)考察了在不同流體剪切力刺激下,軟骨細(xì)胞Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原和蛋白多糖的蛋白質(zhì)表達(dá)。如圖5所示,在靜態(tài)條件下,Ⅰ型膠原的平均熒光強(qiáng)度為24.7;在0.576、0.127、0.031和0.005 dyne/cm2不同流體剪切力作用下,Ⅰ型膠原的熒光強(qiáng)度分別為32.6、31.3、29.0和27.6(CH1～CH4)。結(jié)果表明,隨著流體剪切力強(qiáng)度的增大,與靜態(tài)條件相比,Ⅰ型膠原的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出上升的趨勢。在靜態(tài)條件下,Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度為14.7;在不同強(qiáng)度的流體剪切力作用下,熒光強(qiáng)度強(qiáng)度分別為21.5、20.0、19.1和15.6(見圖6)。結(jié)果表明,隨著流體剪切力強(qiáng)度的增大,與靜態(tài)條件相比,Ⅱ型膠原的蛋白質(zhì)表達(dá)呈現(xiàn)出上升的趨勢,除CH4與靜態(tài)條件下沒有明顯的差異外,其他強(qiáng)度的流體剪切力組都表現(xiàn)出明顯的差異。進(jìn)一步研究了軟骨細(xì)胞的另一種特異性標(biāo)志蛋白多糖的表達(dá)。結(jié)果(見圖7)表明,靜態(tài)條件下,軟骨細(xì)胞蛋白多糖的熒光表達(dá)強(qiáng)度為28.3;而在流體剪切力作用下,CH1～CH4的熒光表達(dá)強(qiáng)度分別為50.4、46.4、39.8和40.0,與靜態(tài)條件組呈現(xiàn)出顯著性差異,并且在高強(qiáng)度的流體剪切力組中表現(xiàn)出近2倍表達(dá)量的差異。結(jié)果表明,流體剪切力的刺激能夠在一定程度上促進(jìn)蛋白多糖的表達(dá)。由此可見,隨著流體剪切力的變化,蛋白多糖的表達(dá)趨勢與Ⅱ型膠原一致。流體剪切力有利于大鼠軟骨細(xì)胞軟骨表型的維持,軟骨細(xì)胞處于受力的狀態(tài)下更容易維持特異性的功能。

圖 7 大鼠原代軟骨細(xì)胞Aggrecan的蛋白質(zhì)水平表達(dá)Fig. 7 Expression of aggrecan in rat primary chondrocytes at protein level a. expression of aggrecan in rat primary chondrocytes under static, different FSS and FSS with TNF-α conditions. Red represents for aggrecan and blue represents for the nucleus; b. quantitative expression of aggrecan in rats primary chondrocytes under static condition and in CH4; c. quantitative expression of aggrecan in rat primary chondrocytes under different FSS (CH1, CH2, CH3 and CH4) conditions; d. quantitative expression of aggrecan in rat primary chondrocytes under FSS and FSS with TNF-α conditions. The concentration of TNF-α was 10 ng/mL and cells were treated for 24 h. The other conditions were the same as those in Fig. 5.

2.5 流體剪切力與TNF-α共同作用對大鼠原代軟骨細(xì)胞表型維持的影響

當(dāng)軟骨組織受到創(chuàng)傷時(shí),周圍細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子參與介導(dǎo)損傷部位發(fā)生的一系列炎癥反應(yīng)。其中,TNF-α在細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程中發(fā)揮了重要作用[18],是體內(nèi)重要的炎癥因子之一。TNF-α具有刺激關(guān)節(jié)軟骨周圍滑膜細(xì)胞分泌前列腺素E2(PGE2)和膠原酶的作用,造成軟骨組織的損傷[19]。前文已證實(shí),低流速流體剪切力條件下,隨著剪切力的增大,軟骨細(xì)胞特異性表型Ⅱ型膠原表達(dá)增加。但是加入炎性因子TNF-α后,隨著剪切力的增大,Ⅱ型膠原的熒光表達(dá)下調(diào),與FSS同組比較有明顯的差異。同時(shí),蛋白多糖的表達(dá)量進(jìn)一步下調(diào),并與FSS數(shù)據(jù)組顯現(xiàn)出明顯的差異。而且,剪切力越小,Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá)量越明顯。但是,對于Ⅰ型膠原而言,加入TNF-α后,剪切力越小,去分化(失去軟骨表型)的程度越明顯。在兩種因素同時(shí)存在的條件下,一方面,隨著剪切力的降低,Ⅱ型膠原的維持程度越好；另一面,隨著剪切力的降低,軟骨細(xì)胞去分化的程度越明顯。相比與流體剪切力促進(jìn)大鼠軟骨表現(xiàn)的維持,TNF-α的削弱能力更加明顯,它能夠加速大鼠軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖的分解,使軟骨細(xì)胞失去組織表型與功能。

3 結(jié)論

本文建立了一種可以同時(shí)產(chǎn)生4個(gè)不同大小流體剪切力的微流控芯片,用以研究低流速流體剪切力對于軟骨細(xì)胞表型的影響。結(jié)果表明,流體剪切力可以維持大鼠軟骨細(xì)胞的特異性表型,促進(jìn)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá)。TNF-α能夠加速大鼠軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖的分解,使軟骨細(xì)胞失去組織表型與功能。利用微流控技術(shù)可以模擬構(gòu)建細(xì)胞多條件、多因素的生物力學(xué)和化學(xué)微環(huán)境,所構(gòu)建的細(xì)胞微環(huán)境更接近于體內(nèi)細(xì)胞所處的生物環(huán)境,為軟骨組織工程和骨性關(guān)節(jié)炎等多個(gè)研究領(lǐng)域開展生物力學(xué)研究提供了有力的研究平臺(tái),對于骨關(guān)節(jié)疾病治療和防治具有重要意義。

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Effects of combined the fluid shear stress and tumor necrosis factor-α on cartilage phenotype in a dynamic microfluidic chip

SHI Yang1, SHENG Kun2, ZHANG Min1, LI Hongjing2*, QIN Jianhua1*

(1.DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Dalian116023,China;2.FirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116000,China)

Fluid shear stress as a common form of biomechanics plays an important role in maintaining cell morphology, cell secretion and function in microenvironment. Herein, we proposed a microfluidic platform which could generate four different intensities of fluid shear to study the cellular effects of fluid shear stress on chondrocyte phenotype under low flow condition. Under low flow condition, the primary chondrocytes could keep good activity and morphology. With the increase of shear force, the expressions of collagen type Ⅱ and aggrecan in primary chondrocyte were up-regulated. At the same time, the expressions of collagen type Ⅰ increased. These results indicated that fluid shear stress could improve chondrocyte phenotype maintaining. Moreover, increase of the shear force also accelerated the dedifferentiation of chondrocytes. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) plays a negative role in maintaining chondrocyte phenotype. The interaction effect of fluid shear stress and TNF-α on chondrocyte phenotype was investigated on this platform. The results showed that under the combined effects of the shear force and TNF-α, the expressions of collagen type Ⅱ and aggrecan of chondrocytes were significantly down-regulated. This method provided a powerful platform for cartilage tissue engineering and osteoarthritis disease research, and gave a theoretical basis for the joint disease treatment and prevention.

microfluidic chip; fluid shear stress; tumor necrosis factor-α (TNF-α); cartilage phenotype

10.3724/SP.J.1123.2016.11004

2016-11-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81603075);中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2016M591463).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 81603075); China Postdoctoral Science Foundation (No. 2016M591463).

O658

A

1000-8713(2017)04-0458-08

* 通訊聯(lián)系人.E-mail:jhqin@dicp.ac.cn(秦建華);E-mail:hongjingl@hotmail.com(李洪敬).