豬偽狂犬病病毒抗體檢測的研究進(jìn)展

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙市，410128）

豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV)屬于皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科，水痘病毒屬。豬為原始宿主，能引起幼豬出現(xiàn)發(fā)熱、麻痹、昏迷等癥狀，在年輕仔豬中假性狂犬病可能導(dǎo)致高死亡率，而在成年豬中，感染仍以潛伏形式存在。成年豬，作為病毒載體，可能偶爾將病毒傳播給易感染動物。其延遲和復(fù)發(fā)性感染可能影響胎兒和仔豬。因此需要快速診斷兩者，臨床表現(xiàn)為急性以及豬的偽狂犬病感染的潛在形式[1]。無母源抗體的新生仔豬死亡率更高；也可引起半數(shù)妊娠母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎等生殖障礙，不死者可康復(fù)。其中該病與血液單核細(xì)胞有很大關(guān)系，因為血液單核細(xì)胞具有用作PRV的載體細(xì)胞的能力。它也是確定這些細(xì)胞是否也在體內(nèi)代表被感染的血液白細(xì)胞的最重要的亞群。已經(jīng)有足夠的證據(jù)證明單核細(xì)胞的表型變化可能影響對PRV的允許性感染[2]。

1 抗體檢測意義

隨著我國畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展，動物免疫接種已經(jīng)成為目前防御疫病的首選措施。給動物進(jìn)行有效的免疫接種能產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，從而防止疫病的侵入和蔓延。因此在畜禽生產(chǎn)過程中,在群體接種疫苗前后對抗體水平進(jìn)行檢測可以準(zhǔn)確了解動物疫病發(fā)生、傳播和流行情況，掌握養(yǎng)殖場的免疫抗體水平和動物疫病保護(hù)情況，從而更有效地采取防控措施。因此，做好動物免疫抗體檢測工作有著十分重要的臨床意義和經(jīng)濟(jì)意義。而且豬偽狂犬病病毒的抗體檢測可以及時檢測出發(fā)病豬，然后進(jìn)行防治和隔離等措施使豬偽狂犬病得到控制，從而減少豬場的經(jīng)濟(jì)損失。除此之外，我們也可以通過抗體檢測研制出更為有效的疫苗來提高用藥效率，從而加強(qiáng)豬偽狂犬病的治療效果。更有甚者，我們還可以通過檢測豬的乳汁和胎盤血的抗體消長規(guī)律，分析出偽狂犬病病毒能否通過血乳屏障和血胎屏障，進(jìn)而對豬偽狂犬病的防治做出貢獻(xiàn)。

2 抗體檢測必要性

豬偽狂犬病是一種由偽狂犬病病毒引起的高死亡率的急性傳染病。該病屬于第二類動物疫病，可垂直或水平傳播并終生帶毒。目前PRV基因缺失弱毒疫苗在我國的大規(guī)模的應(yīng)用導(dǎo)致了豬偽狂犬病野毒的出現(xiàn)，而且豬偽狂犬病野毒更可能誘導(dǎo)或加劇呼吸道癥狀，也可能與斷奶后的腹瀉有關(guān)，并且還可降低豬機(jī)體對其他疫苗如豬瘟疫苗的體液免疫應(yīng)答能力，抑制抗體水平的升高，而且在近幾十年里受野生豬群數(shù)量的影響PRV血清陽性率明顯增加[3]。為準(zhǔn)確區(qū)分野毒感染豬和疫苗接種豬，及時淘汰強(qiáng)毒感染豬，防止免疫豬被誤殺，急需加強(qiáng)偽狂犬病強(qiáng)毒鑒別診斷方法的研究與推廣應(yīng)用[4]。由于頻繁引種和偽狂犬毒株的變異導(dǎo)致豬偽狂犬病受多種因素的控制，如注射疫苗、天氣突變、管理不當(dāng)?shù)韧饨缫蛩?，稍有不?dāng)就會引起豬偽狂犬病的爆發(fā)，給養(yǎng)豬戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，所以我們需要進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的診斷。

3 抗體檢測技術(shù)

目前已知的檢測偽狂犬病病毒抗體的方法有很多種，但無論哪一種方法都不可能解決所有的問題，我們需要根據(jù)自己的檢測目的選擇最為合適的檢測方法。

3.1 血凝試驗

吳平等[5]建立了反向間接血凝(抑制)試驗檢測偽狂犬病的方法，該方法是利用抗體致敏紅細(xì)胞在相應(yīng)的抗原作用下，發(fā)生紅細(xì)胞凝集的特性來測定抗原的。該實驗實際操作時利用了單克隆抗體Mab3致敏的紅細(xì)胞(SRC3)檢測非PRV抗原的標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SRC3對PRV產(chǎn)生的凝集作用是特異性的，此外該實驗測定了82份NT陽性血清，RPHI的檢出率為91.5%,漏檢率3.5%，該方法與NT的符合率為94.4%，完全可以取代NT。此外廖文軍等[6]建立了檢測豬偽狂犬病病毒gE抗體紅細(xì)胞凝集試驗的方法也給PR的診斷帶來很大幫助，該方法是利用偽狂犬病病毒具有凝集動物紅細(xì)胞的特性設(shè)計的試驗。用該方法檢測PRV感染了的血清可以看到明顯的凝集圈，而其他少數(shù)病毒的陽性血清檢測時則沒有出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，充分驗證了該方法的特異性。而且該方法與gE-ELISA診斷試劑盒相比，陰、陽檢出符合率為100%，因該方法具有快速、簡便的特點所以被認(rèn)為是PR診斷的常用方法之一。

3.2 病毒分離鑒定

楊慶芳等[7]通過BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)、病毒毒力滴定、中和試驗、PCR檢測病毒方法對豬偽狂犬病病毒的分離株進(jìn)行了鑒定，充分驗證了偽狂犬病病毒在BHK-21細(xì)胞中增殖而且盲傳4代后就出現(xiàn)了細(xì)胞病變；還用BHK-21細(xì)胞準(zhǔn)確測定了其毒價TCID50,利用中和試驗鑒定時發(fā)現(xiàn)病毒能被PRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和,利用PCR體外擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段與預(yù)期目的條帶一致。實驗現(xiàn)象和實驗結(jié)果驗證了該方法是成立的，為偽狂犬病病毒的治療和診斷做出了很大貢獻(xiàn)。

3.3 中和試驗

微量中和試驗是利用熒光抗體染色法進(jìn)行的，其特異性強(qiáng)、敏感度高的特點倍受人們的青睞，在美國及其它一些國家還被列為法定的檢測方法。方六榮等[8]應(yīng)用了微量中和試驗進(jìn)行了豬偽狂犬病血清學(xué)調(diào)查，該方法對毒價（TCID50）、中和效價和中和指數(shù)進(jìn)行了測定，得出的結(jié)果與目前普遍認(rèn)為的中和效價為1∶2以上、中和指數(shù)為316以上的血清為陽性相附合，而且從發(fā)過病的豬場均檢出了陽性血清，從未發(fā)病的4個豬場檢出的血清均為陰性，繼而證明了微量中和試驗檢測偽狂犬病病毒抗體的可靠性和準(zhǔn)確性。此方法的建立與應(yīng)用給偽狂犬病病毒的診斷帶來了很大希望。

3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附試驗優(yōu)點是檢測時間短、靈敏度高，非常適用于大批量樣品的檢測，是實驗室常用的抗體檢測方法之一。苗得園等[9]建立了單抗夾心LAB-ELISA檢測豬偽狂犬病病毒的研究，使得ELISA檢測法得到了升華，將種特異性單抗和生物素-親和素系統(tǒng)引入其中，進(jìn)一步提高了該方法的特異性和敏感性。而且LAB-ELISA不與其他常見的病原體發(fā)生反應(yīng)，具有良好的特異性，為偽狂犬病病毒的診斷提供了很大幫助。相繼唐勇等[10-11]建立了gG-LAT和gE-LAT檢測偽狂犬病病毒的方法，該研究分別切除了gG和gE基因NotI下游514bp的片段，結(jié)果gG和gE基因上游SacI-NotI片段在大腸桿菌中獲得了表達(dá)且表達(dá)產(chǎn)物具有抗原性，從而建立了gG-LAT和gE-LAT檢測豬偽狂犬病病毒的方法。該方法操作簡單、耗時短，是目前唯一一種區(qū)分gG和gE基因缺失疫苗免疫豬與自然感染豬的方法，也為偽狂犬病的治療打下了基礎(chǔ)。除此之外唐勇等[12-13]還建立了豬偽狂犬病gE-ELISA和gGELISA鑒別診斷方法，該研究分別應(yīng)用gE與gG基因工程表達(dá)產(chǎn)物成功地建立了gE-ELISA和gGELISA,用該方法與PRV的病理診斷及PCR診斷方法同時檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法的診斷效果介于病理診斷與PCR診斷之間，該方法特異性好、敏感性高，可以應(yīng)用于臨床。與gG-LAT和gE-LAT檢測法一樣可以區(qū)分gG和gE基因缺失疫苗免疫豬與自然感染豬，為偽狂犬病的根除計劃提供了有利條件。祁小樂等[14]建立了豬偽狂犬病病毒單抗雙夾心ELISA，使ELISA得到了升華。該研究通過對PRV不同毒株、PRRSV等不同病毒進(jìn)行交叉試驗以及特異性阻斷實驗，充分證明了該診斷方法具有良好的特異性。而且該種方法選用可拆卸式聚苯乙烯板，各個孔之間相互獨立從而解決了外圍孔OD值偏高的問題，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。汪招雄等[15]通過將豬偽狂犬病病毒(Prv)Ea株特異性單克隆抗體576株作為捕獲抗體，純化的抗Prv lgG為檢測抗體從而建立了檢測Prv抗原的雙抗體夾心ELISA法,在研究過程中，他們做了很多驗證性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法比PCR準(zhǔn)確性還要高，而且也不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，操作簡單，耗時短，非常適用于臨床診斷。最近，雷有玲等[16]通過利用原核表達(dá)技術(shù)表達(dá)豬偽狂犬病毒gE蛋白，以純化的重組面蛋白為包被抗原建立了檢測豬偽狂犬病毒野毒抗體的間接ELISA方法，優(yōu)化了ELISA的反應(yīng)條件。本研究做了一系列的交叉試驗、重復(fù)性試驗和符合性試驗，確定了該方法的特異性和準(zhǔn)確性，為PRV的抗體檢測提供了一種快速、準(zhǔn)確的血清學(xué)檢測方法，非常適合在基層應(yīng)用。

3.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測法靈敏度高、特異性好，所以被廣泛使用。但做PCR時我們需要注意的是采集的病料必須是3周內(nèi)沒有接種過偽狂犬弱毒疫苗的豬，以免造成誤診。在科研人員的不懈努力下，漸漸出現(xiàn)了多重PCR和套式PCR，對豬偽狂犬病的診斷提供了很大幫助。剛開始的時候，婁高明等[17]發(fā)現(xiàn)血清學(xué)檢測和病毒分離鑒定都存在一定的誤差，然后他們利用PRV的原理，通過計算機(jī)分析設(shè)計并合成了1對用于擴(kuò)增偽狂犬病病毒gB基因281bp片段的引物，然后PRV閩A株細(xì)胞培養(yǎng)毒為模板，篩選最佳反應(yīng)條件和試劑工作濃度從而建立了檢測偽狂犬病病毒的PCR法。該方法使用的引物可大量合成并長期保存，檢測速度快，結(jié)果準(zhǔn)確，而且可以在實驗室不能持續(xù)提供細(xì)胞、樣品中沒有感染性病毒存在等許多情況下使用。除此之外，還為分子生物學(xué)技術(shù)檢測偽狂犬病病毒打下了堅實的基礎(chǔ)。為了更早的診斷出偽狂犬病，孫彥琴等[18]建立的豬流行性腹瀉病毒與豬偽狂犬病病毒二重RT-PCR檢測方法，可在早期診斷出偽狂犬病，以便及早采取措施控制疫病的蔓延，給豬場減少了很多損失。而且只需要一次反應(yīng)就可以同時鑒別出PED和PR兩種疫病，為疫病的診斷節(jié)省了不少時間和開支，適合廣泛使用。繼而為了更好的完善PCR檢測法，呂建強(qiáng)等[19]建立了偽狂犬病病毒實時熒光PCR檢測法，特異性特別高，只能檢測到目標(biāo)病毒，非常適合于基層防疫部門應(yīng)用。此外，由于該方法可以定量檢測到病毒DNA，這將為研究病毒的入侵途徑、在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖以及潛伏和復(fù)發(fā)機(jī)制等提供很大幫助，從而有利于進(jìn)一步研究偽狂犬病病毒的傳播途徑和致病機(jī)理。呂素芳等[20]建立了一種快速、特異的方法檢測偽狂犬病毒gE基因缺失病毒株，本研究根據(jù)PRV野毒sA株的gD和gE基因序列設(shè)計引物，對反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化從而建立了檢測偽狂犬病病毒gE基因缺失病毒株的sYBR Green I實時定量PCR法。本研究還做了特異性試驗、敏感性試驗和重復(fù)性試驗，從而驗證了該方法的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)其敏感性比傳統(tǒng)的PCR檢測法要高100倍，非常適用于豬群中偽狂犬病流行的診斷。吳旭錦等[21]根據(jù)偽狂犬病病毒gD基因序列設(shè)計并合成了2對引物，通過反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化建立了套式PCR方法。該方法比國際方法的靈敏度高1 000倍，可以很容易的檢測出病毒含量低的病料，對臨床診斷提供了很大幫助。顧陽等[22]根據(jù)豬偽狂犬病病毒gE、gH的基因序列設(shè)計合成了2對特異性引物,分別建立gE和gH基因的單項PCR擴(kuò)增方法，通過對PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化,建立了鑒別PRV強(qiáng)毒和疫苗毒的雙重PCR檢測方法。該方法具有特異性和敏感性高、檢測成本低,能快速檢測和鑒別多種病原的特點，而且還能夠區(qū)別感染動物和疫苗接種動物，適合于挑選出陽性野毒感染動物，有望在臨床診斷方面得到廣泛應(yīng)用。

3.6 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）

楊睿等[23]采用LAMP技術(shù)建立了一種針對偽狂犬病病毒的可視、快速、靈敏、特異的檢測方法。應(yīng)用PrimerExplorerV4軟件,根據(jù)偽狂犬gE基因的保守序列設(shè)計了4條引物,優(yōu)化了反應(yīng)體系與反應(yīng)時間,檢測了特異性與靈敏性。發(fā)現(xiàn)該方法只需要40min就能檢測出結(jié)果,具有良好的特異性,靈敏度為普通PCR的100倍,最低可檢測出質(zhì)量濃度為6.2×10～9mg/L的病毒DNA。該方法的建立為偽狂犬病的快速診斷提供了新的思路。

4 抗體檢測應(yīng)用

抗體檢測首先可以應(yīng)用在協(xié)助臨床診斷方面，例如可以檢查是否患病，也可以作為疾病治療后的一個指標(biāo)，還可以作為對預(yù)防接種效果的一種觀察。在抗體檢測用于診斷時，要考慮到患者所在地區(qū)該疾病的發(fā)病情況及與該疾病密切相關(guān)的情況，如正常人血清中抗體的水平，這一點在病原微生物感染的疾病中尤為重要。然后抗體檢測也可以應(yīng)用在實驗室，我們可以利用抗體檢測的結(jié)果研究其消長規(guī)律，從而研究出更高效的疫苗或者從中探索出更為有效的防控措施。抗體檢測還可以應(yīng)用在養(yǎng)殖場方面，例如根據(jù)抗體的消長規(guī)律可以更合理有效的用藥，有時候還可以及時對發(fā)病豬進(jìn)行隔離，從而降低豬場的損失。

5 討論與小結(jié)

據(jù)報道豬偽狂犬病在國內(nèi)很多個省市流行，而且該病在中國的流行呈逐漸嚴(yán)重的形勢。盡管在規(guī)模化豬場普遍采用偽狂犬病基因缺失疫苗進(jìn)行預(yù)防，但終究是防不勝防。近年來，很多規(guī)?；疫M(jìn)行過疫苗防治的豬場還是被檢測出了偽狂犬病，這一現(xiàn)象對中國的養(yǎng)殖行業(yè)無疑是重大的挑戰(zhàn)。因此，在疫苗的生產(chǎn)和保存等方面仍需要改進(jìn)以提高疫苗的質(zhì)量和構(gòu)建新的缺失突變株疫苗成為今后的發(fā)展方向。此外，探索出更為快速、準(zhǔn)確、靈敏的診斷方法也是非常有必要的。隨著現(xiàn)代科技的不斷發(fā)展和研究團(tuán)隊的日益增加，我相信不久的將來我們將攻克這一難題。