透明腦實驗體系的建立與實踐

陳曉萍, 申子好

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 杭州 310032)

透明腦實驗體系的建立與實踐

陳曉萍, 申子好

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 杭州 310032)

CLARITY透明腦實驗是動物組織形態(tài)研究中的一項前沿技術(shù)，如何在本科生教學(xué)中開設(shè)還少有經(jīng)驗。根據(jù)教學(xué)實驗室條件，對該項技術(shù)的實驗方法、技術(shù)流程進(jìn)行了一定的改進(jìn)，使之適合于本科生教學(xué)。通過教學(xué)實踐，培養(yǎng)了學(xué)生的綜合學(xué)習(xí)能力和前沿實驗技能。

CLARITY技術(shù)；實驗體系；教學(xué)實踐

組織透明CLARITY是利用化學(xué)或者物理的方法將大塊組織或者器官進(jìn)行透明化處理的技術(shù)，在實驗儀器幫助下對組織或器官內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)進(jìn)行直接的觀察與檢測[1]。近年來，組織透明技術(shù)快速發(fā)展，在組織形態(tài)學(xué)研究、疾病診斷等方面展示了重要的應(yīng)用前景[2]。

腦是機體最重要的組織器官，其形態(tài)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，傳統(tǒng)上采用對局部區(qū)域進(jìn)行定位切片分析，其缺點是難以獲得全腦立體的結(jié)構(gòu)信息。盡管近年發(fā)展了連續(xù)切片和計算機三維重構(gòu)技術(shù)，但其過程繁復(fù)，難于普及[3]。CLARITY透明腦技術(shù)是一種新型的腦結(jié)構(gòu)研究方法，它采用組織透明化原理，簡便快速地呈現(xiàn)全腦的形態(tài)結(jié)構(gòu)，在腦機能與腦疾病研究中具有重要價值[4]。

本項研究的目的是將CLARITY技術(shù)引入本科生的教學(xué)實踐，讓學(xué)生了解組織透明這種新型技術(shù)以及相關(guān)的前沿進(jìn)展。由于教學(xué)實驗在時間安排、操作空間、實驗器材等方面都有特別要求[5]，作者對原有的實驗方法、技術(shù)流程進(jìn)行了一定的改進(jìn)，現(xiàn)對我們的教學(xué)經(jīng)驗加以分析說明。

1 課程的預(yù)習(xí)

CLARITY是美國斯坦福大學(xué)Deisseroth等[6]在2013年5月《Nature》上首先報道的一種全新的組織透明技術(shù)，該技術(shù)利用電泳技術(shù)脫脂，得到一種清晰透明的腦結(jié)構(gòu)模型，這種模型可以呈現(xiàn)腦的神經(jīng)纖維、神經(jīng)突觸、蛋白質(zhì)/核酸/神經(jīng)遞質(zhì)等精細(xì)結(jié)構(gòu)。此后Susaki等[7]加以發(fā)展，引入免疫熒光方法，更清晰地展現(xiàn)出腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與傳導(dǎo)通路。

傳統(tǒng)的組織學(xué)手段主要采用解剖與組織切片方法，解剖方法用以觀察動物體內(nèi)組織與器官的位置，著重其大體形態(tài)與結(jié)構(gòu)，組織切片方法則借助顯微鏡觀察組織的精細(xì)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞與亞細(xì)胞水平進(jìn)行深入研究，其缺點是切片過程中破壞了組織結(jié)構(gòu)的完整性與連續(xù)性[8]。CLARITY技術(shù)綜合兩者優(yōu)點，先通過電泳技術(shù)結(jié)合離子型去垢劑將組織中的脂質(zhì)移除，再使用與組織折光系數(shù)相似的介質(zhì)溶液進(jìn)行灌注與浸泡，使組織器官通澈透明，最終利用熒光蛋白和免疫標(biāo)記呈現(xiàn)出立體的精細(xì)結(jié)構(gòu)[9]。

本項實驗安排為綜合性實驗，要求學(xué)生在課前預(yù)先閱讀與查閱相關(guān)原始文獻(xiàn)，并寫出預(yù)習(xí)報告，使學(xué)生在實驗開始前對CLARITY技術(shù)的基本流程、特點與創(chuàng)新意義已經(jīng)有了基本的了解，為接下來教學(xué)活動的順利開展打好鋪墊。

2 實驗的基本流程

2.1 實驗材料與基本溶液的準(zhǔn)備

雄性ICR小鼠6只，購自浙江省醫(yī)學(xué)實驗動物中心；丙烯酰胺(99.9%)與雙丙烯酰胺(99%)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；VA044 引發(fā)劑(98.0%)購自上海撫生實業(yè)有限公司；多聚甲醛(95%)購自 Sigma公司；SDS(化學(xué)純)購自上海英鵬化學(xué)試劑有限公司；細(xì)胞過濾器(40 μm孔徑)6只，購自上海臥宏生物科技有限公司；DYY-8C型電泳儀、 DYCP-31A型電泳槽為北京六一儀器廠產(chǎn)品。

基本溶液：1)0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4)；2)0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH 8.5)；3)40%多聚甲醛；4)40% SDS；5)40%丙烯酰胺；6)0.5%雙叉丙烯酰胺；7)2.5%VA044引發(fā)劑；8)電泳/洗滌緩沖液：4% SDS溶于0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH 8.5)。

上述材料與溶液在實驗開始前由實驗員預(yù)先準(zhǔn)備好，溶液放置于4℃冰箱保存。

2.2 配制水凝膠預(yù)反應(yīng)液

實驗課上，將30名學(xué)生分為6組，每組5人。由于水凝膠預(yù)反應(yīng)液需要新鮮配制，實驗開始后首先由其中1位同學(xué)進(jìn)行配制，具體方式：從冰箱取出預(yù)配溶液，用移液管吸取40%多聚甲醛1 mL, 40%丙烯酰胺1 mL, 0.5%雙叉丙烯酰胺1 mL, 2.5%VA044引發(fā)劑1 mL,加入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)至100 mL。操作過程在冰上進(jìn)行以延緩凝膠交聯(lián)反應(yīng)。由于丙烯酰胺和雙叉丙烯酰胺均有揮發(fā)毒性，操作者需要穿戴口罩、帽子與乳膠手套，并在通風(fēng)柜中進(jìn)行。

2.3 腦室灌注與滲透

每組取1只小鼠，皮下注射40 mg/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行深度麻醉，將完全麻醉后的小鼠放置冰上，腹部朝上，移入通風(fēng)柜中。剪開胸腹部暴露心臟，在左心室插入7號注射針作為灌注液輸入端，在右心耳剪一個小口作為灌注液流出口。緩緩灌注磷酸鹽緩沖液50 mL和水凝膠預(yù)反應(yīng)液30 mL，在冰上剝離完整腦，清洗后放置于50 mL水凝膠預(yù)反應(yīng)液中，于4℃冰箱反應(yīng)3 d以使預(yù)反應(yīng)液完全滲透腦組織。

2.4 水凝膠包埋

實驗第4天，從冰箱取出鼠腦，轉(zhuǎn)至40℃水浴孵育3 h使水凝膠交聯(lián)，鼠腦被完整地包埋于水凝膠中，用彎頭鑷將包埋后的鼠腦完整剝離，浸泡于溫?zé)岬碾娪?洗滌緩沖液中漂洗，每隔4 h換液1次，反復(fù)3次以去除多聚甲醛、丙烯酰胺、雙叉丙烯酰胺等殘余。

2.5 組織透明化

實驗第5天，從漂洗液中取出鼠腦，先放置于細(xì)胞過濾器，再將細(xì)胞過濾器固定于電泳槽的負(fù)極凹槽，加入電泳/洗滌緩沖液500 mL；將電泳槽放于恒溫56℃的水浴鍋，接通電源，調(diào)節(jié)至電壓40V、電流150 mA條件下進(jìn)行電泳洗滌，每隔3 d更換1次電泳/洗滌緩沖液，連續(xù)4周。

2.6 結(jié)果觀察與報告

從配制預(yù)反應(yīng)液開始，學(xué)生對實驗的每一個環(huán)節(jié)進(jìn)行觀察和記錄，在組織透明化階段，對腦組織每周觀察拍照，記錄鼠腦逐漸透明化的過程，最后的實驗報告則要求按照研究性論文的形式，包括題目、引言、實驗方法、結(jié)果與討論及參考文獻(xiàn)等內(nèi)容。

3 教與學(xué)的互動

本項實驗教學(xué)活動對知識背景要求較高，操作流程復(fù)雜，持續(xù)時間長達(dá)1個月，與常規(guī)的實驗課有所區(qū)別，因而，我們在教學(xué)過程中對教學(xué)方法也進(jìn)行了相應(yīng)的調(diào)整。

3.1 充分調(diào)動學(xué)生的主觀積極性

我們對課前的預(yù)習(xí)提出了較高的要求,提前兩周就將Deisseroth原文和多篇中英文文獻(xiàn)發(fā)給學(xué)生,要求學(xué)生在上課時提交針對CLARITY技術(shù)基本原理、創(chuàng)新點和應(yīng)用前景的預(yù)習(xí)報告，這種預(yù)習(xí)起到了好的效果，學(xué)生在上課時對CLARITY技術(shù)已經(jīng)比較熟悉，學(xué)習(xí)積極性高漲，在實驗過程中積極動手，并提出許多有見解的意見。

本實驗所涉及的腦室灌流、水凝膠包埋、電泳洗滌在常規(guī)的實驗教學(xué)中很少見到，具有較大的技術(shù)難度[9]。我們在實驗開始時首先詳細(xì)講解了有關(guān)的技術(shù)要點與注意事項，實驗過程中則放手讓學(xué)生去做，鼓勵學(xué)生觀察和探究，培養(yǎng)學(xué)生主動學(xué)習(xí)、探索的能力。

3.2 小組討論的學(xué)習(xí)模式

本項實驗周期很長，涉及多個復(fù)雜環(huán)節(jié)，因此，我們以小組形式開展教學(xué)活動。在實驗開始時，先以小組為單位對CLARITY技術(shù)進(jìn)行分析和討論，熟悉基本原理和技術(shù)流程；在實驗進(jìn)行過程中，小組成員分工協(xié)作，尤其是組織透明化環(huán)節(jié)，全過程長達(dá)1個月，因此，要求小組成員制訂出人員分工安排表，明確每個人的任務(wù)，并進(jìn)行有針對性的主動學(xué)習(xí)；在實驗完成后，再次組織進(jìn)行小組討論，對每個人的分工部分進(jìn)行匯總，商討實驗中觀察到的現(xiàn)象和存在的問題，最后完成實驗報告。

這種小組討論的學(xué)習(xí)模式有助于學(xué)生在實驗過程中互幫互助和磋商交流，學(xué)生在進(jìn)行小組討論中心理上是相對放松的，敢于發(fā)言并表達(dá)自己對問題的看法，因而容易產(chǎn)生思想火花，同時，為了說服其他成員接受自己的觀點，就要對問題進(jìn)行深層次解剖與分析，因此對問題的研究就會更深刻[10]。

4 總結(jié)與思考

CLARITY是一項新型的組織透明技術(shù)，通過水凝膠包埋、電泳洗滌實現(xiàn)透明化過程，呈現(xiàn)組織器官的三維立體通透圖像。教學(xué)上，CLARITY作為一項創(chuàng)新性的前沿技術(shù)，學(xué)生之前從未接觸過透明組織這一概念與相關(guān)實驗方法，因此，我們加強了前期的原始文獻(xiàn)閱讀和實驗多個環(huán)節(jié)中的分組討論，以幫助學(xué)生更好地理解這項技術(shù)。

將CLARITY這樣的前沿技術(shù)安排到學(xué)生的教學(xué)實踐，明顯激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性，通過引導(dǎo)學(xué)生閱讀原始實驗論文，組織小組討論，為學(xué)生營造了一種主動學(xué)習(xí)的氛圍，培養(yǎng)了學(xué)生的綜合思考能力和分析解決問題的能力，促進(jìn)了學(xué)生掌握前沿知識技術(shù)。

[1]王培新，張 丹，尚愛加，等. 組織透明技術(shù)[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2016，32(1):124-128.

[2]TOMER R, YE L, HSUEH B, et al. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues [J]. Nature Protocols, 2014， 9(7)：1682-1697.

[3]HAMA H, KUROKAWA H, KAWANO H，et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain [J]. Nature Neuroscience， 2011, 14(11): 1481-1488.

[4]EPP J R，NIIBORI Y，HSIANG H L，et al. Optimization of CLARITY for clearing whole-brain and other intact organs [J]. eNeuro, doi:10.1523/ENEURO.0022-15.2015.

[5]劉 陽，董樹剛. 植物生理學(xué)實驗中溶液培養(yǎng)研究性實驗的建立研究[J].生物學(xué)雜志，2015，32(1): 107-109.

[6]CHUNG K, WALLACE J, KIM S Y, et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems [J]. Nature, 2013，497 (7449):332-337.

[7]SUSAKI E A, TAINAKA K, PERRIN D, et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis [J]. Cell， 2014， 157(3): 726-739.

[8]MILGROOM A, RALSTON E. Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging [J]. Cell Biology International， 2016， 40(4): 478-483.

[9]王大煒，程 韻，王婷婷，等. 采用常規(guī)電泳設(shè)備建立CLARITY透明腦技術(shù)[J]. 生物技術(shù)通訊，2014，25(4): 557-559.

[10]徐 勇，歐陽嘉，李 鑫，等. 新形勢下大學(xué)《生物化學(xué)》教學(xué)方法的思考[J].生物學(xué)雜志，2010，27(6)：103-105.

The establishment and teaching practice of CLARITY transparent brain experiment system

CHEN Xiao-ping, SHEN Zi-hao

(College of Biological Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China)

CLARITY transparent brain technique is a cutting-edge experimental method in animal morphological investigation, which is lack of performing experiences in undergraduate student teaching. In this study, authors reconstructed the technical flow scheme to adapt undergraduate students according the current existing laboratory condition. By teaching practice, the students were trained in comprehensive studying ability and obtained advanced experimental skills.

CLARITY technique; experimental system; teaching practice

2016-04-14；

2016-04-21

國家自然科學(xué)基金項目(No.81241097)；浙江工業(yè)大學(xué)實驗室工作研究與改革項目(G1460413719900)

陳曉萍，博士，教授，從事神經(jīng)毒理與神經(jīng)藥理研究，E-mail:chxp@zjut.edu.cn

Q954;G642.4

C

2095-1736(2017)01-0123-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.123