藥用昆蟲金環(huán)胡蜂及其混偽品DNA條形碼鑒別研究＊

許凱歌，陳壯志，楊自忠，郭云膠，李成功，趙昱，張成桂

（1.大理大學云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室大理671000；2.北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司北京101318；3.大理大學中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用2011協(xié)同創(chuàng)新中心大理671000；4.大理大學藥學與化學學院大理671000；5.德宏師專食用昆蟲研究所德宏678400）

藥用昆蟲金環(huán)胡蜂及其混偽品DNA條形碼鑒別研究＊

許凱歌1，4＊＊，陳壯志1，2，楊自忠1，3，郭云膠3，5，李成功1，3，趙昱1，3，張成桂1，3

（1.大理大學云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室大理671000；2.北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司北京101318；3.大理大學中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用2011協(xié)同創(chuàng)新中心大理671000；4.大理大學藥學與化學學院大理671000；5.德宏師專食用昆蟲研究所德宏678400）

目的：以COI序列作為DNA條形碼對藥用昆蟲金環(huán)胡蜂及其混偽品進行物種鑒別，探討快速、準確鑒別金環(huán)胡蜂及其混偽品的方法。方法：以COI條形碼序列為基礎(chǔ)，對金環(huán)胡蜂及其近緣種混偽品黃紋大胡蜂進行總DNA提取、PCR擴增和雙向測序，并比對GenBank中金環(huán)胡蜂及其混偽品的COI序列，繼而用MEGA6.06軟件對所有序列進行分析、計算種內(nèi)及種間遺傳距離，并用鄰接（Neighbor-Joining，NJ）法構(gòu)建出系統(tǒng)進化樹。結(jié)果：金環(huán)胡蜂及黃紋大胡蜂COI序列擴增成功。金環(huán)胡蜂與其混偽品COI序列種間最小遺傳距離為0.152±0.017，遠大于金環(huán)胡蜂種內(nèi)的最大遺傳距離0.009±0.004。構(gòu)建出的系統(tǒng)進化樹圖也明確顯示，各物種都形成了獨立的分支。結(jié)論：基于COI序列的DNA條形碼技術(shù)可有效鑒別藥用昆蟲金環(huán)胡蜂及其混偽品，為其質(zhì)量控制和市場監(jiān)管提供了新的技術(shù)手段，保證金環(huán)胡蜂相關(guān)藥材的安全性。

金環(huán)胡蜂DNA條形碼COI序列物種鑒別

金環(huán)胡蜂（Vespa mandarinia Smith）為膜翅目（Hymenoptera）胡蜂科（Vespidae）胡蜂屬（Vespa）中體型最大、性情兇猛的捕食性肉食昆蟲，俗稱“虎頭蜂”[1]，也稱中華大虎頭蜂、斑胡蜂、桃胡蜂、人頭蜂等。其幼蟲、全體、蜂毒及蜂巢均可入藥，藥材名大黃蜂（全體）、大黃蜂子（幼蟲）、露蜂房（蜂巢），主治風濕痹痛，是常見民間中藥[2]。金環(huán)胡蜂泡酒制成的蜂毒酒能夠祛風濕，治急性和慢性風濕痛以及風濕性關(guān)節(jié)炎，與其幼蟲（大黃蜂子）功效相同[3，4]，在中國民間有著悠久的使用歷史。對胡蜂科昆蟲藥理活性研究中，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自云南省的不同種胡蜂體內(nèi)能夠分泌不同強度的活性多肽，可用于制備防治缺血性心腦血管疾病及由腦梗塞損傷帶來的偏癱后遺癥等[5-8]。

胡蜂具有較高的藥用及食用價值，但由于缺乏權(quán)威、便捷的物種鑒定手段，導致大量混偽品涌入藥材市場。入藥胡蜂的種類不同，其所含的有效成分和藥用功效也會有所不同，因此不宜彼此混淆和替代，而需要給予準確的鑒定和細致的劃分。傳統(tǒng)的物種鑒定主要依賴于專業(yè)的昆蟲分類學家花費大量時間和精力整理積累后所描述的形態(tài)特征，不僅費時費力，也常受主觀因素干擾，極易混淆出錯[9]。而且種類相近昆蟲的卵、蛹、幼蟲、成蟲的蟲體形態(tài)特征差異小，有些特征在不同的發(fā)育時期不夠穩(wěn)定，在鑒定分類上增加了難度[10]。另外，傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定是基于物種形態(tài)特征的細微差別，如果物種在貯藏、加工炮制的過程中形態(tài)被破壞，會大大降低鑒定結(jié)果的可信度[11]。金環(huán)胡蜂常以幼蟲和炮制品入藥，藥材在加工、貯藏的過程中會造成蟲體殘破，致使以傳統(tǒng)形態(tài)學的方法鑒別金環(huán)胡蜂及其混偽品面臨巨大的挑戰(zhàn)，因此需要建立一種更加快速和準確的方法。

近年來，通過測定某一個或幾個基因片段的核苷酸序列進行物種鑒定和區(qū)分的DNA條形碼（DNA barcode）技術(shù)得到了迅速的發(fā)展和應(yīng)用[12,13]。2003年，PaulHebert首次提出將一段長度約為650 bp的線粒體細胞色素C氧化酶I（MitochondrialCytochrome Coxidase Subunit I，COI）基因片段作為動物的分子鑒定標記。研究發(fā)現(xiàn)利用物種間COI基因序列的變異能夠較好地鑒別物種，隨后COI基因被公認為動物界中標準的DNA條形碼基因[14]。本研究利用COI序列對藥用昆蟲金環(huán)胡蜂及其常見混偽品進行DNA條形碼鑒別研究，以期為金環(huán)胡蜂藥材快速準確鑒定提供分子水平的依據(jù)和方法，也為臨床用藥安全奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試藥

MyCycler Thermal Cycler型PCR儀（美國BIORAD生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司，序列號：580BR 12204）；DYCP-31DN電泳儀（北京市六一儀器廠，批號：20130816）；InGeniusLHR凝膠成像系統(tǒng)（美國基因有限公司，序列號：SYIGLHR/1478）；HWS12恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司生產(chǎn)，序列號：131022035）。

2×Taq PCR MasterMix（內(nèi)含0.1U Taq聚合酶，500μmol·L-1脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP），20mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷-鹽酸[Tris-HCl，pH=8.3），100mmol·L-1氯化鉀（KCl），3mmol·L-1氯化鎂（MgCl2）]（北京天根生化科技有限公司，批號：03106）；引物LCO1490（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，批號：8400432886）；引物HCO2198（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，批號：8405504355）；DNAMarker D（100-2 000 bp）（包括100、250、500、750、1 000、2 000 bp的DNA片段，BBI生命科學有限公司生產(chǎn)，批號：B415KAO150）；TE緩沖液（北京天根生化科技有限公司，批號：03211）。

1.2 材料

本實驗所用金環(huán)胡蜂及其混偽品總計4個種21份樣品，其中包括12份實驗樣品和9份GenBank序列，經(jīng)中國科學院昆明動物研究所董大志教授鑒定，標本均保存于大理大學昆蟲生物醫(yī)藥研究院。金環(huán)胡蜂及其混偽品詳細信息見表1。

表1 實驗樣品（金環(huán)胡蜂及其混偽品）及GenBankk來源序列信息

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取方法

從無水乙醇中取出實驗樣品，每只昆蟲均舍棄腹部，取其胸部或頭部肌肉組織約0.1 g，并進行唯一性編號。然后，對實驗樣品的肌肉組織進行總DNA提取，具體步驟如下：

（1）研磨及水浴

將昆蟲肌肉組織剪碎，加入480μL的STE溶液（0.05mol·L-1Tris-HCl，pH=7.0-8.0；0.1mol·L-1EDTA，pH=7.0-8.0；0.1mol·L-1NaCl）、60μLSDS（5%）溶液和60μL蛋白酶K溶液（2mg·L-1），用石英杵研磨徹底，放入56℃恒溫水浴鍋中，消化至混合液變清亮為止。

（2）酚抽提

在混合液中加入500μL平衡酚溶液，上下顛倒10次，10 000 rpm離心10min，取上清液。酚抽提操作兩次。

（3）氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提

步驟（2）中得到的上清液中加入500μL的氯仿∶異戊醇，上下顛倒10次，10 000 rpm離心10min，取上清液。

（4）沉淀DNA

往步驟（3）中得到的上清液中加入1mL預冷無水乙醇（-20℃）并凍存于-20℃冰箱2 h，12 000 rpm離心10min，棄上清液。

（5）洗滌DNA

用1mL 70%乙醇洗滌步驟（4）得到的沉淀，離心，棄上清液，洗滌兩次。

（6）溶解DNA

取80-100μL的TE緩沖液溶解步驟（5）得到的沉淀，然后置于4℃冰箱備用。

1.2.2 PCR擴增及測序

以提取的總DNA為模板，運用COI序列通用引物進行擴增。DNA模板2μL；正向引物為LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，反向引物為HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′，各2μL（10μmol·L-1）（上海生工生物工程股份有限公司合成）；PCR擴增體系50μL：含有雙蒸水（dd H2O）19μL，2·Taq PCRMasterMix25μL（內(nèi)含0.1U Taq聚合酶，500μmol·L-1脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP），20mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl，pH= 8.3），100mmol·L-1氯化鉀（KCl），3 mmol·L-1氯化鎂（MgCl2）。PCR擴增程序為：首先94℃預變性3.5min；然后94℃變性35 s，49℃退火35 s，72℃延伸45 s，共33個循環(huán)；最后72℃延伸5min，置4℃保存。

用凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠濃度為1.2%，以D2000 DNA Ladder為分子量標記，將擴增出700 bp左右條帶的PCR產(chǎn)物寄到測序公司進行雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

利用DNAStar軟件對測序結(jié)果進行序列拼接并輔以手工校對，將引物序列去除，然后在NCBI（National Center for Biotechnology Information）庫中以BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）法進行相似性搜索，確保得到的COI序列是本研究的目的序列。最后，將所有序列用軟件MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）6.06比對，分析其特異性位點并基于K2P模型進行遺傳距離分析。同時，用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，利用Bootstrap（1 000次重復）檢驗各分支的支持率。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥用昆蟲金環(huán)胡蜂DNA提取與PCR擴增

實驗結(jié)果表明，金環(huán)胡蜂、黃紋大胡蜂的COI基因片段都可用通用引物擴增出來。PCR產(chǎn)物可以用來測序，測序成功率為100%。

2.2 COI序列特征分析

將所有序列輸入MEGA6.06軟件中的Align by ClustalW進行多重比對，去除冗余位點，最終得到長度為633-660 bp的COI序列，序列中GC含量（堿基G和C含量的總和）的范圍為29.4%-31.9%，平均含量僅為30.9%，明顯小于序列中AT含量（堿基A和T含量的總和）的平均值，存在明顯的A、T偏向性（表2）。所有樣品COI序列中含有保守位點254，變異位點428，自裔位點23，簡約信息位點405，分別占整個序列的37.24%、62.76%、3.7%、64.49%（表3）。另外，COI序列的堿基轉(zhuǎn)換與顛換比值R的平均值為1.016±0.371，大于Holmquist[15]認為的臨界值（約為0.4），說明基因序列的突變未達到飽和，適用于系統(tǒng)發(fā)育分析。

表2 金環(huán)胡蜂及其混偽品序列中COI基因片段分析

表3 COI序列特異性位點分析

2.3 金環(huán)胡蜂及混偽品種內(nèi)及種間遺傳距離分析

基于K2P（Kimura's two Parameter）模型計算金環(huán)胡蜂及混偽品種內(nèi)及種間遺傳距離，結(jié)果如表4所示。由表4可知，所有胡蜂樣品的種內(nèi)平均距離為0.005±0.002，種內(nèi)最大距離為0.019±0.006；種間平均距離0.737±0.060，種間最小距離為0.152±0.017。金環(huán)胡蜂種內(nèi)平均距離為0.004±0.002，遠小于種間平均距離，種內(nèi)最大距離0.009±0.004也遠小于種間最小距離，說明COI基因作為DNA條形碼可以區(qū)分金環(huán)胡蜂與其混偽品。另外，所有胡蜂樣品的種內(nèi)平均距離遠小于種間平均距離；并且所有胡蜂樣品的種內(nèi)最大距離也遠小于種間最小距離，說明COI基因作為DNA條形碼不僅可以區(qū)分金環(huán)胡蜂與其混偽品，也能將不同種的混偽品彼此區(qū)分開來。

表4 種內(nèi)與種間遺傳距離分析

2.4 鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析

基于運用K2P模型計算出的遺傳距離，通過鄰接法（NJ）構(gòu)建金環(huán)胡蜂及其混偽品的系統(tǒng)進化樹，同時利用自檢舉（Bootstrap）1 000次重復檢驗各分支的支持率，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，8個金環(huán)胡蜂樣品及4個GenBank登錄號樣品聚成單系，形成一個獨立的分支，三種混偽品胡蜂也各自聚成單系，都形成了獨立的分支。由此可以看出，此COI序列作為DNA條形碼適用于金環(huán)胡蜂及其混偽品的鑒定。

圖1 基于COI序列和K2P模型構(gòu)建的金環(huán)胡蜂及其混偽品的系統(tǒng)進化樹

3 討論

3.1 COI序列作為DNA條形碼鑒定物種的適用性與局限性

在分子鑒定工作中使用的常見DNA條形碼有線粒體基因18S rRNA、16S rRNA、12S rRNA和COI基因等，而COI基因較rRNA基因有許多優(yōu)點：相對保守性同時有足夠的變異，序列長度合適且可以運用通用引物進行擴增[16]，近年來在不同的生物類群中應(yīng)用該基因鑒定的有效性得到了越來越多的驗證。另外，由于本研究使用的金環(huán)胡蜂、黃紋大胡蜂樣品均非新鮮昆蟲，提取的總DNA降解嚴重，但是擴增效果仍是十分穩(wěn)定并且成功測得序列，其或因COI基因是線粒體DNA，相對于核DNA拷貝數(shù)多且基因組片段小，對降解后DNA進行PCR擴增時所受的影響較小。該結(jié)果也說明了以線粒體基因COI序列作為DNA條形碼標準片段的優(yōu)越性和適用性。而且，本研究根據(jù)COI序列差異得到所有胡蜂樣品種內(nèi)最大距離為0.019± 0.006，明顯小于種間最小距離0.152±0.017，種內(nèi)與種間距離不存在重疊部分，即存在條形碼間隙（Barcoding Gap），滿足了DNA條形碼有效鑒定物種的條件，進而表明了COI序列適用于該物種鑒定的內(nèi)在特征。同時，由鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹可以看出，COI序列作為DNA條形碼能夠進行物種水平的分類鑒定。

盡管如此，COI序列作為DNA條形碼鑒定物種也存在一定的局限性，例如Spering[17]統(tǒng)計了一系列昆蟲COI序列的信息，認為至少有25%的物種不易由DNA條形碼方法進行鑒定和區(qū)分。另外，COI序列長度僅為650 bp左右，信息位點數(shù)目有限，隨著分類階元的升高，序列變異會趨于飽和，堿基的轉(zhuǎn)換顛換比值將小于臨界值，此時就不再適用于分子鑒定分析，也即COI序列作為DNA條形碼對昆蟲屬內(nèi)階元具有較為準確的鑒定效力，而對昆蟲科內(nèi)及更高階元的鑒定分析并無太大的參考價值。

3.2 DNA條形碼分子鑒定方法的優(yōu)勢與展望

相比于以往的分子生物學鑒定方法，如限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA標記（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、微衛(wèi)星標記等，DNA條形碼技術(shù)顯示出通用性高、重復性強的明顯優(yōu)勢。DNA條形碼分子鑒定方法簡單、高效、準確性強，使昆蟲藥材的鑒定過程日趨標準化和系統(tǒng)化，可為保證藥用胡蜂金環(huán)胡蜂及其它昆蟲藥材用藥安全和市場監(jiān)管提供新的方法和思路。

截至目前，用于分子鑒定的DNA條形碼多為線粒體DNA，鑒定效力較易受到物種間的基因雜交、滲透的影響。另外，DNA條形碼數(shù)據(jù)庫雖然在近幾年得到迅猛發(fā)展，但仍有所欠缺，許多物種仍未能實行序列比對鑒定。本研究中的金環(huán)胡蜂DNA條形碼基因片段雖然在全球最大的基因網(wǎng)站GenBank上有豐富的記載，但其它胡蜂比如三齒胡蜂、褐胡蜂、擬大胡蜂等幾乎沒有相關(guān)記載。而不同的胡蜂種類，又具有不同的藥用功效和活性成分，因此，藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心在研究了胡蜂藥材藥理作用及有效部位的同時[5-8]，更致力于發(fā)揮DNA條形碼技術(shù)在藥材辨?zhèn)渭拔锓N鑒定方面的作用[18,19]，一方面增加核基因分子標記的應(yīng)用，解決基因雜交、滲透造成鑒定失誤的問題，使鑒定結(jié)果更加科學合理；另一方面，堅持完善DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，可以展開國際合作與交流，多邊參與，資源共享，以求達到DNA條形碼數(shù)據(jù)庫高質(zhì)量高庫容的要求。

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Identification ofM edicinal Insect Vespamandarinia from ItsAdulterants Using DNA Barcode

Xu Kaige1,4,Chen Zhuangzhi1,2,Yang Zizhong1,3,Guo Yunjiao3,5, LiChenggong1,3,Zhao Yu1,3,Zhang Chenggui1,3
(1.Yunnan ProvincialKey Laboratory ofEntomological BiopharmaceuticalR&D,DaliUniversity,Dali671000,China; 2.Beijing Protein Innovation Company Limited,Beijing 101318,China;3.Yunnan Provincial2011Collaborative Innovation CenterforEntomoceutics,DaliUniversity,Dali671000,China;4.CollegeofPharmacy and Chemistry,Dali University,Dali671000,China;5.InstituteofEdible Insects,Dehong NormalCollege,Dehong 678400,China)

This study aimed at exploring a fastmethod to accurately identify the medicinal insect Vespa mandariniaSmith from its adulterants using DNA barcode and COI sequences.The extracted DNAs from V.mandarinia and its adulterants V.soror were amplified by polymerase chain reaction(PCR)and sequenced bilaterally based on COI barcode sequence investigation.The information of the COI sequencesof V.mandarinia and V.soror were gathered from GenBank. All the sequences were compared and analyzed,and their intraspecific and interspecific genetic distances were calculated using MEGA 6.06.In addition,the phylogenetic treewas established with neighbor-joining(NJ)method.Asa result,the COI sequences of V.mandarinia and V.soror were successfully amplified.Theminimum interspecific distance between V.mandarinia and its adulterants was 0.152±0.017,being considerably larger than themaximal intraspecific distance between V.mandarinia,0.009±0.004.The constructed phylogenetic tree showed an independentbranch for each species.Itwas concluded that the DNA barcode based on COI sequence can efficiently identify V.mandarinia and its adulterants.This study provided an innovative tool for the quality control and market regulation of Chinese materia medica,securing the safemedication of V.mandarinia.

Vespamandarinia,DNA barcoding,COI sequence,species identification

10.11842/wst.2017.02.020

R931.5

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-11-07

修回日期：2016-12-21

＊國家自然科學基金委地區(qū)基金（81360679）：金黃虎頭蜂蜂毒抑制類風濕性關(guān)節(jié)炎炎癥和血管生成的作用機制及物質(zhì)基礎(chǔ)研究，負責人：張成桂；云南省科技廳云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室專項經(jīng)費（2015DG030），負責人：趙昱；云南省教育廳、財政廳2011協(xié)同創(chuàng)新中心項目（[2012]25），負責人：趙昱。

＊＊通訊作者：張成桂，副教授，碩士生導師，主要研究方向：微生物與生化藥學。