肉蓯蓉種子質(zhì)量評價及藥材初加工研究＊

谷彩梅，劉德旺，王增繪，蔡敏＊＊，黃林芳＊＊

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所北京100193；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院呼和浩特010080）

肉蓯蓉種子質(zhì)量評價及藥材初加工研究＊

谷彩梅1，劉德旺2，王增繪1，蔡敏2＊＊，黃林芳1＊＊

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所北京100193；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院呼和浩特010080）

目的：對肉蓯蓉種子質(zhì)量進(jìn)行評價并建立種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)；考察不同初加工方法對肉蓯蓉主要有效成分影響，確定肉蓯蓉的適宜加工方法。方法：以種子千粒重、空胚率、水分含量等方面對肉蓯蓉種子進(jìn)行質(zhì)量評價；分別對冷凍干燥法、自然烘干法和熱風(fēng)循環(huán)烘干法進(jìn)行初加工方法考察，采用HPLC-UV法測定不同初加工方法下肉蓯蓉中苯乙醇苷的含量。結(jié)果：建立肉蓯蓉種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)并根據(jù)評級指標(biāo)將種子分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個等級；通過對加工方法的考察表明最優(yōu)加工方法為冷凍干燥法，該方法有效成分損失少、飲片外形美觀、質(zhì)地酥脆、干燥速度快。結(jié)論：本研究結(jié)果為肉蓯蓉種子資源的質(zhì)量控制提供參考，也為肉蓯蓉鮮品的初加工方法提供了科學(xué)依據(jù)。

肉蓯蓉種子質(zhì)量發(fā)芽率冷凍干燥法苯乙醇苷

肉蓯蓉Cistanche deserticola Y.C.M，又稱荒漠肉蓯蓉，為列當(dāng)科多年生全寄生植物，被譽為“沙漠人參”，是中國西北荒漠地區(qū)特有的名貴補益類中藥材（圖1）。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補腎陽、益精血、潤腸通便等功效；用于陽痿、不孕、腰膝酸軟、筋骨無力、腸燥便秘等癥，為歷代使用頻度最高的補腎陽藥物之一[1]。肉蓯蓉屬植物全世界約有20種，分布于歐亞溫暖的干燥地區(qū)，從歐洲的伊比利亞半島經(jīng)非洲北部，亞洲的阿拉伯半島、伊朗、阿富汗、蒙古等地區(qū)，到中國的西北部。在中國，肉蓯蓉主要自然分布于內(nèi)蒙古、甘肅及新疆北部[2,4]。肉蓯蓉含有苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜及其苷類、木脂素及其苷類、酚苷類、單萜苷類、生物堿類、糖類、糖醇類、甾醇類及揮發(fā)性成分等多種類型化學(xué)物質(zhì)[5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，肉蓯蓉具有提高性功能、抗衰老、抗氧化、保護(hù)肝臟、提高學(xué)習(xí)記憶、抗阿爾茨海默病及帕金森病[6]、通便等多方面的藥效作用。廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代中醫(yī)臨床處方、中成藥和保健品，已研發(fā)上市有治療阿爾茨海默病的中成藥蓯蓉總苷膠囊、復(fù)方蓯蓉益智膠囊以及肉蓯蓉酒和肉蓯蓉茶等藥品和保健品，近年來，肉蓯蓉主要作為營養(yǎng)補充劑食用[7-11]。

隨著經(jīng)濟發(fā)展和人民保健需求的不斷增加，肉蓯蓉的需求量不斷上升，野生肉蓯蓉的采挖量迅猛增加。由于過度開發(fā)利用，野生資源瀕臨枯竭，肉蓯蓉及其寄主梭梭已被列為國家二級保護(hù)植物，列入《國際野生植物保護(hù)名錄》[12]。國內(nèi)外學(xué)者對肉蓯蓉的田間接種、栽培等已做了許多研究[13-16]，但對肉蓯蓉種子質(zhì)量和發(fā)芽條件的研究還較少，尚未建立科學(xué)的種子質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)。肉蓯蓉的傳統(tǒng)加工方法費工費時，受自然條件的影響，質(zhì)量不穩(wěn)定，嚴(yán)重影響藥材的質(zhì)量和利用；同時傳統(tǒng)的加工方法已經(jīng)不能滿足產(chǎn)地大量藥材初加工的需要；肉蓯蓉產(chǎn)地加工的相關(guān)研究報道較少，既有研究主要集中在傳統(tǒng)的趁鮮切片工藝研究方面，尚沒有研究全面分析評價加工方法的優(yōu)劣。因此，如何提高珍惜瀕危藥材肉蓯蓉的利用率，綜合評價初加工工藝并制定符合產(chǎn)地大量藥材初加工的方法，以保證藥材質(zhì)量穩(wěn)定可靠以及資源的可持續(xù)利用，是亟待解決的關(guān)鍵問題。

本研究以阿拉善肉蓯蓉基地采集的半野生撫育種子和鮮品藥材為研究對象，采用多指標(biāo)綜合評價方法，對肉蓯蓉種子質(zhì)量及鮮品初加工方法技術(shù)進(jìn)行了研究。本研究結(jié)果有利于解決當(dāng)前生產(chǎn)實踐的實際問題，有利于保證藥材品質(zhì)，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，為人工栽培肉蓯蓉提供技術(shù)參考，使肉蓯蓉的加工適應(yīng)于現(xiàn)代化生產(chǎn)，有著重要的社會效益和良好的經(jīng)濟效益。

1 材料

1.1 實驗材料

肉蓯蓉種子于2013年從阿拉善肉蓯蓉基地收集，總計20批次，種子過0.7mm篩，實驗前于4℃低溫貯藏一個月。肉蓯蓉鮮品藥材于2013年采自阿拉善肉蓯蓉基地，總計36批次，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所黃林芳教授鑒定為列當(dāng)科植物肉蓯蓉C.deserticola Y.C.Ma。

1.2 儀器與試劑

日本OLYMPUS體式鏡（型號：SZ2-ILST）；載玻片；智能人工氣候箱（PRX多段系列，寧波海曙賽福實驗儀器廠）；美國Waters高效液相色譜儀：1525 HPLC系統(tǒng)、Waters On-line Degasser AF型在線脫氣機、Waters1525型二元泵、Waters717型自動進(jìn)樣器、恒溫柱箱、Waters 2487雙波長紫外檢測器、Breeze色譜工作站。哇哈哈純凈水，超聲槽（昆山超聲儀器公司，型號：KQ-400DE），0.22μm有機系濾膜，抽濾儀，1mL醫(yī)用注射器，高速萬能粉碎機，電子天平（瑞士METTLER TOLEDO，型號：AL204-IC），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司，型號：DGG-9070B），冷凍干燥機（上海皓莊儀器有限公司，型號：FD-A10N-50）。

氟啶酮試劑（批號：14032001）購買于上海一基實業(yè)有限公司，用丙酮配制。培養(yǎng)皿、濾紙均購于化學(xué)試劑與耗材商店。松果菊苷（批號：MUST-14080710）和毛蕊花糖苷（批號：MUST-14070110）對照品購買于成都曼思特生物科技有限公司，乙腈（色譜純，美國Fisher公司），純水（哇哈哈飲用純凈水），甲醇（分析純，北京化工廠），甲酸（分色譜純，北京化工廠）。

圖1 阿拉善肉蓯蓉半野生撫育基地肉蓯蓉花期

2 種子質(zhì)量評價

2.1 不同濃度質(zhì)量氟啶酮對種子發(fā)芽率影響

實驗玻璃器具、濾紙、蒸餾水、鑷子等用高壓濕熱滅菌鍋滅菌，在烘箱內(nèi)干燥待用。超凈臺紫外滅菌15min待用，實驗操作在超凈臺內(nèi)完成。精確稱取1.5 mg氟啶酮粉末，1-2滴丙酮溶液溶解粉末，在100mL容量瓶中定容，配制成15mg·L-1母液，稀釋成所需濃度，分別為1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0mg·L-1。將肉蓯蓉種子分級后，選取直徑大于0.7mm的種子100粒，將種子用70%乙醇溶液浸泡2min后，2%次氯酸鈉消毒20min，蒸餾水沖洗，待用。將消毒后的種子放入75mm，盛有3-5mL不同濃度氟啶酮溶液的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放2層濾紙，用封口膜密封，用鋁箔紙包裹，智能人工氣候箱中恒溫25℃下黑暗培養(yǎng)，30天統(tǒng)計發(fā)芽率。每個濃度設(shè)3個重復(fù)。

2.2 千粒重的測定

在每一批次種子中隨機取1 000粒凈種子，用電子天平稱重，精確到0.1mg，重復(fù)3次。

2.3 種子空胚率的測定

用鑷子數(shù)取每批種子各100粒，用蒸餾水浸泡24 h后，于載玻片上壓出種胚，統(tǒng)計有胚種子與無胚種子的百分率，重復(fù)3次，凡有胚的種子為飽滿種子，無胚種子為空癟種子。

2.4 種子水分含量的測定

取肉蓯蓉凈種子0.1 g，置小稱量瓶內(nèi)，分析天平稱重記錄，放于105±2℃恒溫烘箱烘干至恒重后稱重，計算種子水分含量，重復(fù)3次。

2.5 發(fā)芽率測定

參照“2.4”項下方法操作，使用最佳質(zhì)量濃度氟啶酮做預(yù)處理，對20批肉蓯蓉種子做發(fā)芽率測定。

3 鮮品肉蓯蓉產(chǎn)地初加工研究

3.1 色譜條件

采用Waters-C18色譜柱（3.9 mm×150 mm，4.6μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序為：線性梯度洗脫程序：0-10min，28%A，10-25min，28%→40%A。流速為1mL·min-1；紫外檢測波長254 nm。

3.2 肉蓯蓉切片樣品的制備

將新鮮的12份肉蓯蓉樣品清洗干凈，均勻切成厚度為5mm的薄片，每份樣品隨機分成3組（自然風(fēng)干ZRC1-12，熱風(fēng)循環(huán)烘干HRC1-12，冷凍干燥DRC1-12），分別對每一份樣品的3組做自然風(fēng)干、熱風(fēng)循環(huán)烘干（80℃）和冷凍干燥處理，備用。

3.3 對照品和供試品溶液的制備

精密稱取松果菊苷和毛蕊花糖苷對照品適量，加50%甲醇于2mL容量瓶至刻度，振搖混合均勻備用。配制成每1mL含1.20mg毛蕊花糖苷和1.34mg松果菊苷的母液，然后按照一定比例稀釋成0.2mg·mL-1的對照品溶液。取經(jīng)不同加工方法處理后的干燥飲片，粉碎，過3號篩。精密稱取藥材粉末1 g置于帶瓶塞的錐形瓶中，加50%甲醇約50mL溶解，超聲處理30min放置至室溫，補足失重，取上清液用微孔濾膜（0.45μm）濾過，作為供試品溶液。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取2組混合對照品液10μL進(jìn)樣，每一個濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄各峰峰面積，取3次進(jìn)樣平均值。以各化合物峰積分面積為Y軸，以化合物濃度為X軸作圖，得到各線性回歸方程，毛蕊花糖苷的為y=14 458 767.78x-1 595.25，r=1顯示在0.006 5-0.200 0mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；松果菊苷的為y=14 458 767.78x-1 595.25，r=1顯示在0.006 5-0.200 0mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3.4.2 提取方法考察

比較了甲醇和流動相兩種提取溶劑，確定以50%甲醇為提取溶劑。

3.4.3 穩(wěn)定性和精密度試驗

對同一樣品溶液，在26 h內(nèi)每隔4 h測定一次，毛蕊花糖苷和松果菊苷的RSD%分別為0.30和0.70，同時表明精密度試驗合格。

3.4.4 重復(fù)性試驗

精密稱取同一樣品粉末5份，按“3.3”項下方法制備5份溶液，以上述色譜條件測定，松果菊苷峰面積的RSD%為0.62，毛蕊花糖苷的RSD%為1.24。

3.4.5 加樣回收率試驗

精密稱取已測得含量的樣品適量，共5份，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入相應(yīng)的對照品溶液，加50%甲醇補足至25mL，稱定重量，按“3.3”項下方法操作，制備成5份樣品溶液，按測定方法測定。以測得的峰面積計算含量及回收率，結(jié)果為平均回收率：毛蕊花糖苷98.77%（RSD%為1.80）；松果菊苷為97.00%（RSD%為1.20）。

按“3.3”項下方法操作制備不同加工方法共36個樣品溶液，以色譜條件項下進(jìn)行測定。

4 結(jié)果與分析

4.1 氟啶酮質(zhì)量濃度對種子發(fā)芽的影響

隨著氟啶酮濃度的越大，種子的發(fā)芽率呈增大趨勢，氟啶酮濃度為10mg·L-1種子發(fā)芽率最高，但當(dāng)濃度＞10mg·L-1時，隨著濃度的增大發(fā)芽率反而減小。在整個發(fā)芽過程中，很多也存在發(fā)霉情況。詳見圖2。

4.2 肉蓯蓉種子質(zhì)量測定結(jié)果

根據(jù)表1得知本實驗用20批荒漠肉蓯蓉種子的千粒重在0.093 9-0.156 9 g范圍內(nèi)，平均值為0.121 0 g；含水量在4.9%-7.4%范圍，平均值為6.2%；空胚率在13%-29%范圍，平均值為20.3%；發(fā)芽率在37%-52%范圍，平均值為45.05%。

4.3 種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)的制定

以肉蓯蓉種子發(fā)芽率、千粒重、空胚率和含水量4項指標(biāo)進(jìn)行K類中心聚類分析，最終聚類中心值見表2。

圖2 培育10天的肉蓯蓉種子發(fā)芽以及發(fā)霉情況

表1 肉蓯蓉種子質(zhì)量測定結(jié)果

表2 K類中心聚類的最終類中心值

表3 肉蓯蓉種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)

由表2可知，發(fā)芽率3個類中心值分別為50%、43%和41%；千粒重3個類中心值分別為0.126 4、 0.109 3和0.106 7；空胚率3個類中心值分別為16%、20%和25%；含水量的3個類中心值分別為6.2%、6.3%和6.2%。以肉蓯蓉種子發(fā)芽率、千粒重、空胚率和含水量4項指標(biāo)的聚類中心值作為肉蓯蓉種子分級標(biāo)準(zhǔn)的參考值，結(jié)合生產(chǎn)實際和可操作性，在此基礎(chǔ)上初步制定了肉蓯蓉種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)，即：Ⅰ級肉蓯蓉種子外形應(yīng)飽滿，有光澤，大小均勻；Ⅱ級種子外形較飽滿，略有光澤，大小較均勻，有少許癟粒；Ⅲ級種子無光澤，大小不均勻，有部分癟粒。詳見表3。

4.4 經(jīng)過3種不同加工方法得到肉蓯蓉干燥品

由于我國養(yǎng)老地產(chǎn)處于初級發(fā)展階段，未形成有序的規(guī)模，經(jīng)驗不足，尤其是養(yǎng)老地產(chǎn)相關(guān)的法律法規(guī)和養(yǎng)老服務(wù)標(biāo)準(zhǔn)等缺失或尚不完善，社會資本在運作養(yǎng)老地產(chǎn)項目時，會遭遇較大的瓶頸和障礙。

如圖3所示，應(yīng)用冷凍干燥法處理的樣品外形較規(guī)整美觀，熱風(fēng)循環(huán)烘干法處理的樣品，外形顏色略暗，美觀度較差；自然風(fēng)干法處理的樣品外形顏色暗，美觀度較差。

圖3 不同加工方法的肉蓯蓉干燥切片

肉蓯蓉中苯乙醇苷的含量測定及HPLC色譜圖檢測結(jié)果詳見表4、圖4。

表4 肉蓯蓉中苯乙醇苷含量測定結(jié)果

5 討論

5.1 肉蓯蓉種子質(zhì)量的評價及種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

促進(jìn)肉蓯蓉種子萌發(fā)的氟啶酮最佳濃度為10mg·L-1，平均發(fā)芽率約為50%。影響種子質(zhì)量的因素中隨著空胚率的減小千粒重呈增大趨勢。種子發(fā)芽過程中部分種子發(fā)生霉變，可能是種子消毒不徹底或?qū)嶒灢僮鬟^程中染菌所致。在實際生產(chǎn)中，應(yīng)選擇千粒重大、飽滿度好的種子、適宜濃度的萌發(fā)刺激物、適宜的培養(yǎng)溫度，還要注意培養(yǎng)過程無菌操作，以得到較高的發(fā)芽率。

圖4 肉蓯蓉混合對照品和樣品的HPLC色譜圖

種子質(zhì)量包含內(nèi)在和外在的指標(biāo)。本研究以發(fā)芽率、千粒重、空胚率和含水量4項指標(biāo)制定了肉蓯蓉種子質(zhì)量的分級標(biāo)準(zhǔn)。分級方法采用最低定級原則，即任何一項指標(biāo)不符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)都不能作為相應(yīng)等級的合格種子。在分級的四項指標(biāo)中，發(fā)芽率最為重要，千粒重可反映種子飽滿程度和種子成熟度等。而含水量則可通過再加工如干燥等來提高質(zhì)量。本分級標(biāo)準(zhǔn)中以發(fā)芽率、千粒重兩個指標(biāo)為主判斷種子質(zhì)量，空胚率、含水量次之。

5.2 新鮮肉蓯蓉產(chǎn)地初加工研究

本研究對3種不同加工方法：自然干燥，熱風(fēng)循環(huán)烘干和冷凍干燥進(jìn)行考察，結(jié)果表明最優(yōu)加工方法為冷凍干燥法。該方法有效成分損失少、飲片外形美觀、質(zhì)地酥脆、干燥速度快，但缺點是加工成本高；其次是熱風(fēng)循環(huán)烘干法，該方法有效成分有部分損失，外形顏色略暗，質(zhì)地較硬，干燥速度一般，加工成本略高；3種方法中最差的是自然風(fēng)干法，有效成分大部分損失，外形顏色暗，由于含糖量高易產(chǎn)生霉變，粉碎處理麻煩，干燥速度慢，優(yōu)點是加工成本低。中藥材企業(yè)或種植基地應(yīng)綜合考慮社會效益、經(jīng)濟效益及自身實際情況選擇最合適的加工方式。

1國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2015.

2屠鵬飛,姜勇,郭玉海,等.肉蓯蓉研究及其產(chǎn)業(yè)發(fā)展.中國藥學(xué)雜志,2011,46(12)：882-887.

3黃林芳,鄭司浩,武拉斌,等.基于化學(xué)成分及分子特征中藥材肉蓯蓉生態(tài)型研究.中國科學(xué)：生命科學(xué),2014,44(3)：318-328.

4 Zheng S,Jiang X,Wu L,et al.Chemical and genetic discrimination of Cistanches Herba baesd on UPLC-QTOF/MS and DNA barcoding. PLoSOne,2014,9(5)：e98061.

5劉曉明,姜勇,孫永強,等.肉蓯蓉化學(xué)成分研究.中國藥學(xué)雜志, 2011,46(14)：1053-1058.

6 Gu C,Yang X,Huang L.Cistanches herba：A neuropharmacology review.FrontPharmacol,2016,7：289.

7陳志偉,祝彼得,許惠玉.肉蓯蓉多糖對骨髓抑制性貧血小鼠造血調(diào)控的實驗研究.中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2007,25(7)：1473-1474.

8 Choi J G,Moon M,Jeong H U,et al.Cistanches Herba enhances learning andmemory by inducing nerve growth factor.Behav Brain Res, 2011,216：652-658.

9 Geng X,Tian X,Tu P,et al.Neuroprotective effects of echinacoside in themouse MPTPmodel of Parkinson's disease.Eur JPharmacol,2007, 564：66-74.

10尹剛,龔道愷,劉幫會,等.肉蓯蓉多糖對阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦組織膽堿能系統(tǒng)的影響.神經(jīng)損傷與功能重建,2014,9(5)：426-427.

11黃林芳,李文濤,王冬梅,等.基于UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)研究酒蓯蓉增效的物質(zhì)基礎(chǔ).中草藥,2013,44(24)：3471-3475.

12曹瑞,馬虹,王迎春.名貴藥材肉蓯蓉原植物形態(tài)的多樣性研究.中國中藥雜志,2004,29(1)：35.

13陳慶亮,武志博,郭玉海,等.荒漠肉蓯蓉及其寄主梭梭栽培技術(shù).中國現(xiàn)代中藥,2015,17(4)：359-368.

14屠鵬飛,郭玉海,陳慶亮,等.荒漠肉蓯蓉及其寄主梭梭栽培技術(shù).北京：科學(xué)出版社,2015.

15宋加錄,張玉芹.肉蓯蓉的栽培與采收.中國野生植物資源,1994,21 (2)：59-60.

16楊太新,王華磊,王長林,等.管花肉蓯蓉田間接種技術(shù)的研究.中國中藥雜志,2005,34(7)：488.

A Study on the Seed Quality and Primary Processing of the Fresh Productof Cistanche deserticola

Gu Caimei1,Liu Dewang2,Wang Zenghui1,CaiMin2,Huang Linfang1
(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,Chinese Academy ofMedical Sciences＆Peking Union MedicalCollege, Beijing 100193,China;2.SchoolofPharmacy,InnerMongolia MedicalUniversity,Huhhot010080,China)

The aim of this study was to evaluate the seed quality of C.deserticola and establish quality grading rules of seeds by detecting the impacts of different processing methods on the contents of the effective components of C. deserticola for optimizing the suitable processingmethod.The seed qualitywas judged by thousand-kernelweight,empty embryo rate and water content.The sampleswere preliminary processed by freeze-drying,natural drying and hotair circulation drying respectively,and the content of phenylethanoid glycosides was determined by HPLC-UV.The seed quality classification standard of C.deserticola was established,and the seeds were divided into three grades based on the standard.Itwas found that freeze-dryingmethod was optimum,featuring less effective component loss,beautiful appearance of herbal piece,crisp texture and fast drying.In conclusion,this study laid a foundation for the quality control of the seedsof C.deserticola with the provision ofscientific evidence for the initialprocessing of the fresh product.

Cistanchedeserticola,seed quality,germination percentage,freeze-dryingmethod,phenylethanoid glycosides

10.11842/wst.2017.02.019

R28

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-12-13

修回日期：2017-01-09

＊國家自然科學(xué)基金委面上項目(81473315)：地理格局及生態(tài)驅(qū)動揭示肉蓯蓉品質(zhì)生態(tài)型機理，負(fù)責(zé)人：黃林芳。

＊＊通訊作者：蔡敏，副教授，主要研究方向：天然藥物研發(fā)；黃林芳，教授，主要研究方向：中藥資源與質(zhì)量評價研究。