高速逆流色譜在快速篩選中藥天然產(chǎn)物活性成分中的應(yīng)用＊

汪永玲，張寶軍，付文衛(wèi)＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院上海201203；2.中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心上海201203）

高速逆流色譜在快速篩選中藥天然產(chǎn)物活性成分中的應(yīng)用＊

汪永玲1，2，張寶軍1，2，付文衛(wèi)1，2＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院上海201203；2.中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心上海201203）

高速逆流色譜結(jié)合快速生物活性檢測方法，特別適合從中藥和天然產(chǎn)物中篩選活性成分。結(jié)合本課題組的研究和近年研究進(jìn)展，本文綜述了高速逆流色譜在中藥和天然產(chǎn)物中快速篩選活性成分的應(yīng)用進(jìn)展。

高速逆流色譜活性成分快速篩選

活性成分的篩選是發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的重要途徑，也是闡明中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的關(guān)鍵步驟。由于中藥和天然藥物成分復(fù)雜多樣、含量參差不齊、活性成分多不明確，采用色譜技術(shù)分離純化后再進(jìn)行活性評價的傳統(tǒng)方法往往費時、費力，成本高昂。因此，從中藥天然產(chǎn)物中快速篩選活性成分成為一種發(fā)展趨勢。

高速逆流色譜（High-Speed Counter CurrentChromatography，HSCCC）利用被分離物質(zhì)在兩相中的分配差異實現(xiàn)物質(zhì)的高效分離，最大優(yōu)點是無固體支撐相，避免樣品的不可逆吸附、失活等問題，結(jié)合快速的生物活性檢測方法，特別適合從中藥天然產(chǎn)物中快速篩選活性成分[1]。本課題組也在這方面做了一些工作，比如在抗腫瘤、抗病毒活性篩選中的應(yīng)用[2，3]。結(jié)合本課題組的研究和近年來的研究報道，本文綜述了HSCCC在中藥和天然產(chǎn)物中快速篩選活性成分的應(yīng)用進(jìn)展。

1 HSCCC在篩選活性化合物中的應(yīng)用

1.1 HSCCC方法的開發(fā)

在中藥及天然藥物活性成分快速篩選過程中，HSCCC作為一項分離手段，其方法開發(fā)主要包括溶劑系統(tǒng)的篩選和運行方式的選擇。溶劑系統(tǒng)篩選是HSCCC方法開發(fā)中花費時間最多的程序，準(zhǔn)確快速的篩選合適的溶劑體系對于分離活性成分至關(guān)重要。在中藥及天然產(chǎn)物活性成分分離過程中，針對不同的化學(xué)成分，常采用不同的溶劑系統(tǒng)，常用的溶劑系統(tǒng)可參考Ito Y等[4-6]的綜述文獻(xiàn)。在中藥及天然產(chǎn)物活性篩選中，通常活性成分的性質(zhì)并不清楚，常常應(yīng)用梯度洗脫模式以實現(xiàn)不同極性化合物的分離，如Ying H等[7]以正己烷-乙酸乙酯-正丁醇（1：4：0，1：2：0，0：1：0，0：4：1，0：4：2，0：2：2）梯度洗脫模式，從秋葵（Okra）提取物中分離得到抗腫瘤活性化合物；或采用雙向洗脫及洗脫-推出模式以擴展HSCCC的應(yīng)用，如Li L等[8]應(yīng)用雙向洗脫方式篩選可可豆提取物中抗氧化活性成分。

1.2 HSCCC聯(lián)用技術(shù)

在中藥及天然產(chǎn)物快速活性篩選中用到的HSCCC聯(lián)用技術(shù)，主要包括以下幾種：

1.2.1 HSCCC與傳統(tǒng)色譜聯(lián)用

HSCCC與多種色譜技術(shù)（薄層色譜、硅膠柱色譜、大孔樹脂吸附柱色譜、凝膠柱色譜、超濾、超臨界流體萃取、固相萃取等）的聯(lián)合使用，可以提高分離效率。采用薄層色譜結(jié)合HSCCC，還可對分離流份進(jìn)行快速的初步分析。Yang C等[9]采用HSCCC結(jié)合硅膠柱色譜，從黃芪Astragalusaltaicus粗提物中逐級分離得到抗氧化活性的化合物isorhamnetin-3-gentiobioside、rutin以及narcissin。Li L等[10]采用HSCCC結(jié)合大孔樹脂吸附柱色譜、凝膠柱色譜，從紅花Carthamus tinctorius L.粗提物中分離得到羥基紅花黃色素等具有抗氧化活性的化合物。LiS等[11]采用HSCCC結(jié)合超臨界流體萃取從Chaenomelessinensis得到delphinidin-3-O-glucoside、cyanidin-3-O-glucoside、peonidin-3-O-glucoside、delphinidin、peonidin和malvidin。Liu Q等[12]采用固相萃取結(jié)合HSCCC從Rhizoma Chuanxiong中分離得到ferulicacid、protocatechuicacid和senkyunolide A等共11個化合物。

1.2.2 HSCCC與HPLC聯(lián)用

HPLC尤其是HPLC-MS作為一種強大的分析檢測和結(jié)構(gòu)鑒定手段，可以彌補HSCCC分離方法的不足，為HSCCC提供許多其他檢測技術(shù)所不能提供的被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。HSCCC結(jié)合LC/MS是一種分離分析復(fù)雜有機混合物的有效手段。LiS等[13]采用HSCCC結(jié)合超濾-LC-MS從Panax japlcusvar篩選得到具有抑制黃嘌呤氧化酶活性的24(R)-majoroside R1、chikusetsusaponin Iva、oleanolic acid-28-O-beta-D-glucopyranoside、notoginsenoside Fe、ginsenoside Rb2和ginsenoside Rd。Thakur M等[14]從肥皂草Saponaria officinalis粗皂苷混合物中篩選得到靶向增強抗腫瘤毒素的HSCCC流分，結(jié)合ESI-IT-MS導(dǎo)向分離得到活性成分bisdesmodic saponins。Wang Q等[15]利用HSCCC結(jié)合HPLC-ESI-QTOF-MS，從粉葛花Puerariae thomsonii Flos中篩選得到抗前列腺癌細(xì)胞活性成分tectorigenin，IC50為0.08mM。

1.2.3 結(jié)合活性篩選的多維HSCCC的應(yīng)用

HSCCC篩選活性化合物通常選用離線二維模式，經(jīng)過HSCCC分離的流份分別用于活性篩選和后續(xù)研究，如Zeng H等[16]建立離線二維篩選模式應(yīng)用于Semen cassia篩選得到抗氧化活性成分；Zhang Y Q等[17]運用類似方法從廣線金錢草Desmodium styracifolium中分離得到抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性成分C-glycosylflavone；Liu Q等[18]采用牛血清蛋白結(jié)合Fe3O4的磁性納米顆粒用于活性成分的篩選，離線二維HSCCC從Fructuspolygoniorientalis分離得到結(jié)合牛血清蛋白的活性成分。離線二維模式可以達(dá)到較理想的效果，這種模式在活性篩選時，通常將一維的流份進(jìn)行收集，回收溶劑后，再以適當(dāng)?shù)娜軇┤芙夂筮M(jìn)行各種活性的篩選。這種方式可以方便進(jìn)行多種活性的檢測，但操作相對復(fù)雜，且流份的干燥、轉(zhuǎn)移過程可能導(dǎo)致活性成分損失或降解。

為達(dá)到快速篩選的目的，近年來不少研究者發(fā)展了在線的活性篩選模式，通過切換閥、分流器和其他接口技術(shù)等的巧妙應(yīng)用，將HSCCC分離流份進(jìn)行在線的活性檢測、純度分析、結(jié)構(gòu)快速分析鑒定等，大大地拓展了HSCCC的應(yīng)用范圍。如ShiS等[19]建立HSCCC與抗氧化活性檢測在線聯(lián)用的方法篩選Selaginella moellendorffii中抗氧化活性的成分，將HSCCC分離的流份柱后分流，一部分在線與DPPH·溶液進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)行抗氧化活性的檢測，實現(xiàn)了逆流色譜的分離與生物活性分離的同步，從而達(dá)到活性成分快速篩選和分離的目的，是HSCCC聯(lián)用技術(shù)未來發(fā)展的一個重要方向。

2 HSCCC在抗腫瘤活性成分快速篩選中的應(yīng)用

抗腫瘤活性成分常表現(xiàn)為細(xì)胞毒活性、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和分化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，因此通過細(xì)胞毒性測試等可以快速篩選中藥天然產(chǎn)物中的抗腫瘤活性成分，常用MTT法，XTT法和CKK法也有應(yīng)用，近年來，研究人員常運用HSCCC分離所得抗腫瘤活性成分（表1）。

本課題組Han Q B等[3]利用HSCCC結(jié)合HPLC/ ESI/Q-TOF/MS，從藤黃樹脂（Gamboge）中篩選得到2個誘導(dǎo)凋亡的活性流份，成功建立了HSCCC篩選凋亡活性化合物的方法。

Ying H等[7]通過梯度洗脫從秋葵（Okra）提取物中得到carolignan，抑制細(xì)胞增殖的活性最強，對A594、HL-60、MCF-7和HO8910共4種細(xì)胞系IC50均小于10 μM。Thakur等[14]以HSCCC-MS結(jié)合實時細(xì)胞細(xì)胞毒性檢測，從肥皂草Saponaria officinali粗皂苷混合物中篩選得到增強抗腫瘤毒素毒性的活性成分bisdesmodic saponins。LiS等[20]采用HSCCC結(jié)合MTT法從石上柏Selaginella doederleinii Hieron提取物篩選得到amentoflavone和robustaflavone等活性化合物。Cho N等[21]從白樺皮Betula platyphylla中分離得到platyphylloside，IC50小于20μM。LiY等[23]使用反向膠束溶劑系統(tǒng)，經(jīng)HSCCC分離，從苦瓜Momordica charantia中分離得到1個具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)。Jin J[25]將HSCCC-pre-HPLC結(jié)合成骨靶細(xì)胞提取技術(shù)成功應(yīng)用于淫羊藿Herba Epimedii中活性成分的分離。ZhaoW等[26]通過HSCCC梯度洗脫從石榴Punica granatum L.中篩選得到urolithin A和urolithin B，可以降低ROS和丙二醛水平，提高SOD活性，降低結(jié)腸癌的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

表1 應(yīng)用HSCCC篩選得到的抗腫瘤活性化合物

3 HSCCC在抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性成分快速篩選中的應(yīng)用

HSCCC在抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性成分快速篩選中的應(yīng)用也較廣泛，分離所得的抗氧化、免疫和抗炎活性成分見表2。

3.1 抗氧化活性

根據(jù)天然產(chǎn)物對自由基的清除能力或?qū)χ愇镔|(zhì)氧化的抑制能力，評價天然產(chǎn)物的抗氧化活性，常用ABTS自由基陽離子清除能力法（ABTS法）、DPPH自由基清除能力法（DPPH法）、氧自由基吸收量測定法（ORAC法）、鐵離子抗氧化劑能力測定（FRAP法），DPPH-HPLC和HPLC-ABTS的應(yīng)用縮短活性檢測時間，提高了靈敏度和分辨率。

Yang C等[9]采用ABTS法，以HSCCC結(jié)合硅膠柱色譜從黃芪Astragalusaltaicus Bunge粗提物中逐級篩選得到活性化合物isorhamnetin-3-gentiobioside，rutin和narcissin，其中rutin SC50值為22.15mg·mL-1。Li L等[10]采用ABTS法，以HSCCC結(jié)合凝膠柱色譜從紅花Carthamus tinctorius L.中篩選得到羥基紅花黃色素等活性化合物，SC50值范圍是20-80mg·mL-1。Lim SS等[27]采用HSCCC結(jié)合HPLC-ABTS在線自由基清除活性從日本榿木Alnus japonica.粗提物中篩選得到抗氧化活

性成分hirsutanonol 5-O-beta-D-glucopyranoside，3-deoxohirsutenonol5-O-beta-D-glucopyranoside和hirsutenone。Zhou X等[28]采用HSCCC結(jié)合DPPH法，從玉竹Polygonatum odoratum提取物篩選得到3個活性化合物，IC50值范圍3.2-5.2mg·mL-1。Xiao G等[29]采用TLC自顯影法檢測抗氧化活性，以HSCCC從補骨脂果（Psoralea corylifolia fruits）中篩選得到5個黃酮類和3個香豆素類化合物，其中最強活性成分psoralidin IC50為44.7mM。Zhang Y等[30]利用DPPH-HPLC分析抗氧化活性組分，以HSCCC從卷柏Selaginella sinensis活性導(dǎo)向分離得到共8個活性化合物，其中最強活性成分quercetin IC50為3.2mM。Zhang S等[31]采用DPPH法、ABTS法，以HSCCC從葡萄籽提取物篩選得到不同聚合程度的抗氧化活性成分原花青素，發(fā)現(xiàn)活性與花青素的聚合程度相關(guān)。Ma R等[32]采用DPPH-HPLC法，應(yīng)用HSCCC-Sephadex LH-20柱從藤茶（Vine tea）中篩選得到比抗壞血酸抗氧化活性更強的高純度活性化合物，建立了HSCCC-DPPH-HPLC法篩選抗氧化活性成分的方法。

表2 應(yīng)用HSCCC篩選得到的抗氧化、免疫和抗炎活性化合物

3.2 免疫調(diào)節(jié)

Wang J等[33]通過高速逆流色譜對參芪扶正注射液提取物進(jìn)行初步的分離，運用指紋圖譜-動物模型生物活性相關(guān)分析，對參芪扶正注射液中調(diào)節(jié)免疫功能的化合物進(jìn)行分析，通過脾臟指數(shù)、外周白細(xì)胞計數(shù)、骨髓細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞增殖、脾自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞吞噬作用和白介素-2水平評價免疫活性，從中篩選得到黃芪甲苷等5種糖苷類活性組分，具有提高動物的脾臟指數(shù)、外周白細(xì)胞計數(shù)等作用，同時還發(fā)現(xiàn)可能的副作用成分5-羥甲基-2糠醛（5-hydroxymethylfuraldehyde）和黨參炔苷（lobetyolin）。

Li LF等[34]采用促分裂素原活化的外周血單核細(xì)胞（mitogen-activated PBMCs）模型篩選牛肝菌Rubinoboletusballouii中的免疫調(diào)節(jié)劑，以HSCCC分離得到具有免疫抑制活性的成分：1-ribofuranosyl-striazin-2(1H)-one和pistillarin。

3.3 抗炎活性

Fan Y等[35]發(fā)現(xiàn)菝葜Smilax china L.提取物對慢性盆腔炎（Chronic Pelvic Inflammatory Disease，CPID）的動物模型有效，運用HSCCC從中分離得到兩個化合物：Epicatechin和catechin-[8,7-e]-4-beta-(3,4-dihydroxyphenyl)-dihydro-2(3H)-pyranone，以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型證實catechin-[8,7-e]-4β-(3,4-dihydroxyphenyl)-dihydro-2(3H)-pyranone是其主要抗炎活性成分。

4 HSCCC在抑制酶活性成分快速篩選中的應(yīng)用

以抑制酶活性如α糖苷酶、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotension Converting Enzyme，ACE）、乙酰膽堿酯酶、脂肪酸合成酶活性為導(dǎo)向的活性化合物篩選為HSCCC拓展了應(yīng)用范圍，運用HSCCC分離所得抑制酶活性成分見表3。

4.1 抑制血管緊張素酶活性

Zhang YQ等[17]以ACE酶抑制活性[42]為導(dǎo)向，對廣金錢草Desmodium styracifolium一維HSCCC流份進(jìn)行活性檢測，二維循環(huán)HSCCC以硫酸銅作為螯合劑加入流動相，對活性流份進(jìn)行分離，得到5個C型黃酮苷活性化合物。

4.2 抑制α糖苷酶活性

LiS等[36]建立快速篩選α糖苷酶抑制劑的方法，通過超濾，LC-MS結(jié)合從竹節(jié)參Panax japonicus C.A. Meyer提取物中篩選得到抑制α糖苷酶活性的6個皂苷類活性化合物，該方法也可作為預(yù)防和治療糖尿病活性化合物篩選。Zhou X等[37]使用超濾-HPLC用于抑制α糖苷酶活性檢測，通過HSCCC以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1：4：0.8：4.2，1：4：1.8：3.2，1：4：2.3：2.7）梯度洗脫結(jié)合Sephadex LH-20柱對活性組分進(jìn)行靶向分離，從玉竹Polygonatum odoratum提取物得到活性化合物N-trans-p-coumaroyloctopamine和N-trans-p-coumaroyltyramine，抑制α糖苷酶活性的化合物IC50值為2.3、2.7 mM，該方法可從復(fù)雜組分中快速篩選和制備活性化合物和組分。

4.3 抑制蛋白絡(luò)氨酸磷酸化酶活性

Wang M等[38]以分子對接技術(shù)檢測活性，結(jié)合HSCCC從羊棲菜Sargassum fusiforme中篩選得到抑制蛋白絡(luò)氨酸磷酸化酶活性的鄰苯二甲酸二丁酯（dibutylphthalate）。

4.4 抑制脂肪酸合成酶活性

Chen Q等[39]利用HSCCC，氯仿-乙醇-水-乙酸（4：3：2：0.01）溶劑系統(tǒng)，從山茶果殼（Camellia fruithull）乙醇提取物中分離得到ellagic acid，具有抑制脂肪酸合成酶活性，IC50為2.5mg·mL-1。

4.5 抑制磷酸二酯酶活性

ShiSY等[40]采用HSCCC結(jié)合超濾-HPLC-DADMS的配體篩選方法，用同位素兩步分析法測磷酸二酯酶活性，從杜仲皮Eucommia ulmoides bark中篩選得到5個活性成分，其中(+)-pinoresinol-4,4′-di-O-β-D-glucopyranoside和(+)-medioresinol-4,4′-di-O-β-D-glucopyranoside，IC50分別為63.5、42.1μM。

表3 應(yīng)用HSCCC篩選得到的酶抑制活性化合物

4.6 抑制醛糖還原酶活性

Paek JH等[41]以抑制醛糖還原酶活性為導(dǎo)向，HPLC-超濾對比前后色譜峰變化定位活性流份，洗脫-推出模式運行HSCCC從甘松Nardostachyschinensis分離得到活性化合物chlorogenic acid和1,5-di-O-caffeoylquinic acid，IC50分別為3.16、2.98μM。

5 HSCCC在抗細(xì)菌和抗病毒活性成分快速篩選中的應(yīng)用

運用HSCCC分離所得抗菌抗病毒活性成分見表4。

5.1 抗菌活性

Chan BC等[43]采用XTT法[47]進(jìn)行抗菌活性篩選，應(yīng)用HSCCC以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1：1：1：1）為溶劑系統(tǒng)從苦參Sophora flavescens中篩選得到具有抗MRSA的活性化合物kuraridin和sophoraflavanoneG，抗菌活性在6種MRSA菌株中測試，后者M(jìn)IC在2-4μg·mL-1之間，活性強于黃芩苷，kuraridin對于人外周血單核細(xì)胞沒有毒性。Walasek M等[44]采用肉湯稀釋法進(jìn)行抗菌活性篩選，應(yīng)用HSCCC從巨型豬草Heracleum mantegazzianum Sommier&Levier（Apiaceae）分離得到活性化合物xanthotoxin，IC50范圍在0.03-1mg·mL-1之間。SiW等[48]采用抗菌活性篩選，應(yīng)用HSCCC從中國綠茶提取物篩選分離得到抑菌活性化合物epicatechin gallate（ECG）、epigallocatechin gallate（EGCG）、epicatechin（EC）和咖啡因（CN），ECG和EGCG較其他兩個化合物活性好，EGCG抗S.aureus（MSSA）和methicilin-resistant S.aureus（MRSA）的MIC90值分別為58、37 mg·mL-1。Chan BC等[49]從馬齒莧Portulaca oleracea L.篩選得到與紅霉素協(xié)同抗菌（MRSA）活性的linoleic和oleic acids。

5.2 抗病毒活性

本課題組Liu M等[2]應(yīng)用“折扇”模式優(yōu)化分離條件，結(jié)合抗病毒活性篩選，采用HSCCC從知母Anemarrhena asphodeloides中分離得到活性化合物timosaponin B-II，其選擇指數(shù)是陽性對照利巴韋林的40倍。Shia S等[45]研究發(fā)現(xiàn)翼齒六棱菊Laggera pterodonta的水提物具有顯著的抑制病毒復(fù)制的活性，以乙酸乙酯-正丁醇-水（3：2：5）為溶劑系統(tǒng)，采用HSCCC分離得到3個dicaffeoylquinic acids活性成分。ShiSY等[46]采用HSCCC，以抗病毒活性為導(dǎo)向，從剛毛橐吾Ligularia atroviolacea乙酸乙酯部位篩選得到8 beta-hydroxyeremophil-3,7(11)-dien-12,8 alpha,15,6 alpha-diolide和8 beta-methoxyeremophil-3,7(11)-dien-12,8 alpha,15,6 alpha-diolide，均對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg表達(dá)具有抑制作用。它們成功建立了HSCCC快速篩選抗病毒活性成分的方法。

表4 應(yīng)用HSCCC篩選得到的抗菌和抗病毒活性化合物

6 HSCCC在其他活性篩選中的應(yīng)用

運用HSCCC還分離得到抗骨質(zhì)疏松、雌激素活性、舒張血管、抗高血糖等活性成分見表5。

6.1 抗骨質(zhì)疏松

Li J等[50]采用CCK法、ALP酶活性測定、礦物質(zhì)含量測定，應(yīng)用HSCCC從野菊花FlosChrysanthemi Indici乙醇提取物的乙酸乙酯部位分離得到活性化合物acacetin、apigenin、luteolin和linarin，可以提高成骨細(xì)胞增殖和分化，具有潛在的抗骨質(zhì)疏松作用，建立的該方法可以快速篩選抗骨質(zhì)疏松的活性成分。

6.2 雌激素活性

Ying H等[51]采用熒光素酶法（Luciferase assay），HSCCC以正丁醇和乙酸乙酯飽和的水為固定相，流動相選擇正己烷-乙酸乙酯-正丁醇（1：1：0，1：2：0，1：4：0，0：1：1，0：4：1，0：2：1，0：1：1）梯度洗脫，從砂仁Fructusamomi中篩選得到8個具有雌激素活性的化合物，建立的熒光素酶法結(jié)合梯度HSCCC可以快速篩選中藥天然產(chǎn)物中具有雌激素活性的化合物。

6.3 舒張血管作用

Feng ZF等[52]采用動物模型篩選，應(yīng)用HSCCC-大孔樹脂吸附色譜，HSCCC溶劑系統(tǒng)氯仿-甲醇-乙酸-水（2：1：1：1），從黃芪Radix Astragali提取物篩選得到引起血管舒張的活性化合物calycosin-7-O-beta-D-glycoside、formononetin-7-O-beta-D-glycoside、calycosin和formononetin等4個黃酮類化合物。

6.4 抗高血糖

Chen H Y等[53]使用HSCCC結(jié)合傳統(tǒng)色譜從黃連Rhizoma Coptis的乙醇和氯仿提取物中共分離得到13個化合物，對HSCCC流分及所有化合物進(jìn)行細(xì)胞毒性評價和葡萄糖消耗作用，所有化合物均有不同程度的細(xì)胞毒性，同時發(fā)現(xiàn)多組分組合減低毒性并有助于黃連提取物在HepG2細(xì)胞中發(fā)揮抗高血糖作用。

表5 應(yīng)用HSCCC篩選得到的其他活性化合物

7 結(jié)語與展望

HSCCC在快速篩選活性成分的應(yīng)用中展現(xiàn)了獨特的優(yōu)勢：①無固體固定相支撐可避免樣品不可逆吸附，理論回收率可達(dá)100%，避免樣品失活變性，最大限度保留活性成分，保證快速活性篩選的物質(zhì)基礎(chǔ)，為活性篩選提供無損失的樣品制備方法；②HSCCC與活性成分快速篩選的在線聯(lián)用技術(shù)也有所發(fā)展。我們有理由相信，隨著HSCCC與在線篩選聯(lián)用技術(shù)的不斷發(fā)展，HSCCC在快速篩選活性成分的應(yīng)用中會有更廣闊的發(fā)展空間。然而，與其他分離技術(shù)相比，HSCCC也存在著一些不足：在溶劑系統(tǒng)的篩選上要消耗的時間較多，HSCCC與活性成分快速篩選技術(shù)的聯(lián)用方面也有待進(jìn)一步發(fā)展和完善。

1 Lu Y,Berthod A,Hu R,et al.Screening of complex natural extracts by countercurrent chromatography using a parallel protocol.Anal Chem, 2009,81(10)：4048-4059.

2 Liu M,Tao L,Chau S L,et al.Folding fan mode counter-current chromatography offers fast blind screening for drug discovery.Case study：finding anti-enterovirus 71 agents from Anemarrhena asphodeloides.JChromatogrA,2014,1368：116-124.

3 Han Q B,Zhou Y,Feng C,etal.Bioassay guided discovery of apoptosis inducers from gamboge by high-speed counter-current chromatography and high-pressure liquid chromatography/electrospray ionization quadrupole time-of-flightmass spectrometry.J Chromatogr B Analyt TechnolBiomed LifeSci,2009,877(4)：401-407.

4 Ito Y.Golden rulesand pitfalls in selecting optimum conditions for highspeed counter-current chromatography.JChromatogr A,2005,1065(2)：145-168.

5 Ren D B,Qin Y H,Yun Y H,etal.Using nonrandom two-liquidmodel for solvent system selection in counter-current chromatography.J ChromatogrA,2014,1355：80-85.

6 Liang J,Meng J,Wu D,etal.A novel 9×9map-based solvent selection strategy for targeted counter-current chromatography isolation of natural products.JChromatogrA,2015,1400：27-39.

7 Ying H,Jiang H,Liu H,et al.Ethyl acetate-n-butanol gradient solvent system for high-speed countercurrent chromatography to screen bioactive substances in okra.JChromatogrA,2014,1359：117-123.

8 Li L,Zhang S,Cui Y,et al.Preparative separation of cacao bean procyanidins by high-speed counter-current chromatography.JChromatogrBAnalytTechnol Biomed LifeSci,2016,1036-1037：10-19.

9 Yang C,Yang Y,Aisa H A,et al.Bioassay-guided isolation of antioxidants from Astragalus altaicus by combination of chromatographic techniques.JSep Sci,2012,35(8)：977-983.

10 Li L,Yang Y,Hou X,etal.Bioassay-guided separation and purification of water-soluble antioxidants from Carthamus tinctorius L.by combination of chromatographic techniques.Sep Purif Technol,2013, 104：200-207.

11 Li S,Guo L,Liu C,et al.Combination of supercritical fluid extraction with counter-current chromatography to isolate anthocyanidins from the petals of Chaenomeles sinensis based on mathematical calculations.J Sep Sci,2013,36(21-22)：3517-3526.

12 Liu Q,Zhou J,Yu J,et al.Systematic and efficient separation of 11 compounds from Rhizoma Chuanxiong via counter-currentchromatographysolid phase extraction-counter-current chromatography hyphenation.J ChromatogrA,2014,1364：204-213.

13 Li S,Tang Y,Liu C,et al.Development of a method to screen and isolate potential xanthine oxidase inhibitors from Panax japlcus var via ultrafiltration liquid chromatography combined with counter-current chromatography.Talanta,2015,134：665-673.

14 Thakur M,Jerz G,Tuwalska D,et al.High-speed countercurrent chromatographic recovery and off-line electrospray ionization mass spectrometry profiling of bisdesmodic saponins from Saponaria officinalis possessing synergistic toxicity enhancing properties on targeted antitumor toxins.JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2014,955-956：1-9.

15 Wang Q,Cheng X-L,LiH,etal.Application of an efficient strategy for discovery and purification of bioactive compounds from Chinese herbal medicines,a case study on the Puerariae thomsonii Flos.J Pharm Biomed Anal,2013,75：25-32.

16 Zeng H,Liu Q,WangM,etal.Target-guided separation ofantioxidants from Semen cassia via off-line two-dimensional high-speed countercurrent chromatography combined with complexation and extrusion elution mode.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2015, 1001：58-65.

17 Zhang Y Q,Luo J G,Han C,et al.Bioassay-guided preparative separation of angiotensin-converting enzyme inhibitory C-flavone glycosides from Desmodium styracifolium by recycling complexation high-speed counter-current chromatography.J Pharm Biomed Anal, 2015,102：276-281.

18 Liu Q,Shi S,Liu L,et al.Separation and purification of bovine serum albumin binders from Fructus polygoni orientalis using off-line twodimensional complexation high-speed counter-current chromatography target-guided by ligand fishing.JChromatogrA,2013,1304：183-193.

19 Shi S,Zhou H,Zhang Y,etal.Hyphenated HSCCC-DPPH·for Rapid Preparative Isolation and Screening of Antioxidants from S elaginella moellendorffii.Chromatographia,2008,68(3)：173-178.

20 Li S,Zhao M,Li Y,et al.Preparative Isolation of six Anti-Tumour Biflavonoids from Selaginella Doederleinii Hieron by High-Speed Counter-Current Chromatography.Phytochem Anal,2014,25(2)：127-133.

21 Cho N,Kim H W,Kim T B,et al.Preparative Purification of Anti-Proliferative Diarylheptanoids from B etula platyphylla by High-Speed Counter-CurrentChromatography.Molecules,2016,21(6).pii：E700.

22 Tu Y Y,Tang A B,Watanabe N.The theaflavin monomers inhibit the cancer cellsgrowth in vitro.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2004, 36(7)：508-512.

23 Li Y,Yin L,Zheng L,etal.Application of high-speed counter-current chromatography coupled with a reverse micelle solvent system to separate three proteins from Momordica charantia.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2012,895-896：77-82.

24 Shao P,Zhang JF,Chen X X,etal.Microwave-assisted extraction and purification of chlorogenic acid from by-products of Eucommia Ulmoides Oliver and its potential anti-tumor activity.J Food Sci Technol,2015,52(8)：4925-4934.

25 Jin J,LiY,Kipletting TanuiE,etal.Fishing and knockoutof bioactive compounds using a combination of high-speed counter-current chromatography(HSCCC)and preparative HPLC for evaluating the holistic efficacy and interaction of the components of Herba Epimedii.J Ethnopharmacol,2013,147(2)：357-365.

26 ZhaoW,Wang Y,HaoW,etal.Preparative isolation and purification of urolithins from the intestinalmetabolites of pomegranate ellagitannins by high-speed counter-current chromatography.JChromatogrB Analyt TechnolBiomed Life Sci,2015,990：111-117.

27 Lim SS,LeeM Y,Ahn H R,etal.Preparative isolation and purification ofantioxidative diarylheptanoid derivatives from Alnusjaponica by highspeed counter-current chromatography.JSep Sci,2011,34(23)：3344-3352.

28 Zhou X,Zhang Y,Zhao H,et al.Antioxidant homoisoflavonoids from Polygonatum odoratum.Food Chem,2015,186：63-68.

29 Xiao G,Li G,Chen L,et al.Isolation of antioxidants from Psoralea corylifolia fruits using high-speed counter-current chromatography guided by thin layer chromatography-antioxidant autographic assay.J ChromatogrA,2010,1217(34)：5470-5476.

30 Zhang Y,Shi S,Wang Y,etal.Target-guided isolation and purification of antioxidants from Selaginella sinensis by offline coupling of DPPHHPLC and HSCCC experiments.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2011,879(2)：191-196.

31 Zhang S,Li L,Cui Y,et al.Preparative high-speed counter-current chromatography separation of grape seed proanthocyanidins according to degreeofpolymerization.Food Chem,2017,219：399-407.

32 Ma R,Zhou R,Tong R,et al.At-line hyphenation of high-speed countercurrent chromatography with Sephadex LH-20 column chromatography for bioassay-guided separation of antioxidants from vine tea(Ampelopsis grossedentata).J Chromatogr B Analyt Technol Biomed LifeSci,2017,1040：112-117.

33 Wang J,Tong X,Li P,et al.Bioactive components on immunoenhancement effects in the traditional Chinese medicine Shenqi Fuzheng Injection based on relevance analysis between chemical HPLC fingerprints and in vivo biological effects.JEthnopharmacol,2014,155(1)：405-415.

34 Li L F,Chan B C,Yue G G,et al.Two immunosuppressive compounds from themushroom Rubinoboletusballouii using human peripheral blood mononuclear cells by bioactivity-guided fractionation.Phytomedicine, 2013,20(13)：1196-1202.

35 Fan Y,DuanW,Luo Y,etal.Preparative separation and purification of two flavanols from Smilax china L.using high-speed counter-current chromatography.Eur Food ResTechnol,2015,240(1)：33-39.

36 Li S,Tang Y,Liu C,et al.Development of a method to screen and isolate potential alpha-glucosidase inhibitors from Panax japonicus C. A.Meyer by ultrafiltration,liquid chromatography,and counter-current chromatography.JSep Sci,2015,38(12)：2014-2023.

37 Zhou X,Liang J,Zhang Y,et al.Separation and purification of alphaglucosidase inhibitors from Polygonatum odoratum by stepwise highspeed counter-currentchromatography combined with Sephadex LH-20 chromatography target-guided by ultrafiltration-HPLC screening.J ChromatogrBAnalytTechnolBiomed Life Sci,2015,985：149-154.

38 Wang M,Gu D,Guo X,et al.Bioassay-guided isolation of an active compound with protein tyrosine phosphatase 1B inhibitory activity from S argassum fusiforme by high-speed counter-current chromatography.J Sep Sci,2016,39(22)：4408-4414.

39 Chen Q,Luo X,Ma X,et al.Fatty acid synthase inhibitors separated from oiltea camellia by high-speed counter-current chromatography.J Food Sci,2011,76(5)：C750-754.

40 Shi SY,Peng M J,Zhang Y P,etal.Combination of preparative HPLC and HSCCC methods to separate phosphodiesterase inhibitors from Eucommia ulmoides bark guided by ultrafiltration-based ligand screening.AnalBioanalChem,2013,405(12)：4213-4223.

41 Paek J H and Lim S S.Preparative isolation of aldose reductase inhibitory compounds from Nardostachys chinensis by elution-extrusion counter-current chromatography.Arch Pharm Res,2014,37(10)：1271-1279.

42 Schwager S L,Carmona A K,and Sturrock E D.A high-throughput fluorimetric assay for angiotensin I-converting enzyme.Nat Protoc, 2006,1(4)：1961-1964.

43 Chan B C,Yu H,Wong CW,et al.Quick identification of kuraridin,a noncytotoxic anti-MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus) agent from Sophora flavescens using high-speed counter-current chromatography.JChromatogrB Analyt Technol Biomed Life Sci,2012, 880(1)：157-162.

44 Walasek M,Grzegorczyk A,Malm A,etal.Bioactivity-guided isolation of antimicrobial coumarins from Heracleum mantegazzianum Sommier& Levier(Apiaceae)fruits by high-performance counter-current chromatography.Food Chem,2015,186：133-138.

45 Shia S,Huang K,Zhang Y,et al.Purification and identification of antiviral components from Laggera pterodonta by high-speed countercurrent chromatography.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2007,859(1)：119-124.

46 ShiSY,Zhou H H,Huang K L,etal.Application ofhigh-speed countercurrent chromatography for the isolation of antiviral eremophilenolides from Ligularia atroviolacea.Biomed Chromatogr,2008,22(9)：985-991.

47 Roehm N W,Rodgers G H,Hatfield S M,et al.An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium saltXTT.J ImmunolMethods,1991,142(2)：257-265.

48 Si W,Gong J,Tsao R,et al.Bioassay-guided purification and identification of antimicrobial components in Chinese green tea extract. JChromatogr A,2006,1125(2)：204-210.

49 Chan B C,Han X Q,Lui S L,et al.Combating againstmethicillinresistant Staphylococcus aureus-two fatty acids from Purslane (Portulaca oleracea L.)exhibit synergistic effects with erythromycin.J Pharm Pharmacol,2015,67(1)：107-116.

50 Li J and Lin X.Preparative Purification of Bioactive Compounds from Flos Chrysanthemi Indici and Evaluation of Its Antiosteoporosis Effect. Evid-based complAltMed,2016,2016：2587201.

51 Ying H,Liu J,and Du Q.Analysis and determination of oestrogenactive compounds in fructus amomi by the combination of high-speed counter-current chromatography and high performance liquid chromatography.JChromatogrB Analyt Technol Biomed Life Sci,2014, 958：36-42.

52 Feng Z F,Chen X F,Zhang J,etal.Activity-screening-guided isolation and purification for vasodilative effects compounds from Radix Astragali by high-speed counter-current chromatography using gradient elution. Natl Prod Res,2013,27(11)：1020-1022.

53 Chen H Y,Ye X L,Cui X L,et al.Cytotoxicity and antihyperglycemic effect of minor constituents from Rhizoma Coptis in HepG2 cells. Fitoterapia,2012,83(1)：67-73.

App lication of High-Speed CountercurrentChromatography to the Rapid Screening of Bioactive Components from ChineseM ateria M edica(CMM)and Natural Products

Wang Yongling1,2,Zhang Baojun1,2,FuWenwei1,2
(1.SchoolofPharmacy,ShanghaiUniversity ofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 2.Engineering ResearchCenterofShanghaiCollegesforTCM New Drug Discovery,Shanghai201203,China)

The combination ofhigh-speed countercurrent chromatography and rapid bioactive assay is a desirablemeth-od in the screening of bioactive components from CMM and natural products.This review focused on the application status of high-speed countercurrent chromatography to the rapid screening of bioactive components from CMM and natural productsbased on our previousstudiesand the recentprogressover it.

High-speedcountercurrentchromatography,bioactive components,rapid screening

10.11842/wst.2017.02.013

R93

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2017-02-20

修回日期：2017-02-20

＊上海中醫(yī)藥大學(xué)預(yù)算內(nèi)項目（2016YSN06）：菲島福木果實抗腫瘤活性成分研究，負(fù)責(zé)人：付文衛(wèi)；上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)一流學(xué)科創(chuàng)新基金（ZYX-CXYJ-012）：單花山竹子、大苞藤黃以及大果藤黃抗腫瘤有效部位的化學(xué)成分及作用機制研究，負(fù)責(zé)人：付文衛(wèi)。

＊＊通訊作者：付文衛(wèi)，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥活性成分研究。