PTH基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松性骨折的相關(guān)性研究

王其飛，薛濤，張清華，張昆，王占國，闞金富，李冬，張光武

(北京大學(xué)首鋼醫(yī)院骨科，北京 100144)

實(shí)驗(yàn)研究

PTH基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松性骨折的相關(guān)性研究

王其飛，薛濤，張清華，張昆，王占國，闞金富，李冬，張光武*

(北京大學(xué)首鋼醫(yī)院骨科，北京 100144)

目的 探討甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)基因rs1459015位點(diǎn)多態(tài)性與北京地區(qū)漢族人群骨質(zhì)疏松性骨折骨密度的關(guān)系。方法 研究對象為北京地區(qū)無親緣關(guān)系的漢族人群，其中骨質(zhì)疏松性骨折患者(骨折組)127例，非骨質(zhì)疏松性骨折患者(對照組)145例。采用SNaPshot法檢驗(yàn)PTH基因多態(tài)性，雙能X線吸收儀測定腰椎L2～4、股骨近端的neck、Ward’s三角、troch和total骨密度，計(jì)算兩組等位基因頻率、基因型頻率，分析骨折組和對照組各部位骨密度差異以及骨折組PTH基因多態(tài)性與各部位骨密度的關(guān)系。結(jié)果 骨折組A、G等位基因頻率19.7%、80.3%，對照組A、G等位基因頻率18.6%、81.4%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組AA、AG、GG基因型頻率分別為3.9%、31.5%、64.6%和3.4%、30.3%、66.2%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。骨折組各部位骨密度均低于對照組，除neck骨密度差異外均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。骨折組中GG基因型腰椎骨密度均高于AA、AG基因型(P>0.05)。與AA、GG基因型相比，骨折組AG基因型髖部骨密度較高(P>0.05)。結(jié)論 PTH基因多態(tài)性rs1459015位點(diǎn)與北京地區(qū)漢族人群骨質(zhì)疏松性骨折患者骨密度不相關(guān)。

甲狀旁腺激素基因；多態(tài)性；骨質(zhì)疏松；骨密度；骨折

骨質(zhì)疏松癥是絕經(jīng)后婦女和老年人常見的全身性骨代謝疾病，主要特點(diǎn)是骨量降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加和骨折風(fēng)險升高[1-2]。骨質(zhì)疏松的發(fā)生風(fēng)險主要取決于年輕時峰值骨量和之后骨量丟失率的大小[3]。通過對家系及雙胞胎的研究表明，峰值骨量和骨密度與遺傳因素高度相關(guān)。其中遺傳因素作用在骨質(zhì)疏松的發(fā)生中約占80%左右。在眾多候選基因中，甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)基因是基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松相關(guān)性研究的熱點(diǎn)之一。甲狀旁腺激素是調(diào)節(jié)機(jī)體鈣、磷代謝和骨代謝的重要激素之一[4]，可以調(diào)節(jié)腸道和腎臟對鈣的吸收，參與骨吸收與骨形成過程，可見血清甲狀旁腺激素濃度與骨質(zhì)疏松的發(fā)生密切相關(guān)。本研究探討了PTH基因的rs1459015位點(diǎn)與我國北京地區(qū)漢族人群骨質(zhì)疏松性骨折患者骨密度的關(guān)系，有助于我們從基因水平了解骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制，為預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 對象資料 來自2015年12月至2016年7月北京大學(xué)首鋼醫(yī)院住院部骨科、內(nèi)分泌科和老年干部病房272例患者。骨質(zhì)疏松性骨折患者127例(骨折組)，其中男39例，女88例；年齡53～96歲，平均(76.5±10.0)歲。非骨質(zhì)疏松性骨折患者145例(對照組)，其中男58例，女87例；年齡50～90歲，平均(74.6±6.8)歲。該研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn) 骨質(zhì)疏松性骨折：女性50歲以上(自然停經(jīng)3年以上)，男性60歲以上；符合骨質(zhì)疏松WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)(T2.5SD)；脆性骨折；理解本研究目的及要求，同意參與本研究并簽署書面知情同意書。非骨質(zhì)疏松性骨折：女性50歲以上(自然停經(jīng)3年以上)，男性60歲以上；理解本研究目的及要求，同意參與本研究，并簽署書面知情同意書。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 不能簽署知情同意書；近1年使用阿侖膦酸鈉或唑來膦酸等雙磷酸鹽類藥物，近6個月使用骨化三醇、雷洛昔芬、雌激素、降鈣素、活性維生素D等；近3個月進(jìn)行2周以上影響骨代謝藥物，如類固醇類激素等；有嚴(yán)重肝、腎、胃腸等重要臟器疾病；患有影響骨代謝的疾病，如有糖尿病、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、甲狀旁腺功能減退、垂體疾病等；存在影響B(tài)MD測量的因素，如髖部或腰椎手術(shù)史。

1.2 方法

1.2.1 骨密度測定 骨密度測定采用雙能X線吸收儀完成，測量部位包括腰椎L2～4以及股骨近端的neck、Ward’s、troch和total部位。測定過程由放射科專業(yè)技術(shù)人員協(xié)助完成。

1.2.2 標(biāo)本采集 清晨空腹時采集肘靜脈血2 mL于乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝管中，置于-80℃冰箱保存，用于單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分型。

1.2.3 基因組DNA提取 采用酚/氯仿法提取外周血白細(xì)胞DNA，-20℃保存。

1.2.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)反應(yīng) CYP11A1基因rs900798位點(diǎn)引物：上游引物5’-CCACTCTTGGAGCCCTTCTG-3’，下游引物5’-GAGCTGGCAATGATGTGTCC-3’。PCR反應(yīng)條件：94℃(預(yù)變性)5 min，94℃(變性)30 s，59℃(退火)45 s，72℃(延伸)1 min，循環(huán)35次，72℃(再延伸)10 min。所用引物均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2.5 基因分型 采用SNaPshot技術(shù)，也稱小測序。核心反應(yīng)(即延伸反應(yīng))體系中包含：測序酶；四種熒光標(biāo)記ddNTP；緊挨多態(tài)位點(diǎn)5’-端的不同長度延伸引物；包含SNP位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物模板。通過反應(yīng)，引物延伸一個堿基即終止，再經(jīng)測序儀檢測，根據(jù)峰的移動位置確定該延伸產(chǎn)物對應(yīng)的SNP位點(diǎn)，根據(jù)峰的顏色可得知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。

2 結(jié) 果

兩組研究對象在性別、年齡和體重指數(shù)(body mass index，BMI)上差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性(見表1)。

骨折組和對照組等位基因頻率和基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡。其中骨折組A、G等位基因頻率為19.7%、80.3%，對照組A、G等位基因頻率為18.6%、81.4%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組AA、AG、GG基因型頻率分別為3.9%、31.5%、64.6%和3.4%、30.3%、66.2%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

骨折組各部位骨密度均低于對照組(見表3)，除neck骨密度差異外均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

骨折組中GG基因型腰椎骨密度均高于AA、AG基因型(P>0.05)。與AA、GG基因型相比，骨折組AG基因型髖部骨密度較高(P>0.05，見表4)。

表1 研究對象基本資料±s)

表2 骨折組和對照組等位基因頻率和基因型頻率分布

表3 骨折組和對照組各部位骨密度比較±s，g·cm-2)

表4 骨折組AA、AG和GG基因型與每個部位骨密度關(guān)系

3 討 論

甲狀旁腺激素編碼基因位于染色體11p15[3]，該基因主要在甲狀旁腺主細(xì)胞表達(dá)，其合成的甲狀旁腺激素是含84個氨基酸殘基的直鏈多肽，在人體內(nèi)血漿濃度呈現(xiàn)清晨高午后低的晝夜波動規(guī)律，主要功能是調(diào)節(jié)鈣、磷代謝及骨代謝和維持血鈣、血磷濃度。PTH外周代謝器官有腎臟、肝臟和骨骼等，其中骨骼是主要的靶器官之一。PTH可激活成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨形成；也可促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收作用，但骨形成作用大于骨吸收作用，故PTH能夠增加骨量。相關(guān)文獻(xiàn)報道[5]，小劑量間斷注射重組人甲狀旁腺激素(1-34)[recombinant human parathyroid hormone(1-34)，rhPTH(1-34)]可以提高骨質(zhì)疏松癥患者骨密度，降低脆性骨折風(fēng)險。楊艷等[5]在一項(xiàng)隨機(jī)對照臨床研究中，將骨質(zhì)疏松癥患者隨機(jī)分為rhPTH(1-34)組和依降鈣素組，經(jīng)過1年治療后發(fā)現(xiàn)rhPTH(1-34)可明顯改善椎體骨密度，增長速度和幅度均優(yōu)于依降鈣素。因此，該基因被認(rèn)為骨質(zhì)疏松相關(guān)的候選基因之一。

骨密度測量值是骨質(zhì)疏松癥的診斷金標(biāo)準(zhǔn)[6]，可用來預(yù)測骨折風(fēng)險[7]。PTH基因多態(tài)性與骨密度的相關(guān)性研究在國內(nèi)外有不少相關(guān)報道。Hosoi等[8]研究了383例日本絕經(jīng)后婦女PTH基因BstBI位點(diǎn)多態(tài)性與骨密度關(guān)系，其中BB、Bb和bb型分布頻率分別為82.5%、16.7%、0.8%，B、b等位基因頻率為90.9%、9.1%。Bb基因型腰椎部骨密度顯著低于BB基因型。Kanzawa等[9]將79例原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)患者和104例正常組作為研究對象探討B(tài)stBI位點(diǎn)多態(tài)性與骨密度關(guān)系。甲狀旁腺功能亢進(jìn)患者BB、Bb和bb基因型頻率為82.3%、15.2%和2.5%，正常組87.5%、12.5%和0%，兩組基因型頻率分布無差異。且甲狀旁腺功能亢進(jìn)患者3組基因型之間骨密度沒有明顯差異。

鐘妮[3]的PTH基因BstBI位點(diǎn)多態(tài)性與女性骨密度的研究中，研究對象的BB、Bb和bb型分布頻率分別為75.8%、23.3%和0.9%；等位基因頻率為87.5%，12.5%；經(jīng)分析絕經(jīng)前后兩組女性的等位基因頻率和基因型頻率分布，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。絕經(jīng)后女性的三種基因型與腰椎和股骨頸骨密度無相關(guān)性。何斌等[10]的研究中PTH基因BstBI位點(diǎn)BB、Bb和bb基因型分布頻率分別為69.6%、27.0%、3.4%，等位基因頻率為83.1%、16.9%。在協(xié)方差分析校正了年齡、體質(zhì)指數(shù)等影響因素后，三種不同的基因型相互之間的腰椎、股骨頸、大轉(zhuǎn)子和Ward’s三角部位骨密度均無相關(guān)性。在這兩項(xiàng)研究中等位基因及基因型頻率無明顯差異，基因多態(tài)性與骨密度也不相關(guān)。但李東等[11]選擇北京地區(qū)絕經(jīng)后女性作為研究對象，BB、Bb和bb三種基因型的分布頻率分別為64.32%、28.11%和7.56%。與BB、Bb基因型相比，bb基因型女性的前臂骨密度較低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明在不同地區(qū)、不同人群中，PTH基因型頻率、等位基因頻率分布不同；不同基因型之間和骨密度的關(guān)系也可能不同。

本研究中選擇了一個研究較少的SNP位點(diǎn)PTH基因rs1459015位點(diǎn)。國外僅有一篇關(guān)于該位點(diǎn)多態(tài)性與維生素D缺乏的相關(guān)性報道[12]。尚未有關(guān)于該位點(diǎn)與骨質(zhì)疏松患者骨密度和骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的研究。本研究中骨折組A、G等位基因頻率19.7%、80.3%，對照組A、G等位基因頻率18.6%、81.4%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組AA、AG、GG基因型頻率分別為3.9%、31.5%、64.6%和3.4%、30.3%、66.2%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這與Aldaghri等[12]研究中所有受試者的A、G等位基因頻率和AA、AG、GG基因型頻24.6%、75.4%和6.7%、35.8%、57.5%大體一致。骨折組腰椎和股骨近端的骨密度明顯低于對照組骨密度，這可能由于骨折組患者骨吸收作用明顯大于骨形成作用，導(dǎo)致骨量丟失，骨微結(jié)構(gòu)破壞，脆性增減。由于骨折組骨密度大幅度下降，故低能量損傷即可導(dǎo)致骨折[13]。骨折組中GG基因型腰椎骨密度均高于AA、AG基因型(P>0.05)。與AA、GG基因型相比，骨折組AG基因型的髖部骨密度較高(P>0.05)但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，需要我們進(jìn)步擴(kuò)大樣本量、多中心研究。

本研究從基因水平上尋找骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理，未發(fā)現(xiàn)PTH基因rs1459015位點(diǎn)多態(tài)性與北京地區(qū)漢族人群骨質(zhì)疏松性骨折患者骨密度的關(guān)系，原因可能為樣本量較少，缺乏多中心研究等。我們下步將擴(kuò)大樣本量，在不同區(qū)域、不同種族進(jìn)行研究，并研究該位點(diǎn)多態(tài)性與骨質(zhì)疏松癥患者藥物療效的關(guān)系，為骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療提供充分理論依據(jù)。

[1]Abukhadir SS，Mohamed N，Mohamed N.Pathogenesis of alcohol-induced osteoporosis and its treatment：a review[J].Curr Drug Targets，2013，14(13)：1601-1610.

[2]Hwang JS，Chan DC，Chen JF，et al.Clinical practice guidelines for the prevention and treatment of osteoporosis in Taiwan：summary[J].J Bone Miner Metab，2014，32(1)：10-16.

[3]鐘妮，張紅，伍賢平，等.甲狀旁腺激素基因多態(tài)性與女性骨量及骨相關(guān)生化指標(biāo)的關(guān)系[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86(6)：376-379.

[4]Kanaya K，Kato Y，Murata Y，et al.Low parathyroid hormone levels in patients who underwent/would undergo hemodialysis result in bone graft failure after posterolateral fusion[J].Spine (Phila Pa 1976)，2014，39(4)：327-331.

[5]楊艷，李蓬秋，朱顯軍，等.重組人甲狀旁腺激素(1-34)和依降鈣素治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的隨機(jī)對照研究[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2014，20(2)：137-141.

[6]Punda M，Grazio S.Bone densitometry the gold standard for diagnosis of osteoporosis[J].Reumatizam，2014，61(2)：70-74.

[7]Alarkawi D，Bliuc D，Nguyen TV，et al.Contribution of lumbar spine BMD to fracture risk in individuals with T-score discordance[J].J Bone Miner Res，2016，31(2)：274-280.

[8]Hosoi T，Miyao M，Inoue S，et al.Association study of parathyroid hormone gene polymorphism and bone mineral density in Japanese postmenopausal women[J].Calcif Tissue Int，1999，64(3)：205-208.

[9]Kanzawa M，Sugimoto T，Kobayashi T，et al.Parathyroid hormone gene polymorphisms in primary hyperparathyroidism[J].Clin Endocrinol (Oxf)，1999，50(5)：583-588.

[10]何斌，李東風(fēng)，吳文，等.甲狀旁腺激素基因多態(tài)性對廣東地區(qū)老年人骨密度的影響[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27(12)：2257-2260.

[11]李東，董兆文，薛延，等.絕經(jīng)后健康婦女甲狀旁腺激素基因多態(tài)性與骨密度的關(guān)系[J].遺傳，2003，25(2)：133-136.

[12]Aldaghri NM，Alattas OS，Krishnaswamy S，et al.Association between promoter region genetic variants of PTH SNPs and serum 25(OH)-vitamin D level.[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8(7)：8463-8471.

[13]Cappola AR，Shoback DM.Osteoporosis Therapy in Postmenopausal Women With High Risk of Fracture[J].JAMA，2016，316(7)：715-716.

作者簡介：王其飛(1989- )，男，研究生在讀，北京大學(xué)首鋼醫(yī)院骨科，100144。

Association between PTH Gene Polymorphism and Osteoporotic Fracture

Wang Qifei，Xue Tao，Zhang Qinghua，et al

(Department of Orthopedics，Peking University Shougang Hospital，Beijing 100144，China)

Objective To explore the relationship between the polymorphism of PTH gene rs1459015 and bone mineral density(BMD) of osteoporotic fracture in Han nationality in Beijing.Methods The subjects included 127 osteoporotic fracture(fracture group) and 145 non-osteoporotic fracture(control group).All subjects living in Beijing are Han Chinese without relationship.PTH gene polymorphisms were identified by SNaPshot.BMDs of the lumbar spine (L2～4) and proximal femur including neck，Ward’s，triangle troch and total hip were measured by dual energy X-ray absorptiometry.Allele frequency and genotype frequency were calculated.The BMD difference of two groups and the relationship of the PTH gene polymorphism with BMD of each location in fracture group were analyzed.Results The A and G allele frequency in two groups were 19.7%，80.3% and 18.6%，81.4%，without statistical significance(P>0.05).AA、AG、GG genotype frequencies of two populations were 3.9%，31.5%，64.6% and 3.4%，30.3%，66.2%，and this difference was not statistically significant(P>0.05).The BMDs of each location in fracture group were lower than those in control group，and the differences were statistically significant(P<0.05)，not including the difference of BMD of neck.The BMDs of GG genotype were higher than those of AA and AG genotype in fracture group (P>0.05).Compared with AA and GG genotypes in fracture group，AG genotype had higher BMD of hip.Conclusion The PTH gene polymorphism is not associated with BMD of osteoporotic fracture.

parathyroid hormone gene；polymorphism ；osteoporosis；bone mineral density；fracture

韓健(1966- )，男，主任醫(yī)師，蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院骨科，730030。

1008-5572(2017)03-0240-04

北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目(Z131100002613002)；*本文通訊作者：張光武

R580

A

2016-09-30

王其飛，薛濤，張清華，等.PTH基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松性骨折的相關(guān)性研究[J].實(shí)用骨科雜志，2017，23(3)：240-243.