炮制方法對(duì)補(bǔ)骨脂中抗骨質(zhì)疏松效應(yīng)成分含量的影響＊

李 娜，顏冬梅＊＊，張金蓮，高秀梅

（1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330004；2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院 天津 300193）

炮制方法對(duì)補(bǔ)骨脂中抗骨質(zhì)疏松效應(yīng)成分含量的影響＊

李 娜1，顏冬梅1＊＊，張金蓮1，高秀梅2

（1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330004；2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院 天津 300193）

目的：探討不同炮制方法對(duì)補(bǔ)骨脂中抗骨質(zhì)疏松有效成分含量的影響。方法：采用HPLC法測(cè)定補(bǔ)骨脂生品及不同炮制品中香豆素類、黃酮類、單萜酚類抗骨質(zhì)疏松效應(yīng)成分的含量，對(duì)炮制前后三類成分的含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：補(bǔ)骨脂經(jīng)不同方法炮制后三類成分含量與生品相比均有極顯著變化。結(jié)論： 藥典收載的炮制法可同時(shí)提高三類化合物的含量，可能增強(qiáng)其治療骨質(zhì)疏松的作用，與中醫(yī)認(rèn)為“鹽炙能增強(qiáng)溫補(bǔ)脾腎的作用”的傳統(tǒng)觀念相吻合。

補(bǔ)骨脂 炮制 抗骨質(zhì)疏松效應(yīng)成分 影響

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)，其性溫，味辛，具有補(bǔ)腎固精，縮尿止帶，溫脾止瀉，固沖安胎之功效[1]。現(xiàn)代研究表明，補(bǔ)骨脂主要含有苯并呋喃苷、香豆素、黃酮、單萜酚類等成分[2]。在臨床應(yīng)用方面，歷代醫(yī)家廣泛將其用于各類補(bǔ)腎健骨方中，治療骨質(zhì)疏松癥[3，4]。現(xiàn)代藥理研究顯示，補(bǔ)骨脂可通過(guò)調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)化，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖活性、抑制破骨細(xì)胞的重吸收，從而對(duì)骨質(zhì)疏松起到一定防治作用[5-8]。本課題組前期研究顯示，香豆素類、黃酮類和酚類化合物能激動(dòng)ERα、ERβ受體[9]，而ERα與ERβ受體均參與了骨質(zhì)的重建[10]。因此，三類化合物的含量高低將影響補(bǔ)骨脂在治療骨質(zhì)疏松癥中的效應(yīng)。

然而，南北朝劉宋時(shí)代的《雷公炮炙論》記載補(bǔ)骨脂“性本大燥，毒”，說(shuō)明其雖有溫腎助陽(yáng)之功效，但不宜久服，入藥均需經(jīng)過(guò)炮制，至今臨床所用補(bǔ)骨脂也均以炮制品為主，而補(bǔ)骨脂的炮制方法始載于《雷公炮炙論》：酒浸蒸以除燥毒[11，12]。后世醫(yī)藥學(xué)家在醫(yī)療實(shí)踐中繼承和發(fā)展了雷公法，發(fā)展出蒸、浸、炒、焙、煮、藥汁制等多種炮制方法[13]。因此，補(bǔ)骨脂炮制品種較多，古今主要炮制方法包括雷公法、酒浸炒、清炒法、鹽炙法、蒸法[14]。目前為止，對(duì)于炮制方法對(duì)補(bǔ)骨脂中不同類化學(xué)成分的影響，宋瀟和王增繪等[15，16]對(duì)此做了一定工作，兩者的研究均認(rèn)為炮制能夠改變補(bǔ)骨脂中效應(yīng)成分的含量，但未充分解釋治療骨質(zhì)疏松癥的處方（如壯骨關(guān)節(jié)丸）選擇鹽炙品的原因。基于此，本實(shí)驗(yàn)擬采用HPLC法測(cè)定補(bǔ)骨脂炮制前后香豆素類（補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素）、黃酮類（新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、異補(bǔ)骨脂查耳酮、Corylifol A）和酚類（補(bǔ)骨脂酚）化合物的含量，比較不同炮制方法對(duì)補(bǔ)骨脂各類成分含量的影響，為各類炮制品的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀，自帶Ultimate 3000型自動(dòng)進(jìn)樣器、 Ultimate 3000型二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)DIONEX公司）；BT224S型萬(wàn)分之一天平（瑞士Sartoris公司）；Mettle AE24型十萬(wàn)分之一天平（瑞士Sartoris公司）；KQ-3200型超聲清洗器（中國(guó)浙江昆山市超聲儀器有限公司）；YF-111型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；SZ-93型自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司）。

補(bǔ)骨脂藥材購(gòu)自江西樟樹(shù)藥材市場(chǎng)（產(chǎn)地：河南），經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)付曉梅副教授鑒定為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)。補(bǔ)骨脂素（10070-201302）、異補(bǔ)骨脂素（10521-201302）、異補(bǔ)骨脂查耳酮（493-201304）、補(bǔ)骨脂二氫黃酮（20494-201304）、Corylifol A（20495-201304）、新補(bǔ)骨脂異黃酮（20492-201304）及補(bǔ)骨脂酚（20491-201302）均購(gòu)自江西南昌貝塔生物技術(shù)有限公司，純度＞98%；乙腈（德國(guó)Merck公司）、甲酸均為色譜純（美國(guó)Fisher公司）；陳年塔牌紹興花雕酒（浙江塔牌紹興酒有限公司，酒精度≥15.5%，酒齡1-3年）；精制深井鹽（江西省鹽業(yè)公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 不同炮制品的制備

2.2.1 酒浸炒

取凈制補(bǔ)骨脂500 g，用1 500 mL黃酒浸泡一天，過(guò)濾，瀝干，分次加入鐵鍋中（每次約50 g），用文火炒至微黃，膨脹，有香氣，迸裂。取出，放涼，即得。

2.1.2 藥典法

取凈制補(bǔ)骨脂500 g，加入20%食鹽溶液，悶潤(rùn)4 h，分次加入鐵鍋中（每次約100 g），用文火炒至微黃，膨脹，有香氣，迸裂。取出，放涼，即得。（100 kg藥材用2 kg食鹽）。

2.1.3 蒸法

按照廣州的方法，取補(bǔ)骨脂 500 g加鹽水（鹽l2 g -l00 mL）悶潤(rùn)過(guò)夜，蒸2 h。

2.1.4 清炒法

取凈制補(bǔ)骨脂500 g，分次加入鐵鍋中（每次約100 g），用文火炒至微黃，膨脹，有香氣，迸裂。取出，放涼，即得。

2.1.5 雷公法

取凈制補(bǔ)骨脂500 g，先用1 500 mL黃酒浸泡1天，濾去黃酒，加入1 500 mL清水浸泡3天，過(guò)濾，瀝干，置于鍋中，隔水蒸6 h，取出，曬干，即得。

以上炮制品分別置搪瓷盤(pán)中，充分晾干，置干燥器備用。

2.2 色譜條件

Hypersil ODS2（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0-30 min，90%-50% A；30-45 min，50%-40% A；45-55 min，40%-30% A；55-60 min，30%-20% A，保持2 min，樣品分析結(jié)束后平衡15 min；流量體積：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：246 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制

精密稱取適量補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、異補(bǔ)骨脂查耳酮、Corylifol A和補(bǔ)骨脂酚標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成濃度分別為3.008、2.848、1.556、0.780、1.772、1.286、15.00 mg·mL-1的溶液，上述儲(chǔ)備液均置于棕色容量瓶中，并于4 ℃保存。

2.4 供試品溶液的制備

補(bǔ)骨脂藥材粉碎過(guò)100目篩，精密稱取0.1 g置10 mL容量瓶中，加9 mL甲醇超聲提取30 min（室溫），定容至10 mL，取部分溶液于離心機(jī)中，室溫下12 000 rpm離心10 min，移取上層有機(jī)相2 mL，稀釋至10 mL，取上清液20 μL注入HPLC色譜儀，記錄相應(yīng)化合物的峰面積。

2.5 線性關(guān)系和檢出限考察

分別準(zhǔn)確移取“2.3”項(xiàng)對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋，制得混合對(duì)照品溶液，其中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、異補(bǔ)骨脂查耳酮、Corylifol A和補(bǔ)骨脂酚的濃度分別為300.8、284.8、155.6、78、177.2、128.64、1 500 μg·mL-1，并逐級(jí)稀釋成一系列不同濃度的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣20 μL測(cè)定。以對(duì)照品濃度X（μg·mL-1）對(duì)峰面積Y進(jìn)行線性回歸；以信噪比3為檢出限，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，7個(gè)化合物在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度考察

取同一濃度的混合對(duì)照品溶液20 μL，按“2.2”項(xiàng)所述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、異補(bǔ)骨脂查耳酮、Corylifol A和補(bǔ)骨脂酚峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為 1.96%、1.99%、2.03%、2.02%、1.87%、2.35%和1.74%，表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

圖1 混合對(duì)照品（A）和供試品（B）

表1 補(bǔ)骨脂中7個(gè)化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢測(cè)限

取同一補(bǔ)骨脂炮制品供試品溶液，按“2.4”供試品溶液制備方法處理，分別于0、2、6、12、24、48 h進(jìn)樣20 μL測(cè)定，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、異補(bǔ)骨脂查耳酮、Corylifol A和補(bǔ)骨脂酚峰面積的RSD分別為2.72%、2.58%、2.49%、2.62%、2.44%、2.37%和2.03%。結(jié)果表明，供試品溶液室溫放置48 h基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一補(bǔ)骨脂炮制品粉末0.1 g，按“2.4”供試品溶液制備方法平行處理5份，按“2.2”項(xiàng)所述色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、異補(bǔ)骨脂查耳酮、Corylifol A和補(bǔ)骨脂酚的峰面積，RSD分別為2.43%、2.29%、2.76%、2.87%、2.65%、2.58%和1.91%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取蒸法補(bǔ)骨脂炮制品粉末0.05 g，共6份，分別準(zhǔn)確加入與樣品中含量相當(dāng)?shù)难a(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、異補(bǔ)骨脂查耳酮、Corylifol A和補(bǔ)骨脂酚對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率（表2）。

2.10 樣品含量測(cè)定

分別稱取補(bǔ)骨脂生品及不同炮制品粉末約0.1 g，按“2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，每批平行處理兩份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。計(jì)算樣品中各成分的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以ˋx表示，采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件繪制各化合物含量柱狀圖（圖2）。

2.11 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)各炮制品的香豆素類化合物（補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量的平均值）、黃酮類化合物（新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、異補(bǔ)骨脂查耳酮、Corylifol A含量的平均值）及單萜酚化合物（補(bǔ)骨脂酚的含量）的含量進(jìn)行主成分分析，綜合主成分值分別為：生品-0.279 13、酒浸炒品1.619 66、藥典法品（鹽炙品）0.686 69、蒸法品-1.137 16、清炒品-0.18 235、雷公制品-0.70 771（表3）。由此可知，酒浸炒法和藥典法對(duì)三類成分都為正影響，而其他炮制方法對(duì)三類成分的影響不一致。

表2 補(bǔ)骨脂中7個(gè)化合物的加樣回收率（n=6）

圖2 補(bǔ)骨脂不同炮制品中7個(gè)化合物的含量（±s，n=3）

2.12 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

綜合以上分析可知，補(bǔ)骨脂經(jīng)不同方法炮制后各類成分含量均有變化：酒浸炒法、藥典法、清炒法和雷公法炮制后香豆素類化合物的總含量極顯著升高，順序?yàn)榫平捶ǎ纠坠ǎ厩宄捶ǎ舅幍浞ǎ旧?，但蒸法使香豆素類化合物的總含量極顯著降低；對(duì)于黃酮類化合物，酒浸炒法和藥典法使其總含量顯著升高，順序?yàn)榫平捶ǎ舅幍浞ǎ旧罚舴?、清炒法和雷公法使其極顯著降低，降低程度順序?yàn)槔坠ǎ厩宄捶ǎ菊舴?；而酚類化合物，酒浸法、藥典法和清炒法使其含量顯著升高，順序?yàn)榍宄捶ǎ揪平ǎ舅幍浞ǎ旧?，但蒸法和雷公法使其顯著性降低，且雷公法降低幅度大于蒸法。從以上分析可以得出以下結(jié)論：目前所采用的6種炮制方法中，綜合三類化合物的含量來(lái)看，唯有藥典法即鹽炙法和酒浸炒法對(duì)三類化合物的含量均具升高作用，這與王增繪等[16]的研究結(jié)果有一點(diǎn)不同，該研究結(jié)果顯示鹽炙使補(bǔ)骨脂酚含量明顯下降。

3 討論

從古至今，補(bǔ)骨脂在臨床被歷代醫(yī)家廣泛用在治療骨質(zhì)疏松癥的各類補(bǔ)腎健骨方中[3，4]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，補(bǔ)骨脂可通過(guò)調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)化，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖活性、抑制破骨細(xì)胞的重吸收，從而對(duì)骨質(zhì)疏松起到一定防治作用[5-8]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ERα與ERβ受體在骨質(zhì)疏松癥的治療中都參與了骨質(zhì)的重建[10]。而補(bǔ)骨脂所含的化學(xué)成分能激動(dòng)ERα與ERβ受體，按激動(dòng)受體類型不同可分為兩類：選擇性激動(dòng)ERα受體的和同時(shí)激動(dòng)ERα和ERβ受體，但對(duì)ERβ的激動(dòng)作用大于ERα的，第一類主要是香豆素類化合物，第二類包括黃酮類和酚類化合物[9]。本課題組前期研究顯示，補(bǔ)骨脂酚在補(bǔ)骨脂中所占比例達(dá)4%左右，黃酮類成分占2%左右[17]，兩者在治療骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮的作用是不容忽視的。

表3 各位化合物含量值及主成分分析綜合主成分值

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，要使補(bǔ)骨脂在治療骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮最大藥效，即要求所采用的炮制方法能使香豆素類、黃酮類、單萜酚類化合物的含量升高。而煎煮溶劑的選擇對(duì)化合物的煎出率影響較大。補(bǔ)骨脂湯劑（水煎煮）入藥，會(huì)導(dǎo)致其水溶性小的黃酮及單萜酚類成分較難提取出來(lái)；而對(duì)于含補(bǔ)骨脂的中成藥，其提取方法較多水提、醇提、粉末入藥，或多種方法的綜合運(yùn)用。這就為炮制品的選擇帶來(lái)了一定難度。我們希望能在炮制品效應(yīng)成分含量高低與提取方法的選擇之間找到一個(gè)平衡點(diǎn)。綜合以上信息，可以看出鹽炙品、酒浸炒品在6種炮制品種占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。相對(duì)于鹽炙品，酒浸炒品效果雖佳，但可操作性及經(jīng)濟(jì)性較鹽炙品差。綜上所述，本研究認(rèn)為現(xiàn)行版中國(guó)藥典選擇以鹽水炒有一定科學(xué)依據(jù)。

1 中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015：187-188.

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Effects of Different Processing Methods on the Antiosteoporotic Effective Compositions of Psoralea corylifolia L.

Li Na1, Yan Dongmei1, Zhang Jinlian1, Gao Xiumei2
(1. School of Pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China; 2. The TCM Research Centre of Tianjin University of TCM, Tianjin 300193, China)

This study aimed at evaluating the effect of different processing methods on the contents of antiosteoporotic compositions inP. corylifolia. HPLC method adopted to analyze the contents of antiosteoporotic compositions， including coumarin (psoralen and isopsoralen)， flavonoids (neobavaisoflavone， corylifolin，corylifolinin and corylifol A) and meroterpenes (bakuchiol) inP. corylifolia. The contents were analyzed before and after the processing methods. Results： The results showed that the content of coumarin ， flavonoids and meroterpenes obviously changed in different processedP. Corylifoliain comparison with the crude drugs. In conclusion， it was demonstrated that the therapeutic efficacy of osteoporosis was enhanced by CP method which increased all of the three compositions. The testimony tallied with the Chinese medical theory： stir-frying with salt-water could enhance the effect of the tonification of spleen and kidney.

Psoralea corylifoliaL.， processing method， antiosteoporotic composition， effect

10.11842/wst.2017.01.019

R283.1

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2015-12-08

修回日期：2016-12-16

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81202911）：補(bǔ)骨脂炮制前后骨質(zhì)疏松藥效的變化及相關(guān)炮制機(jī)理研究，負(fù)責(zé)人：顏冬梅。

＊＊ 通訊作者：顏冬梅，講師，主要研究方向：中藥學(xué)教學(xué)及科研。