一種新型葡聚糖基水凝膠敷料的制備及其性質(zhì)

吳飛飛， 張俊芝， 朱　婕， 吳德群，　b

(東華大學 a. 紡織學院； b. 紡織面料技術教育部重點實驗室， 上海 201620)

皮膚是人體最大的器官，具有抵御外界微生物入侵、排泄及防止水分蒸發(fā)、調(diào)節(jié)體溫、維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等重要作用[1].由于燒傷、刀傷、擦傷和皮膚潰爛等原因，可能造成大面積皮膚損傷，皮膚受損后會造成體液內(nèi)水分、蛋白等成分的蒸發(fā)和流失，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等病原體容易在傷口上繁殖而引起感染，從而容易引起各種并發(fā)癥.隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏加快和醫(yī)療保健需求的不斷增長，傳統(tǒng)的敷料例如紗布、無紡布等已經(jīng)無法滿足市場上對于高性能醫(yī)用敷料的需求[2].理想的敷料[3]應該具有可吸收傷口滲出液，覆蓋及保護傷口不受感染，與傷口有較好的黏合力但不與傷口粘連，良好的透氣性、抗菌消炎等優(yōu)點[4].

水凝膠敷料是一種良好的創(chuàng)面敷料，其含有一定水分的三維網(wǎng)狀結(jié)構的高分子溶脹體，具有良好的吸水性和生物相容性，能與不平整的創(chuàng)面密切貼合但不會發(fā)生粘連，減少了細菌滋生的機會且易于更換.由于水凝膠與被固定在其中的藥物或生物活性分子的相互作用極其微小，可使被固定的物質(zhì)保持長時間的活性，可以摻入各種藥物和生長因子促進傷口的愈合[5].由此表明，水凝膠敷料較為接近理想敷料的要求.

目前，醫(yī)用水凝膠敷料的主流研究材料仍是聚丙烯酸類、聚乙烯醇類等人工合成材料[6-8].雖然人工合成材料的力學性能優(yōu)于天然材料，但其生物相容性和生物安全性風險一直是難以逾越的技術難點.研究者在努力提高人工合成材料的生物相容性的同時，也從未停止尋找更合適的天然生物材料以制備水凝膠[9-10].

葡聚糖(Dextran)，又稱右旋糖酐，是一種水溶性天然生物性多糖，由葡萄糖單元脫水聚合而成，具有良好的生物相容性、抗蛋白吸附性[11]，其主鏈上含有很多游離的羥基，易于修飾和交聯(lián)[12].目前報道葡聚糖較多的生理功能主要包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒和抗蛋白吸附[11]等.其中免疫調(diào)節(jié)功能被認為是最重要的生理活性功能，其能夠活化巨噬細胞和嗜中性白血球等，誘導細胞因子產(chǎn)生，有效增強免疫系統(tǒng)，在感染病和創(chuàng)傷治療方面深受矚目.文獻[13]研究了甲基丙烯酸縮水甘油酯改性葡聚糖的反應機理，即在二甲亞砜(DMSO)中二者發(fā)生酯交換反應，得到葡聚糖的甲基丙烯?；苌?GMA-Dex).在此基礎上，文獻[14]合成了具有pH值敏感性的GMA-Dex與丙烯酸共聚水凝膠.文獻[15]研究了將葡聚糖用馬來酸酐修飾后，在光引發(fā)劑作用下與聚-異丙基丙烯酞胺的(NIPAAm)共聚制備具有溫度和pH值雙重敏感特性的水凝膠，通過調(diào)節(jié)聚合單體比例可制備出相轉(zhuǎn)變溫度與人體溫度相近的水凝膠，用于生物工程、生物技術領域.

上述制備的水凝膠都是通過環(huán)氧開環(huán)和酯化反應獲得側(cè)鏈上可交聯(lián)雙鍵.由于?；磻漠a(chǎn)率遠遠高于環(huán)氧開環(huán)和酯化反應，本文通過?；磻岣呓又Ψ磻D(zhuǎn)化率，以提高交聯(lián)密度，從而提高水凝膠的強度.雖然水凝膠敷料所提供的濕潤環(huán)境有助于細胞生長和促進傷口的愈合，但同時也有利于有害微生物的滋長，而有關葡聚糖水凝膠的抗菌性能研究報道較少.本文通過化學接枝季銨鹽類抗菌劑和預載入廣譜抗菌藥物洗必泰，使水凝膠具有雙重抗菌性.季銨鹽類抗菌劑[16]一直是人們研究和應用最廣泛的陽離子有機抗菌劑，它能夠吸附帶負電荷的細菌，引起胞壁結(jié)構的破壞，使細胞內(nèi)物質(zhì)流出，從而達到抗菌的作用，而且對人體安全無毒，價格較低廉.洗必泰具有高效穩(wěn)定的抑菌能力，且對人體無害，已被廣泛應用于抗菌領域長達30多年[17].

本文將2，3- 環(huán)氧丙基三甲基氯化銨開環(huán)接枝到葡聚糖大分子上得到葡聚糖季銨鹽衍生物，再控制其羧基化的程度，通過原位光交聯(lián)方法制備得到兩種水凝膠敷料，并研究了其結(jié)構特征，以及溶脹、降解、藥物緩釋、抗菌、抗蛋白吸附等性能.

1　試　驗

1.1　主要原料

2，2′- (乙烯二氧)雙(乙胺)(DA)、1- 羥基苯并三唑、1- (3- 二甲氨基丙基) -3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽、4- 二甲氨基吡啶、2，3- 環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTMAC)、丁二酸酐(SA)和牛血清蛋白(BSA)購買于上海安耐吉化學有限公司；二碳酸二叔丁酯和氯化鋰購買于國藥集團化學試劑有限公司；甲基丙烯酸(MA)購買于北京伊諾凱科技有限公司；葡聚糖(MW=20 000)購買于百靈威科技有限公司；濃硫酸、濃鹽酸、碳酸氫鈉、氯化鈉、二氯甲烷、乙酸乙酯、N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜(DMSO)，均為分析純，購買于上海凌峰化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購買于上海酶聯(lián)生物科技；洗必泰購買于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；瓊脂，生物純，購買于中國惠興生化試劑有限公司；大腸桿菌(E.coli ATCC 8099)和金黃色葡萄球菌(S.aureus ATCC 6538)購買于南京便診生物科技有限公司.

1.2　合成小分子(DA-MA)

參照文獻[18]，將二碳酸二叔丁酯(2.0 g、 0.009 18 mol)溶于二氯甲烷(50 mL)中，然后逐滴加入到溶解了DA(8.151 g、 0.055 mol)的二氯甲烷(50 mL)中，于0 ℃條件下反應24 h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除多余的二氯甲烷，再用飽和食鹽水水洗，乙酸乙酯萃取3次，將有機層干燥得到產(chǎn)物3.

參照文獻[19]，將產(chǎn)物3(1.0 g、 0.004 0 mol)與MA(0.344 2 g、 0.004 0 mol)加入到二氯甲烷中，再加入1- (3- 二甲氨基丙基) -3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.766 8 g、 0.004 0 mol)和1- 羥基苯并三唑(0.540 5 g、 0.004 0 mol)，在0 ℃條件下反應10 h.再分別用質(zhì)量分數(shù)為5%的鹽酸溶液、質(zhì)量分數(shù)為5%的碳酸氫鈉溶液、去離子水、飽和食鹽水洗滌，分離有機層并將有機溶液去除得到產(chǎn)物5.

將產(chǎn)物5溶于少量乙酸乙酯，通入連續(xù)的氯化氫氣體至溶液中有固體沉淀析出，去除多余的乙酸乙酯，得到固體產(chǎn)物6[20].

1.3　制備葡聚糖基水凝膠

1.3.1合成葡聚糖基大分子(Dex-GTMAC-SA-DAMA)

參照文獻[13]，在堿性環(huán)境中將GTMAC(4.68 g， 0.031 mol)開環(huán)接枝到葡聚糖(5.0 g， 0.031 mol)上，得到葡聚糖季銨鹽衍生物.再參照文獻[15]將葡聚糖季銨鹽衍生物(2.0 g、 0.010 8 mol)與SA(1.082 g、 0.010 8 mol； 2.164 g、 0.021 6 mol)發(fā)生酯化反應，得到羧基化的產(chǎn)物11(Dex-GTMAC-SA).

將所得產(chǎn)物11(2.0 g、 0.007 mol)與DA-MA(0.79 g、 0.003 7 mol； 1.33 g、 0.006 2 mol)溶于DMSO中，加入1- (3- 二甲氨基丙基) -3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽和1- 羥基苯并三唑，在常溫下反應10 h，再將產(chǎn)物用異丙醇沉淀析出，得到產(chǎn)物12(Dex-GTMAC-SA-DAMA).

1.3.2制備葡聚糖基水凝膠

將葡聚糖基大分Dex-GTMAC-SA-DAMA及廣譜抗菌藥物洗必泰溶于蒸餾水中，加入引發(fā)劑過硫酸銨，通過紫外光照引發(fā)雙鍵交聯(lián)得到水凝膠.葡聚糖水凝膠合成反應路線如圖1所示，各原料的投料比以及GTMAC和SA對葡聚糖大分子的取代度如表1所示.

圖1　Dex-GTMAC-SA-DAMA水凝膠的合成Fig.1　Synthesis of Dex-GTMAC-SA-DAMA hydrogel

樣品物質(zhì)的量/mol葡聚糖GTMACSADA-MA取代度/% GTMACSADex-GTMAC-SA-DAMA(1∶1)1110.52 15.1152Dex-GTMAC-SA-DAMA(1∶2)1120.88 15.1188

1.4　性能表征與測試

核磁共振氫譜(1H NMR)測試.在核磁管中將單體溶解在1 mL氘代水中，采用Avance 400型核磁共振波譜儀測試其分子內(nèi)部氫的種類及數(shù)量.

傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)測試.取小塊干燥水凝膠置于測試臺上，用探測頭壓緊，采用Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀對試驗材料進行光譜分析，測試范圍為350～7800 cm-1，測試水凝膠的分子組成及結(jié)構.

場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)測試.將待測樣品用導電膠黏到樣品臺上，噴金后放入S-4800型場發(fā)射掃描電子顯微鏡樣品室，在加速電壓為5 kV的條件下，觀察水凝膠的表面形態(tài).

1.5　水凝膠溶脹性能測試

將凍干后的水凝膠稱取質(zhì)量，記為md，之后浸入PBS中(pH值為7.4， 0.1 mol/L).在預定的時間取出，用濕濾紙吸取水凝膠表面的水分后稱取質(zhì)量，記為ms，直至水凝膠達到溶脹平衡為止.水凝膠的溶脹度(S)計算如式(1)所示.

(1)

1.6　水凝膠降解性能測試

先將達到溶脹平衡的水凝膠冷凍干燥后稱取質(zhì)量，記為mst.再將其靜置于100 mL已精確配制好的胰蛋白酶溶液中(0.3 mg/mL)， 37 ℃水浴，恒溫緩慢降解.每隔24 h從溶液中取出水凝膠，將其冷凍干燥，干燥后準確稱取質(zhì)量，記為mdt.水凝膠的失重率(W)計算如式(2)所示.

(2)

1.7　水凝膠藥物緩釋測試

在水凝膠制備之前，預先載入微溶于水的廣譜抗菌藥物洗必泰，使洗必泰均勻地分散在水凝膠三維網(wǎng)絡中，再將載藥水凝膠放在50 mL的PBS(pH值為7.4， 0.1 mol/L)中浸泡48 h，達到溶脹平衡后，將水凝膠取出放入37 ℃的200 mL的PBS(pH值為7.4， 0.1 mol/L)中，在設定的時間點定時取樣2 mL，立即補加等量的PBS(pH值為7.4， 0.1 mol/L)，用日立U-4100型紫外可見近紅外分光儀在254 nm波長處分別測定其吸光度，從而測定藥物累計釋放量.洗必泰的體外累計釋放率(Q)計算如式(3)所示.

(3)

式中：Mt為釋放t時間后洗必泰的累計釋放量；M0為預載入水凝膠內(nèi)的洗必泰質(zhì)量.

1.8　水凝膠抗菌性能測試

選取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為測試菌種，采用瓊脂平皿擴散法測試表征水凝膠的抗菌效果.將水凝膠置于涂有菌液的瓊脂培養(yǎng)基中央，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測量抑菌帶外徑寬度.每隔24 h 將水凝膠移植至新的培養(yǎng)皿中，直至抑菌帶消失，從而測試其抗菌持久性.抑菌帶寬度(H)的計算如式(4)所示.

(4)

式中：D為抑菌帶外徑的平均值(mm)；d為水凝膠的直徑(mm).

1.9　水凝膠抗蛋白吸附性能測試

先將測試的水凝膠用高純水充分清洗，然后將其放置在PBS(pH值為7.4， 0.1 mol/L)中浸泡2 h，然后用0.5 mL的異硫氰酸熒光素標記的牛血清蛋白(FITC-BSA)涂覆在準備好的水凝膠上，于37 ℃孵化2 h，孵化完成后用PBS(pH值為7.4， 0.1 mol/L)充分清洗，用島津RF-6000型熒光分光光度計在吸入峰495 nm和激發(fā)峰525 nm波長處測定蛋白的吸光度.蛋白質(zhì)吸附量(P)計算如式(5)所示.

(5)

式中：c0、c1分別為水凝膠吸附前后的FITC-BSA質(zhì)量濃度(g/mL)；V0、V1分別為水凝膠吸附前后的FITC-BSA溶液體積(mL)；A為樣品的總表面積(cm2).

2　結(jié)果與討論

2.1　水凝膠的1H-NMR表征

小分子DA-MA、葡聚糖Dextran和葡聚糖大分子Dex-GTMAC-SA-DAMA的1H-NMR譜圖如圖2所示.由圖2可知：小分子DA-MA上雙鍵的信號峰在化學位移5.3和5.5處，甲基的信號峰在化學位移1.98 處；葡聚糖Dextran上1號位的信號峰在化學位移4.8處，環(huán)上其他質(zhì)子的信號峰在化學位3.3～3.9處；葡聚糖大分子Dex-GTMAC-SA-DAMA的1H-NMR譜圖中，出現(xiàn)了DA-MA和Dextran沒有的信號峰.在化學位移3.2處的信號峰屬于季銨基團上的甲基，在化學位移5.1處的信號峰為葡聚糖結(jié)合季銨基團后而引起糖環(huán)1號位的化學位移發(fā)生變化后的信號峰，在化學位移2.5和2.6處的信號峰屬于SA開環(huán)后的質(zhì)子峰.因此，確定Dextran分子鏈上成功引入了GTMAC、SA及小分子DA-MA.根據(jù)g位的氫面積積分(x)與葡聚糖單元環(huán)1號位上的氫面積積分(y)，通過公式(x/2y)×100%得到產(chǎn)物的實際取代度，葡聚糖季銨鹽大分子與SA按摩爾比1∶1和1∶2投料得到的實際取代度分別為52%、 88%，由此得出，SA與Dextran的接枝反應轉(zhuǎn)化率比較高，且反應取代度可控.各個位置質(zhì)子氫的化學位移歸屬如圖2所示.

圖2　DA-MA、 Dextran、 Dex-GTMAC-SA-DAMA的1H-NMR譜圖Fig.2　1H-NMR spectra of DA-MA, Dextran， Dex-GTMAC-SA-DAMA

2.2　水凝膠的FT-IR表征

圖3　Dextran、 Dex-GTMAC-SA-DAMA水凝膠的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.3　FT-IR spectra of Dextran and Dex-GTMAC-SA-DAMA hydrogels

2.3　水凝膠的FE-SEM表征

水凝膠溶脹樣品進行冷凍干燥處理后的電鏡照片如圖4所示.由圖4中可以看出，水凝膠孔洞均勻且貫通，即存在著明顯的通道結(jié)構，為水分子進出提供了路徑，從而有利于水分子的擴散.其中，Dex-GTMAC-SA-DAMA(1∶1)的孔徑在10 μm左右；Dex-GTMAC-SA-DAMA(1∶2)的孔徑為 6～7 μm.隨著SA投料摩爾比的增加，孔洞的密度增加而孔徑減小.這是由于葡聚糖大分子上取代度增加，從而使凝膠網(wǎng)絡的交聯(lián)密度增加，孔洞的數(shù)量增加，孔徑減小.

(a) Dex-GTMAC-SA-DAMA (1∶1)

(b) Dex-GTMAC-SA-DAMA (1∶2)

2.4　水凝膠溶脹率表征

水凝膠在37 ℃的PBS(pH值為7.4， 0.1 mol/L) 中溶脹度隨時間的變化規(guī)律如圖5所示.由圖5可以看出，水凝膠的溶脹速率和溶脹度都隨著SA取代度的增加而降低，與FE-SEM觀察的結(jié)果一致.這是由于隨著SA投料摩爾比的增加，葡聚糖大分子鏈上羥基被取代的程度越大，單體的雙鍵接枝率越大，單位體積內(nèi)交聯(lián)鍵所占的百分比越大，交聯(lián)程度越大，交聯(lián)孔徑越小，因此溶脹能力下降.在48 h后達到溶脹平衡，Dex-GTMAC-SA-DAMA(1∶1)和Dex-GTMAC-SA-DAMA(1∶2)的溶脹率分別達到711.7%和645.0%.

圖5　Dex-GTMAC-SA-DAMA水凝膠的溶脹度隨時間的變化曲線Fig.5　Swelling kinetics of time for Dex-GTMAC-SA-DAMA hydrogels

2.5　水凝膠酶降解表征

Dex-GTMAC-SA-DAMA水凝膠的酶降解失重曲線如圖6所示.由圖6可以看出，Dex-GTMAC-SA-DAMA(1∶1)和Dex-GTMAC-SA-DAMA(1∶2)水凝膠隨降解時間的延長，其失重速率逐漸減慢，而未經(jīng)過酶降解的水凝膠的質(zhì)量幾乎無變化.兩者分別在96和144 h后，其質(zhì)量不再發(fā)生明顯變化，胰蛋白酶結(jié)束降解水凝膠的交聯(lián)側(cè)鏈上的酯鍵和酰胺鍵，此時的失重率分別為28.3%和22.5%[22-23].Dex-GTMAC-SA-DAMA水凝膠的交聯(lián)密度越高，胰蛋白酶降解破壞交聯(lián)點引起降解所需時間越長.

圖6　Dex-GTMAC-SA-DAMA水凝膠的酶降解曲線圖Fig.6　Enzymatic degradation kinetics of Dex-GTMAC-SA-DAMA hydrogels

2.6　水凝膠藥物緩釋表征

以累計水凝膠體外藥物釋放率對時間作圖得到藥物緩釋曲線如圖7所示.由圖7可以看出，隨著SA投料比的增加，洗必泰釋放速率減小，這是由于水凝膠的交聯(lián)密度增加引起的.在前期48 h處于爆釋狀態(tài)，Dex-GTMAC-SA-DA-MA(1∶1)和Dex-GTMAC-SA-DAMA(1∶2)水凝膠中的洗必泰緩釋率分別達到43.2%和30.1%.爆釋之后，負載藥物開始緩慢地釋放，在240 h后，兩種水凝膠中的洗必泰緩釋達到平衡，緩釋率分別為68.4%和57.9%.

圖7　　Dex-GTMAC-SA-DAMA水凝膠的藥物緩釋動力學曲線Fig.7　Cumulative release kinetics of Dex-GTMAC-SA-DAMA hydrogels

2.7　水凝膠抗菌表征

Dex-GTMAC-SA-DAMA(1∶2)不載藥水凝膠與載藥水凝膠針對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的擴散法照片如圖8所示.由圖8可以看出，水凝膠對這兩種菌種的抗菌效果類似.不載藥的水凝膠也具有優(yōu)越的抗菌活性，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈寬度分別為(1.76±0.29)mm和(2.25±0.22)mm，抗菌性能達到6 d之久.這是由于Dex-GTMAC-SA-DAMA水凝膠是采用GTMAC以化學鍵與葡聚糖基體分子相連接的技術制備的抗菌水凝膠，不但抗菌性能優(yōu)異，而且抗菌劑不會遷移滲出到外面，具有持久的抗菌性能.而載藥的水凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈寬度分別為(4.12±0.34)mm和(3.57±0.39)mm，比不載藥的抗菌圈更大，因而具有更優(yōu)越的抗菌活性.這是由于廣譜抗菌藥物洗必泰在物理作用下滲出到水凝膠外面，因而抑菌圈明顯比未載藥的抑菌圈大.

(a) 大腸桿菌

(b) 金黃色葡萄球菌

2.8　水凝膠抗蛋白吸附表征

采用熒光光譜法來測定市售的德國保赫曼的德濕舒水凝膠敷料(Hydrosorb)、 Dex-GTMAC-SA-DAMA(1∶1)和Dex-GTMAC-SA-DA-MA(1∶2)水凝膠表面的蛋白吸附情況，結(jié)果如表2所示.由表2可以看出，Dex-GTMAC-SA-DAMA水凝膠的蛋白質(zhì)吸附量遠遠低于Hydrosorb水凝膠敷料，表現(xiàn)出良好的抗蛋白吸附能力.這是由于Dex-GTMAC-SA-DAMA水凝膠采用的基材為葡聚糖，葡聚糖能有效地抑制蛋白質(zhì)和生物體的吸附，具有很好的抗蛋白吸附性能[24].

表2　不同水凝膠樣品的牛血清蛋白吸附

3　結(jié)　論

(1) 采用無毒的光交聯(lián)技術，通過原位光引發(fā)雙鍵聚合，制備葡聚糖基水凝膠.

(2) 通過反應物投料比的不同，制備了不同交聯(lián)度的水凝膠.隨著丁二酸酐投料摩爾比的增加，水凝膠的交聯(lián)度增大，其孔徑減小，溶脹率降低，酶降解的失重率減小，藥物緩釋率和蛋白吸附量均減小.

(3) 通過化學接枝季銨鹽分子及物理載入洗必泰抗菌藥物，水凝膠達到雙重抗菌的效果.

(4) 本文所制水凝膠符合理想型敷料應該具有的可吸收傷口滲出液、保持傷口接觸面的溫度及濕度、抗菌消炎、生物相容性好、抗蛋白吸附等優(yōu)點，因此有望成為一種新型的生物可降解的抗菌水凝膠敷料.

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