幾種淫羊藿提取物中淫羊藿黃酮的分離

武 博， 劉 春 瑩， 郭 美 娟， 李 鶴， 魚 紅 閃， 金 鳳 燮

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

幾種淫羊藿提取物中淫羊藿黃酮的分離

武 博， 劉 春 瑩， 郭 美 娟， 李 鶴， 魚 紅 閃， 金 鳳 燮

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

研究了從4種淫羊藿提取物中分離朝藿定A、B、C和淫羊藿苷單體的方法。原料淫羊藿提取物中朝藿定A、B、C及淫羊藿苷的質(zhì)量比為5.95∶11.0∶24.6∶58.5。100 g原料經(jīng)D-280大孔樹脂柱吸附結(jié)晶得到20.1 g純度90.0%以上淫羊藿苷；其母液濃縮得到29.8 g的淫羊藿混合黃酮，其中朝藿定A、B、C及淫羊藿苷質(zhì)量比為10.8∶18.8∶44.3∶26.2，無法用結(jié)晶法分離淫羊藿苷。結(jié)果表明，利用硅膠柱法分離淫羊藿苷和朝藿定A、B、C，其產(chǎn)物純度分別為95.0%、91.0%、90.5%、93.0%。

淫羊藿黃酮；淫羊藿苷；朝藿定；大孔樹脂；硅膠柱

0 引 言

淫羊藿的主要有效成分是淫羊藿總黃酮和淫羊藿多糖[1]，其總黃酮具有防抑郁、抗腫瘤、抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能[2]。淫羊藿莖葉中含有40余種淫羊藿黃酮，但80%～90%的黃酮類化合物為淫羊藿苷(Icariin)、朝藿定A(Epimedin A)、朝藿定B(Epimedin B)、朝藿定C(Epimedin C)[3]。淫羊藿黃酮的分離提取方法主要有醇提取法、機(jī)溶劑萃取法、水提法、超聲波和微波提取法、大孔樹脂吸附、制備色譜分離法等[4-5]。已有文獻(xiàn)中只是對淫羊藿總黃酮及淫羊藿苷分離的初步研究，其操作方法不系統(tǒng)，提取率不理想，且沒有關(guān)于淫羊藿苷和朝藿定A、B、C 4種淫羊藿黃酮單體的分離的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以幾種市銷的淫羊藿提取物為原料，利用大孔脫色樹脂、硅膠柱分離法得到幾種淫羊藿黃酮單體。

1 材料與方法

1.1 材 料

淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品，朝藿定A、B、C；市售淫羊藿提取物樣品，淫羊藿苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%；其他試劑均為分析純。

1.2 方 法

1.2.1 D-280大孔樹脂制備淫羊藿苷

稱取淫羊藿提取物，溶解于10倍體積的60%乙醇溶液中，上樣于同體積的預(yù)先處理過的D-280大孔樹脂柱中，反復(fù)脫色3～4次，再用12倍柱體積的60%乙醇溶液洗脫，將脫色液減壓濃縮、結(jié)晶，收集沉淀，用50%的冰凍乙醇溶液洗滌2次，干燥后得到淫羊藿苷。其母液再經(jīng)D-280大孔樹脂柱脫色、洗脫、減壓濃縮、干燥得到淫羊藿混合黃酮，用于硅膠柱分離淫羊藿黃酮單體。

1.2.2 硅膠柱分離母液中的淫羊藿混合黃酮

取分離淫羊藿苷后的淫羊藿混合黃酮4 g，與45 mL四氫呋喃-乙醇溶液、10 g 80～100目硅膠混合，水浴中攪拌蒸干，制備成樣品膠，再放入預(yù)先裝入80 g的300～400目的玻璃柱上層。先用乙酸乙酯通柱，再用洗脫劑洗脫，每瓶收集80 mL；用TLC方法檢測收集的洗脫液中合并單點(diǎn)洗脫液，減壓蒸餾、干燥，分別得到其單體。

1.2.3 淫羊藿黃酮的檢測

TLC檢測：展開劑為體積比為8∶7∶1∶1的乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水混合液，測定254 nm處OD，并以各標(biāo)準(zhǔn)品為參比。

HPLC檢測[6]：Waters2695高效液相色譜分析儀；色譜柱，中匯達(dá)Kromasil C18柱(5 μm，φ250 mm×4.6 mm)。流動相，乙腈(A)-水(B)：0～8 min，17%～27% A；8～32 min，27% A等梯度；32～60 min，27%～85% A線性梯度；60～70 min，85% A等梯度；70～80 min，85%～90% A；進(jìn)樣量，10 μL；柱溫，35 ℃；體積流量，1.0 mL/min；檢測波長，273 nm。

稱取朝藿定A、B、C、淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品各2 mg，分別加10 mL 50%乙醇，制成0.2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測樣品；經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，待用。

2 結(jié)果與討論

2.1 市銷淫羊藿提取物原料成分分析

分別對市售的淫羊藿提取物樣品進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果如圖1所示。表1為3種樣品提取物中主要黃酮的含量。從圖1和表1可知，3種淫羊藿提取物中主要黃酮為淫羊藿苷、朝藿定A、B和C；其中淫羊藿苷含量最高，在總黃酮中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為朝藿定A最低。

(a) 樣品Ⅰ

(b) 樣品Ⅱ

(c) 樣品Ⅲ

圖1 3種樣品中淫羊藿提取物成分的HPLC圖

Fig.1 HPLC result of epimedium extract components in three samples

表1 3種淫羊藿提取物樣品中主要黃酮的

2.2 D-280大孔樹脂分離制備淫羊藿苷

3種淫羊藿提取物中50%以上黃酮為淫羊藿苷；以樣品Ⅰ為原料，分離制備淫羊藿苷。100 g淫羊藿提取物經(jīng)純化得到淫羊藿苷20.1 g，純度為95.0%。母液經(jīng)處理得到淫羊藿混合黃酮29.8 g；用HPLC法檢測，結(jié)果如圖2、表2所示。由表2可知，淫羊藿苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從原料中的58.5%降為26.2%，在此條件下很難用結(jié)晶法分離淫羊藿苷，因此利用硅膠柱進(jìn)行分離母液的淫羊藿混合黃酮。

2.3 硅膠柱法分離淫羊藿混合黃酮

稱取淫羊藿混合黃酮4 g，經(jīng)TLC方法分離、收集，分別得到淫羊藿苷110 mg，朝藿定A50 mg、朝藿定B 30 mg、朝藿定C 220 mg；經(jīng)HPLC檢測，淫羊藿苷純度為95.0%，朝藿定C純度為93.0%，朝藿定A和B的純度分別91.0% 和90.5%。檢測結(jié)果分別如圖3、4所示。

圖2 母液中淫羊藿混合黃酮的HPLC圖

表2 母液的淫羊藿混合黃酮的HPLC數(shù)據(jù)分析

i，淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品；A，朝藿定A標(biāo)準(zhǔn)品；B，朝藿定B標(biāo)準(zhǔn)品；C，朝藿定C標(biāo)準(zhǔn)品；樣，淫羊藿混合黃酮；1，產(chǎn)物淫羊藿苷；2，產(chǎn)物朝藿定A；3，產(chǎn)物朝藿定B；4，產(chǎn)物朝藿定C單體

圖3 TLC檢測硅膠柱分離淫羊藿混合黃酮的結(jié)果

Fig.3 TLC result of mixed epimedium flavonoids separated by silica gel column

結(jié)果表明，當(dāng)母液的淫羊藿混合黃酮中淫羊藿苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低且無法用結(jié)晶法分離時(shí)，可以用硅膠柱法分離得到淫羊藿苷及朝藿定A、B、C單體。

3 結(jié) 論

淫羊藿提取物樣品Ⅰ中朝藿定A、B、C及淫

圖4 硅膠柱分離結(jié)果的HPLC圖

羊藿苷的質(zhì)量比為5.95∶11.0∶24.6∶58.5，即淫羊藿苷在總黃酮中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58.5%；由此可見，結(jié)晶法可以分離淫羊藿苷單體；但是分離后的母液中淫羊藿苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，只有26.2%，淫羊藿苷幾乎全部溶于60%乙醇中，很難用結(jié)晶法再分離淫羊藿苷，因此利用硅膠柱法分離母液的淫羊藿混合黃酮。

100g淫羊藿提取物經(jīng)D-280大孔樹脂分離、結(jié)晶得到20.1g純度為95.0%的淫羊藿苷；其母液得到29.8g淫羊藿混合黃酮。4g母液的淫羊藿混合黃酮經(jīng)硅膠柱分離，得到淫羊藿苷、朝藿定A、B、C4種單體，分別為110、50、30、220mg，純度分別為95.0%、91.0%、90.5%、93.0%。

[1] 王昌林,李星,王粵新.淫羊藿及其有效成分的藥理研究概況[J].中國中藥雜志,1998,23(3):55-57.

[2] 許碧連,吳鐵,王暉,等.淫羊藿總黃酮藥理作用的研究現(xiàn)狀[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2003,8(1):115-117.

[3]XUYQ,LIZZ,YUANL,etal.VariationofepimedinsA-Candicariinintenrepresentativepopulationsofepimediumbrevicornumaxim,andimplicationsforutilization[J].ChemistryandBiodiversity, 2013, 10(4): 711-721.

[4] 張琳,張瑾.淫羊藿總黃酮的提取方法研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)驗(yàn),2004,18(5):63-64.

[5] 雷永濤,李莉,郝小燕,等.淫羊藿總黃酮的提取和分離純化工藝研究[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,37(2):137-140.

[6] 郭青,吳曉燕,寧青,等.淫羊藿莖葉中5種黃酮類成分分析及質(zhì)量評價(jià)[J].中草藥,2011,42(10):2028-2032.

Separation of epimedium flavonoids in several epimedium extracts

WU Bo, LIU Chunying, GUO Meijuan, LI He, YU Hongshan, JIN Fengxie

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Separation methods of four kinds of monomer were studied to separate icariin epimedium extract, which included icariin, Epimedin A, B and C. The mass ratio of Epimedin A, B, C and icariin was 5.95∶11.0∶24.6∶58.5 in the raw materials. 20.1 g icariin was obtained from 100 g epimedium extract by D-280 macroporous resin column with 60% ethanol, which purity was more than 90.0%. 29.8 g mixed epimedium flavonoids was obtained from mother liquor. The mass ratio of Epimendin A, B, C and icariin was 10.8 to 18.8 to 44.3 to 26.2, indicating that icariin could not be separated by crystallization. The result showed that the product purity of icariin, Epimendin A, B, C were 95.0%, 91.0%, 90.5%, 93.0% separated by silica gel column, respectively.

epimedium flavonoids; icariin; epimendin; macroporous resin; silica gel column

2015-06-09.

“重大新藥創(chuàng)新”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09503001-003).

武 博(1990-)，女，碩士研究生；通信作者：魚紅閃(1968-)，男，教授.

R284.2

A

1674-1404(2017)02-0089-03

武博,劉春瑩,郭美娟,李鶴,魚紅閃,金鳳燮.幾種淫羊藿提取物中淫羊藿黃酮的分離[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(2):89-91.

WU Bo, LIU Chunying, GUO Meijuan, LI He, YU Hongshan, JIN Fengxie. Separation of epimedium flavonoids in several epimedium extracts[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(2): 89-91.