歐李仁多肽的制備及其對(duì)DPPH自由基清除作用的研究

張 英，郭寶禹，張 玲，侯紅萍

（1.山西省太谷縣質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試所，山西太谷 030800；2.山西省太谷中學(xué)校，山西太谷 030800；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西太原 030031；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷 030800）

歐李仁多肽的制備及其對(duì)DPPH自由基清除作用的研究

張 英1，郭寶禹2，張 玲3，*侯紅萍4

（1.山西省太谷縣質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試所，山西太谷 030800；2.山西省太谷中學(xué)校，山西太谷 030800；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西太原 030031；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷 030800）

通過比較不同酶解液對(duì)DPPH自由基的清除能力，來確定最佳的歐李仁肽制備工藝。結(jié)果表明，3種酶復(fù)合水解得到的歐李仁多肽具有較好的清除DPPH自由基能力，IC50值為1.06 mg/mL。

酶解；歐李仁多肽；DPPH自由基

歐李（Cerasus humilis（Bge）Sok） 是我國特有的、古老的一種野生灌木果樹，果實(shí)中礦物質(zhì)含量豐富，含鈣量高，也稱“鈣果”，為薔薇科櫻桃屬。對(duì)歐李進(jìn)行野生果樹資源調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，其具有特殊的抗旱能力，適宜在干旱地區(qū)種植，由于歐李個(gè)體小，可以作為草園栽培，與喬木果樹套種可以增加收入。此外，歐李還可用于盆景、保沙固土、水果深加工、醫(yī)療保健等方面，并能獲得較高的效益[1]。

歐李果仁中的蛋白含量遠(yuǎn)高于其他植物，如杏、扁桃仁、核桃中蛋白含量，其中必需氨基酸的含量占總氨基酸含量的24%[2]?，F(xiàn)在，歐李的利用主要集中在果實(shí)的初加工，如歐李果汁飲料、歐李果醋等天然保健制品[3-6]。市場(chǎng)上還有一些有關(guān)歐李的深加工產(chǎn)品，如歐李蜜餞、糖水歐李罐頭、歐李果脯等。

目前，有關(guān)對(duì)歐李仁的研究報(bào)道比較少，有人以歐李仁為原料提取營養(yǎng)保健油[7]，并對(duì)歐李仁中的蛋白特性進(jìn)行了基礎(chǔ)性研究[8]，但目前也只是在試驗(yàn)階段。另外，還有一些對(duì)歐李仁活性成分進(jìn)行提取的研究，如歐李多酚、歐李紅色素[9-10]等。由于果實(shí)加工后會(huì)產(chǎn)生大量的歐李仁，歐李仁中所含大量有效成分的蛋白質(zhì)并未得到充分的重視和利用。因此，試驗(yàn)以歐李仁為原料制備活性肽，為植物蛋白制備活性肽提供一定的理論依據(jù)，同時(shí)也對(duì)天然抗氧化劑和免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用與開發(fā)，以及歐李資源的綜合利用提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。

1 材料與設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料

歐李仁，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園提供。

1.2 主要試劑與儀器

蛋白酶，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；氫氧化鈉、鹽酸，天津化工廠提供；DPPH自由基。

電子天平，JY-15A型多功能粉碎機(jī)，PHBJ-260型便攜式pH計(jì)，離心機(jī)，756型紫外可見分光光度計(jì)，JDG-0.2型真空冷凍干燥機(jī)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 歐李仁多肽的制備

2.1.1 歐李仁蛋白的提取

粉碎后的歐李仁用5倍的水分散，然后用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至9.5，攪拌30 min并且保持上述pH值不變，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心20 min，靜置后取上清液，再用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為4，經(jīng)沉淀得到蛋白。在室溫下，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心20 min，經(jīng)沉淀后用蒸餾水分散，將pH值調(diào)至7，冷凍干燥處理即可得到歐李仁蛋白。

2.1.2 歐李仁蛋白不同酶解液的制備

（1）單酶水解。各種蛋白酶在各自最合適的條件下，分別對(duì)歐李仁蛋白進(jìn)行水解（3種蛋白酶分別為堿性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶），底物質(zhì)量濃度統(tǒng)一規(guī)定為4%（水解條件見表1），分別收集上述3種酶在30，60，90 min后的酶解液待測(cè)。

不同種類蛋白酶的水解條件見表1。

表1 不同種類蛋白酶的水解條件

（2）雙酶復(fù)合水解。首先，在最合適的條件下，將堿性蛋白酶水解30 min；然后添加胰蛋白酶，對(duì)其進(jìn)行水解30 min，然后再滅酶、采集酶解液。堿性蛋白酶與中性蛋白酶按上述方法復(fù)合水解，同法中性蛋白酶與胰蛋白酶復(fù)合水解，分別收集上述3種酶解液待測(cè)。

（3）三酶復(fù)合水解。首先，在最合適的條件下，將堿性蛋白酶水解30 min，然后添加胰蛋白酶水解30 min，最后加入中性蛋白酶繼續(xù)水解30 min，滅酶后收集酶解液待測(cè)。

2.1.3 不同種類的酶解液對(duì)DPPH自由基清除率的對(duì)比

按照參考文獻(xiàn)[11]的方法，先配制125 μmoL/L的DPPH·無水甲醇溶液，然后在試管中分別加入不同的歐李仁蛋白酶解液2 mL，DPPH·（125 μmoL/L）溶液2 mL，劇烈的震蕩，并靜置30 min，然后在517nm處測(cè)定吸光度（Ai）。在另外2支試管中，分別加入待測(cè)液2 mL和甲醇2 mL作為對(duì)照樣品（Aj），DPPH·溶液2 mL和甲醇2 mL作為空白（Ac），再按上面所述方法測(cè)定吸光度。根據(jù)下列公式分別計(jì)算出各待測(cè)樣品對(duì)DPPH自由基的清除率，并且平行重復(fù)3次，再取平均值。

式中：Ai——DPPH·試劑與樣品液混合液的吸光度；

Aj——空白溶劑與樣品液混合液的吸光度；

Ac——空白溶劑與DPPH·試劑混合液的吸光度。

2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)用SPSS軟件處理，通過單因子方差分析（One-way ANOVN，LSD）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以X±SD表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 歐李仁多肽酶解法的篩選

歐李仁蛋白不同酶解液對(duì)DPPH自由基清除率的影響見圖1。

圖1 歐李仁蛋白不同酶解液對(duì)DPPH自由基清除率的影響

由圖1可知，歐李仁蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解后的酶解液，由于水解時(shí)間的延長，對(duì)DPPH自由基的清除率也隨著逐漸上升。水解30 min后清除率為43.2%，當(dāng)水解90 min后清除率可達(dá)79.1%；酶解液經(jīng)胰蛋白酶水解后，由于水解時(shí)間的增加，對(duì)DPPH自由基的清除率也逐漸增加，水解90 min后清除率可達(dá)到81.4%；用中性蛋白酶水解的酶解液，于30，60，90 min后對(duì)DPPH自由基的清除率分別為64.7%，75.1%，78.7%；經(jīng)堿性蛋白酶和胰蛋白酶分步復(fù)合水解后的歐李仁蛋白酶解液對(duì)DPPH自由基的清除率為80.5%；堿性蛋白酶與中性蛋白酶按上述方法復(fù)合水解酶解液的清除率達(dá)到81.2%；中性蛋白酶與胰蛋白酶復(fù)合水解后其清除率達(dá)到80.6%；但是由上述3種酶復(fù)合水解后的酶解液對(duì)DPPH自由基的清除率最高達(dá)到93.4%。因此，以DPPH自由基的清除率為指標(biāo)，確定歐李仁抗氧化肽最佳酶解工藝為先將堿性蛋白酶在最適合條件下水解30 min，然后再加入胰蛋白酶水解30 min，最后再加入中性蛋白酶繼續(xù)水解30 min，然后滅酶收集酶解液，再經(jīng)冷凍干燥處理得到歐李仁抗氧化肽。

3.2 歐李仁多肽對(duì)DPPH自由基清除率的影響

歐李仁活性肽對(duì)DPPH自由基的清除作用見圖2。

由圖2可知，歐李仁活性肽質(zhì)量濃度1～4 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除作用隨著質(zhì)量濃度的增加幾乎呈直線上升；當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率已達(dá)到83.3%；隨著質(zhì)量濃度繼續(xù)升高，歐李仁多肽對(duì)DPPH自由基的清除率接近100%；而當(dāng)質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率可達(dá)95.5%。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行多項(xiàng)式回歸，回歸方程為Y=-0.014 2X2+0.193 2X+0.311 1，R2=0.972 2，通過利用回歸方程計(jì)算，最后得出歐李仁活性肽清除DPPH自由基的IC50值為1.06 mg/mL。

圖2 歐李仁活性肽對(duì)DPPH自由基的清除作用

4 結(jié)論

試驗(yàn)是由堿性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶3種酶通過分步、復(fù)合水解歐李仁蛋白，從而使制備的歐李仁多肽具有比較好的清除DPPH自由基能力，IC50值為1.06 mg/mL。

5 討論

通過蛋白水解獲得的活性物質(zhì)擁有多種生物功能，尤其以抗氧化能力最為明顯?？寡趸念?，因?yàn)槠浞肿恿啃　⒕哂懈呋钚怨δ?、容易被人體吸收等優(yōu)點(diǎn)而被大范圍研究。生物活性肽的抗氧化作用主要是指清除自由基的能力、抑制脂質(zhì)過氧化及螯合金屬離子的能力，在試驗(yàn)中經(jīng)常利用清除DPPH自由基的能力以確定物質(zhì)抗氧化活性的強(qiáng)弱。試驗(yàn)研究表明，特異性氨基酸序列和活性肽結(jié)構(gòu)是決定活性肽抗氧化作用強(qiáng)弱的主要因素。試驗(yàn)對(duì)歐李仁活性肽的制備方法及其對(duì)清除DPPH自由基的作用做了初步研究，其歐李仁多肽的空間結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步深入研究。

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Preparation and the Effect on the DPPH Free Radical of the Cerasus Humilis Kernel Peptide

ZHANG Ying1，GUO Baoyu2，ZHANG Ling3，*HOU Hongping4
（1.Taigu County Quality and Technical Supervision and Inspection Institute，Taigu，Shanxi 030800，China；2.Middle School in Taigu，Taigu，Shanxi 030800，China；3.Processing Institute，Shanxi Agricultural Science Academy，Taiyuan，Shanxi 030031，China；4.Shanxi Agricutural University，Taigu，Shanxi 030800，China）

CHKPs are prepared by hydrolysis with alkaline protease，trypsin and neutral protease followed by comparing the effects of different enzyme solution on the DPPH free radical scavenging ability to determine the best process for preparation of the CHKPs.The CHKPs can scavenge 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH） （IC501.06 mg/mL）.

hydrolysis；Cerasus humilis kernel peptide；DPPH free radical

R151

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.02.002

1671-9646（2017）02a-0006-03

2016-12-02

張 英（1985— ），女，碩士，工程師，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

*通訊作者：侯紅萍（1965— ），女，博士，教授，研究方向?yàn)槭称放c發(fā)酵工程。