乳酸鏈球菌素—普魯蘭多糖—海藻酸鈉可食用抗菌共混膜的制備及其在生鮮肉保鮮中的應(yīng)用

摘 要：研究乳酸鏈球菌素（nisin）-普魯蘭多糖（pullulan，PUL）-海藻酸鈉（sodium alginate，SA）可食用抗菌共混膜的工藝條件，通過調(diào)整物料比，制備一種具有良好性能和抗菌能力的可食用膜，并測定膜的透光度、水蒸氣透過率、傅里葉轉(zhuǎn)換紅外線光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）和肉的菌落總數(shù)、pH值、色差等指標，研究物料比對共混膜性能的影響和共混膜對生鮮肉的抑菌性能。結(jié)果表明：PUL和SA之間存在氫鍵相互作用促進了兩相的相容，最佳的可食用共混膜投料比為PUL∶SA=1∶2（V/V）、乳酸鏈球菌素2 g/L。此物料比的共混膜透光度為89.03%，溶解度為31.31%，對色差沒有顯著影響，對生鮮肉的貯藏保鮮效果較好，可以有效延長生鮮肉貨架期至16 d。

關(guān)鍵詞：可食用膜；普魯蘭多糖；抗菌性；多元共混

Abstract： In this paper， we developed a composite edible film consisting of nisin， pullulan （PUL） and sodium alginate （SA） with good performance and antimicrobial activity by adjusting the proportions of these ingredients. The light transmittance， water vapor permeability， Fourier transform infrared （FTIR） spectra and scanning electron microscopic （SEM） images of films and the total plate count， pH and color difference of pork meat were measured as a function of the proportions of the ingredients and the antimicrobial activity of composite edible films was assessed in fresh pork. The results showed that hydrogen bond interactions between PUL and SA favored their mutual dissolution. A PUL-to- SA ratio of 1：2 （V/V） and a nisin concentration of 2 g/L were found to be optimal， giving a light transmittance of 89.03% and a water solubility of 31.31%. This optimized formulation provided good preservation of pork quality without effect on color difference during chilled storage， extending the shelf life to 16 days.

Key words： edible film； pullulan； antibacterial； multiple blending

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704004

中圖分類號：TS206.4 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）04-0017-06

引文格式：

賈曉云， 張順亮， 劉文營， 等. 乳酸鏈球菌素-普魯蘭多糖-海藻酸鈉可食用抗菌共混膜的制備及其在生鮮肉保鮮中的應(yīng)用[J]. 肉類研究， 2017， 31（4）： 17-22. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704004. http：//www.rlyj.pub

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可食用膜以天然高分子材料為基料，以分子間或分子內(nèi)作用力成膜，通過浸漬、噴涂和涂漬等方式把具有可食性的材料覆蓋于食品表面，從而實現(xiàn)在食品貯存、流通、銷售等環(huán)節(jié)保持食品良好的物理狀態(tài)和食用口感的目的[1-5]。

可食用膜不僅可以保護食品，還可以通過調(diào)整物料種類和添加抗氧化劑、抗菌劑等方式改善材料的功能性從而提高食品的貨架期等品質(zhì)，減少食品在貯藏和流通環(huán)節(jié)的損耗[6-8]?？墒秤媚ぷ顬橹匾闹笜藶槟げ牧蠈ν猸h(huán)境中氧氣、水分的阻隔性能?？墒秤媚ぜ葻o環(huán)境污染，又具有對外環(huán)境的物理阻隔作用，有效減少食品水分流失和降低化學(xué)反應(yīng)速率、避免微生物與食物接觸。所以，可食用膜對生鮮肉貨架期的延長有較大的意義[9-10]。近年來越來越多的研究集中在含有添加特殊組分（例如抗菌劑、抗氧化劑等）的功能性可食用膜的制備[11-13]。Song Yongling等[14]以海藻酸鈉為成膜劑，將抗氧化劑茶多酚添加在可食用膜中，發(fā)現(xiàn)該配方可以延緩魚肉的變質(zhì)，改善感官品質(zhì)從而延長魴魚的貨架期。Ojagh等[15]將肉桂精油和殼聚糖復(fù)合膜用于改善鮭魚的食品品質(zhì)及感官性能，研究發(fā)現(xiàn)這種復(fù)合膜可以抑制魚肉的脂肪氧化，并改善色澤。以天然高分子聚合物作為可食用的包裝材料，由于單一的聚合物性能具有局限性，可以采用共混的方式將不同聚合物的優(yōu)點集合，使可食用的包裝材料達到更為優(yōu)良的性能。

普魯蘭多糖是由α-（1，6）糖苷鍵連接而成的線性高分子多糖[16-17]，其水溶液有較好的成膜性，且薄膜熱穩(wěn)定性能好，熱封性能良好，安全環(huán)保[15]。純普魯蘭多糖力學(xué)性能不佳，脆性大且硬，且價格偏高。將純普魯蘭多糖與其他的高分子材料進行多元共混，不僅可以改善性能，增加其柔韌性，還可以降低成本，更適于食品包裝的生產(chǎn)使用。海藻酸鈉來源于褐藻類植物，無毒性、親水性強、價格低廉[19]。由于凝膠性和成膜性質(zhì)良好，較多的研究集中在將海藻酸鈉與抗菌因子復(fù)合制備抗菌材料，例如Seo等[20]研究海藻酸鈉和納米銀溶液混合制備得到復(fù)合海綿，其抑菌性較高并且具有抗炎特性，對金黃色葡萄球菌及克雷白氏肺炎桿菌的抑制作用明顯。乳酸鏈球菌素能對嗜熱脂肪芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等各種革蘭氏陽性菌的營養(yǎng)細胞和芽孢進行有效抑制并且對腸道內(nèi)菌群沒有影響，是天然的食品防腐劑[21]。此外，還可使食品的滅菌溫度降低、滅菌時間縮短[22]。

本研究以添加抗菌劑和天然高分子聚合物共混制備可食用膜，從而達到保持食品原有營養(yǎng)成分、風(fēng)味以及色澤，延長對生鮮肉制品、香腸以及醬鹵肉制品的貨架期的目的，同時價格低廉并且具有良好的抗菌效果。多元共混制備可食用膜可以降低成本，更適于生產(chǎn)使用對食品包裝行業(yè)有較大的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普魯蘭多糖（pullulan，PLU） 東京化成工業(yè)株式會社；海藻酸鈉（sodium alginate，SA）、甘油 北京試劑廠；乳酸鏈球菌 北京迪朗生化科技有限公司；平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104電子天平、pH測定儀 瑞士Mettler-Toledo公司；LCH-18恒溫水槽 日本三洋株式會社；烘箱

日本Toyo Seisakusho公司；尤尼柯2800可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 邦西儀器科技（上海）有限公司；DZ-600/2S真空包裝機 山東小康機械有限公司；GI54DWS高壓蒸汽滅菌 致微（廈門）儀器有限公司；F1-45培養(yǎng)箱 日本東洋公司；Nicolet iS10 FTIR傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；SU8010高分辨場發(fā)射掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 普魯蘭多糖-海藻酸鈉共混膜的制備

海藻酸鈉溶液（1.5 g/100 mL）的制備：將7.5 g海藻酸鈉溶于含有500 mL去離子水的燒杯中，磁力攪拌6 h，至其完全溶解，制成1.5 g/100 mL海藻酸鈉溶液，超聲30 min脫氣泡備用。

普魯蘭多糖溶液（2 g/100 mL）的制備：將10 g普魯蘭多糖溶于含有500 mL去離子水的燒杯中，40 ℃條件下攪拌1 h，至其完全溶解，制成2 g/100 mL普魯蘭多糖溶液，靜置備用。

普魯蘭多糖-海藻酸鈉共混膜的制備：將上述普魯蘭多糖和海藻酸鈉溶液按照體積比1∶1、2∶3、1∶2和1∶3的配比混合，并加入2%的甘油，磁力攪拌2 h，然后超聲30 min后靜置，形成均勻混合液記為P1、P2、P3和P4，上述方法制備的薄膜放置在溫度為（25±2）℃的環(huán)境下4～5 d。

1.3.2 乳酸鏈球菌素-普魯蘭多糖-海藻酸鈉共混膜涂膜工藝

將質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4 g/L的乳酸鏈球菌素加入上述混合液P2中，磁力攪拌2 h，超聲30 min后靜置，制備得乳酸鏈球菌素-普魯蘭多糖-海藻酸鈉共混膜液，記為NP2-1、NP2-2、NP2-3、NP2-4。

將刀具和菜板用75%的酒精消毒并紫外照射20 min，取豬梅肉（冷卻溫度0～4 ℃）切成40 g左右的肉塊。將生鮮肉樣品分別在含不同質(zhì)量濃度乳酸鏈球菌素的成膜液中浸漬60 s，取出置于用75%酒精消毒過的不銹鋼網(wǎng)架上，自然條件下成膜后裝于聚乙烯自封袋中密封，于4 ℃冰箱中貯藏，分別在貯藏0、2、4、6、8、10、12、14、16 d各取適量鮮肉測定菌落總數(shù)、pH值以及色澤的變化?？瞻捉M為未加成膜液的肉樣。

1.3.3 乳酸鏈球菌素-普魯蘭多糖-海藻酸鈉共混膜的性能表征

1.3.3.1 紅外光譜的測定

利用傅里葉變換紅外光譜儀采集光譜圖。測定可食用共混膜在波數(shù)4 000～600 cm-1范圍的吸收光譜，分辨率為4 cm-1，波數(shù)精度為0.01 cm-1，掃描次數(shù)32 次，環(huán)境溫度25 ℃。以O(shè)MNIC 8.0軟件分析采集的譜圖。

1.3.3.2 透光率的測定

用手術(shù)剪刀將共混膜剪裁成1 cm×4 cm的長方形，貼于比色皿透光面，于UV-2800紫外分光光度計中在波長為800 nm處測定透光率T。以空白為對照（T=100%），平行測量3 次，取平均值。

1.3.3.3 溶解度的測定

用手術(shù)剪將共混膜修剪為20 mm×20 mm的正方形，于100 ℃的烘箱中烘至恒質(zhì)量，記為m1，然后將其置于裝有50 mL去離子水的三角瓶中，室溫下浸漬24 h，之后取出拎干，再于100 ℃的烘箱中烘至恒質(zhì)量，記為m2。

式中：m1為初始質(zhì)量/g；m2為溶解后質(zhì)量/g。

1.3.3.4 微觀形貌的測定

將共混膜在50 ℃條件下恒溫干燥6 h，避免電鏡觀察時出現(xiàn)放電現(xiàn)象，取3 mm×3 mm的尺寸粘于樣品臺，真空鍍金30 min。于掃描電子顯微鏡下在電子束電壓5 kV、放大倍數(shù)500 倍的條件下觀察表面結(jié)構(gòu)。

1.3.3.5 菌落總數(shù)的測定

參照GB 4789.2—2010《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[23]中的方法測定。

1.3.3.6 pH值的測定

參照GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品 pH測定》[24]中的方法測定。將肉樣在無菌條件下用滅菌后的刀剁碎后取10.0 g加生理鹽水90 mL混勻，浸泡20 min并不時攪拌，然后用pH測定儀測定其pH值。每個樣品重復(fù)測3 次，結(jié)果以平均值表示。

1.3.3.7 色差的測定

開機自檢，用白板進行校正。將肉樣切片，測量其亮度值（L*）和紅度值（a*），每測1 次順時針旋轉(zhuǎn)60°，總共測3 次。可測定肉樣本身的顏色和光澤及各檢樣間的色度差值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有測試均進行3 次重復(fù)，取平均值。采用Excel進行數(shù)據(jù)分析；Origin 8.0進行數(shù)據(jù)整理和制圖；SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。同一系列不同字母表示顯著差異（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 普魯蘭多糖與海藻酸鈉共混膜的制備優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 不同配比普魯蘭多糖與海藻酸鈉共混膜的紅外光譜分析

紅外光譜從分子特征吸收峰鑒定化合物的官能團和結(jié)構(gòu)，可以反映原料組分分子間的相互作用，在干燥成膜的過程中普魯蘭多糖和海藻酸鈉分子間發(fā)生相互作用，特別是氫鍵會對可食性共混膜的性能產(chǎn)生影響[25]。共混膜沒有出現(xiàn)新的吸收峰，說明PUL和SA的共混過程中沒有新的化學(xué)鍵產(chǎn)生。

2.1.2 不同比例普魯蘭多糖與海藻酸鈉共混膜的透光率

共混膜的透光率是判斷高分子聚合物之間相容性的輔助手段，若共混膜中兩相多糖相容性很差，則在相界面上由于光的散射或反射而使膜的透光率降低[27]。由圖2可知，本實驗制備的共混膜在肉眼條件下均為透明度較好的薄膜。不同配比的共混膜透光性由大到小依次為：PUL∶SA=1∶1>PUL∶SA=2∶3>PUL∶SA=1∶2>PUL∶SA=1∶3，并且透光率都大于80%。隨著海藻酸鈉組分比例的提高，膜的透光率下降。透光率最優(yōu)的膜（PUL∶SA=1∶1）在可見光區(qū)800 nm波長處的透光率達到95.57%，PUL∶SA=2∶3的透光率為89.03%，PUL∶SA=1∶2的透光率為85.43%，透光性最差的PUL∶SA=1∶3的膜透光率也達到80.43%?？梢钥闯?，不同配比的膜都具有較高的透光率，表明了共混膜中不同組分之間的相容性良好，沒有發(fā)生相分離和相轉(zhuǎn)變的情況，并且透光性好也印證了共混膜的在掃描電子顯微鏡觀察下表面粗糙度小的結(jié)論。

2.1.3 不同比例普魯蘭多糖與海藻酸鈉共混膜的溶解度

由圖3可知，共混膜PUL∶SA=1∶1的溶解度為36.66%，PUL∶SA=2∶3的溶解度為31.31%，PUL∶SA=1∶2的溶解度為44.58%，PUL∶SA=1∶3的溶解度為38.73%。因為成膜基質(zhì)都是親水性物質(zhì)，24 h測得的水溶性都較大。其中，PUL∶SA=2∶3與其他配比相比溶解度較小，這是因為成膜的過程伴隨著溫度的升高和水分蒸發(fā)，2 種物質(zhì)的高分子鏈段產(chǎn)生三維互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并且由于存在分子間氫鍵的作用導(dǎo)致成膜結(jié)構(gòu)更為致密，因此溶解度相對其他的體積比例更小。

2.1.4 不同比例普魯蘭多糖與海藻酸鈉膜的掃描電子顯微鏡表征

圖4是不同比例可食用膜的掃描電鏡圖。膜有較好的微觀結(jié)構(gòu)形貌則共混膜的相容性較好，所有的樣品表面都沒有出現(xiàn)相分離和多相結(jié)構(gòu)，這說明采用流延成膜的方法制備的膜具有較好的相容性，共混膜無明顯相分離的現(xiàn)象發(fā)生。其中，PUL∶SA=2∶3時，粗糙度最小，說明該比例下膜的相容性和均一性最好，而PUL∶SA=1∶1和PUL∶SA=1∶2的粗糙度都比PUL∶SA=2∶3大，并且PUL∶SA=1∶3時，共混復(fù)合膜已出現(xiàn)橫紋，粗糙度最大。SEM的數(shù)據(jù)與紅外光譜的結(jié)果一致，表明體系相容性最好的為PUL∶SA=2∶3。

2.2 共混膜在生鮮肉中的保鮮效果

2.2.1 菌落總數(shù)的測定

NP2-1、NP2-2、NP2-3和NP2-4分別為4.80、4.32、4.28、4.25 （lg（CFU/g）），為二級鮮肉。實驗組生鮮肉菌落總數(shù)與對照組相比有明顯的下降。說明采用可食用復(fù)合共混膜可以有效地延長生鮮肉貨架期。NP2-1可以延長貨架期到14 d，NP2-2、NP2-3與NP2-4可延長至16 d，之后變質(zhì)為腐敗肉。所以綜合考慮各項檢測指標，復(fù)合共混膜的最佳配比為NP2-2，此比例下涂布共混膜的生鮮肉貨架期可以達到16 d。

2.2.2 pH值的測定

pH值等理化指標是判斷肉和肉制品微生物腐敗的重要指標，一級鮮度的pH值范圍是5.7～6.2，二級鮮度pH值的范圍為6.2～6.7，pH值>6.7為腐敗肉品。pH值下降的速率和程度對貯藏過程中肉的顏色、系水力以及細菌的繁殖等均有影響[29]。圖6為貯藏期間肉樣pH值的變化。

由圖6可知，隨著貯存時間的延長，肉樣的pH值呈上升趨勢。原因為肉品中蛋白質(zhì)被分解為呈堿性的氨及胺類化合物等有機堿，從而利于細菌的繁殖，使得pH值趨于堿性。而貯存時間越久，氨及胺類化合物積累的越多，pH值越大。對照組在貯藏第6天的pH值達到6.74，已經(jīng)為腐敗肉；NP2-1組在貯藏第14天pH值為6.76，

NP2-2、NP2-3和NP2-4組在貯藏第16天的pH值超過6.7成為腐敗肉。此數(shù)值與生鮮肉菌落總數(shù)的結(jié)果相符，說明共混復(fù)合膜具有抑菌作用，可以使蛋白質(zhì)分解速率減緩，且NP2-2為最佳比例的抑菌復(fù)合膜。

2.2.3 色度的測定

由表1可知，對照組和處理組相比，隨著貯藏時間的延長，肉樣之間L*沒明顯變化，表明處理后對肉品透明度影響不大。對照組和處理組相比，a*略降低，肉品顏色變差，這說明肌肉色素蛋白發(fā)生了變性，肌紅蛋白氧化生成其他的衍生物，導(dǎo)致a*降低[30]，而處理組之間a*差別不大。

3 結(jié) 論

通過研究表明，經(jīng)過調(diào)整共混膜的工藝條件，改變普魯蘭多糖和海藻酸鈉的配比，發(fā)現(xiàn)二者共混后，因為存在氫鍵作用使得兩相之間相容性好，不同配比共混膜中不同組分之間的相容性良好，沒有發(fā)生相分離和相轉(zhuǎn)變的情況。并通過測定膜透光度、溶解度、SEM微觀形貌的表征得到具有抑菌性能的多元共混可食用膜最佳配比為PUL∶SA=1∶2。通過肉的菌落總數(shù)、pH值、色差等指標檢測表明，當(dāng)添加乳酸鏈球菌素質(zhì)量濃度為2 g/L時，該可食用抗菌共混膜的抑菌性能最好，此方法制備的抑菌性可食用膜，可以有效延長食品的貨架期到16 d。

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