眼鏡蛇神經(jīng)毒素研究進(jìn)展

蔣世強(qiáng)　潘能慶　鄢航

摘要 眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素（Cobrotoxin，CT）是一種短鏈神經(jīng)毒素，最早是從臺灣眼鏡蛇蛇毒中分離得到的。因其在鎮(zhèn)痛和抗癌方面有著顯著的效果而成為研究的熱點(diǎn)，本文通過對近年來CT的結(jié)構(gòu)、藥理作用、鎮(zhèn)痛、抗癌研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為各位研究者提供基礎(chǔ)參考資料。

關(guān)鍵詞 眼鏡蛇；神經(jīng)毒素；藥理作用；體外表達(dá)

中圖分類號 R282 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）04-0255-02

Abstract The cobra venom neurotoxin（Cobrotoxin，CT） is a kind of short chain neurotoxin that is isolated from the Taiwan cobra venom at the earliest.Because of its significant analgesic and anti-cancer effect，CT is becoming a hot research.This article summarized the research progress of structure，pharmacological effect，analgesic and anticancer of CT in recent years，aimed to provide basic references for researchers.

Key words cobrotoxin；pharmacological effect；in vitro expression

眼鏡蛇神經(jīng)毒素（Cobrotoxin，CT）不但在鎮(zhèn)痛作用上具有持久、無耐受性、無成隱性和不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，同時具有抗癌作用。因此，其可開發(fā)成新型的鎮(zhèn)痛藥和抗癌藥，應(yīng)用前景廣闊[1]。

1 眼鏡蛇神經(jīng)毒素的結(jié)構(gòu)

1965年，Yang等通過CM-cellulose柱和Sephadex G-25柱從臺灣眼鏡蛇蛇毒中分離得到一種棒狀晶體蛋白，將其命名為神經(jīng)毒素，其毒性為粗毒的6.7倍，并具有熱穩(wěn)定性，但是通過胰蛋白酶消化后活性喪失[2]。CT的分子量約為7 KDa，由15種常見氨基酸組成，缺乏丙氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸，其空間結(jié)構(gòu)為三指形，分子結(jié)構(gòu)中一端為4個二硫鍵形成的致密內(nèi)核，由內(nèi)核向外伸出3對互為平行的肽鏈成三指形展開，分子中4個二硫鍵分別為Cys3-Cys24、Cys17-Cys41、Cys43-Cys54、Cys55-Cys60[3-6]。Yu等[7]研究發(fā)現(xiàn)CT的二硫鍵可以發(fā)生改變從而變成其同分異構(gòu)體Cobrotoxin Ⅱ和Cobrotoxin Ⅲ，Cobrotoxin Ⅱ和Cobrotoxin Ⅲ二硫鍵分別變?yōu)镃ys43-Cys55、Cys54-Cys60和Cys43-Cys60、Cys54-Cys55（圖1）[8]。

2 眼鏡蛇神經(jīng)毒素的藥理作用

眼鏡蛇神經(jīng)毒素屬于短鏈突觸后神經(jīng)毒素，能以極強(qiáng)的親和力與突觸后膜上的煙酰胺型乙酰膽堿受體結(jié)合，阻止神經(jīng)-肌肉通路的去極化，阻礙神經(jīng)沖動傳導(dǎo)[9]。若過量的CT將神經(jīng)傳導(dǎo)完全阻礙時，生物個體將會死亡，Meng等[10]從孟加拉眼鏡蛇毒液中純化得到的CT對小鼠的LD50僅為0.08 mg/g。關(guān)于CT的作用機(jī)制及其作用的位點(diǎn)一直是研究的熱點(diǎn)，許多研究工作者已經(jīng)做了不少探究工作。Chang等[11]對CT分子中的酪氨酸殘基與其生物活性的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Tyr-25殘基的完整性在保持CT的活性構(gòu)象中起著至關(guān)重要的作用。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CT分子中精氨酸殘基的修飾與CT的致死性和抗原性相關(guān)，Arg-30和Arg-33與CT的致死性有關(guān)，而Arg-30和Arg-36則與CT的抗原性有著密切關(guān)系。此外，還有類似的研究發(fā)現(xiàn)，完整的Trp-29、His-32、Lys-47、Glu-21都對CT活性構(gòu)象的保持起著重要作用[13]。目前，盡管找到了不少可以改變CT活性構(gòu)象的因素，但是還是沒有確定CT的作用位點(diǎn)，因而其與乙酰膽堿如何結(jié)合的機(jī)制尚不清楚。Aoyagi等[14]通過人工合成與CT相似的肽鏈并進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，能夠得到一些與CT相類似的反應(yīng)，并且合成肽具有CT 20%的毒性活性。

3 眼鏡蛇神經(jīng)毒素的研究與應(yīng)用

3.1 鎮(zhèn)痛研究及應(yīng)用

眼鏡蛇神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛研究歷史悠久，自從1965年CT從臺灣眼鏡蛇中分離純化之后，CT的鎮(zhèn)痛研究就開始了，因其在鎮(zhèn)痛方面具有高效性、無耐受性、無成隱性、不良反應(yīng)少而被廣泛研究。Chen等[15]的研究揭示了CT作用的機(jī)制。CT主要是通過作用于乙酰膽堿受體，從而阻礙神經(jīng)傳導(dǎo)達(dá)到鎮(zhèn)痛的作用，對于CT鎮(zhèn)痛過程中發(fā)揮作用的位點(diǎn)至今還不確定，這也是今后的研究重點(diǎn)與難點(diǎn)，更是CT能否得到應(yīng)用的關(guān)鍵點(diǎn)。

蛇毒鎮(zhèn)痛的應(yīng)用早在我國20世紀(jì)70年代就出現(xiàn)了，曾才銘[16]用云南動物研究所用眼鏡蛇毒提純的神經(jīng)毒素制成的針劑克痛靈用于臨床治療慢性腰腿痛，共治療了100余例，取得一定的效果。同樣的，蒲道學(xué)[17]將克痛靈用于治療神經(jīng)性頭痛、三叉神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛共96例病人并且都取得了一定療效。這個名為“克痛靈”的蛇毒制劑的主要成分便為蛇毒神經(jīng)毒素，CT便是其鎮(zhèn)痛的主要成分之一。盡管我國蛇毒制劑的應(yīng)用當(dāng)時得到一定程度的推廣，但是這個名為“克痛靈”的蛇毒制劑并沒有得到更好的發(fā)展和升級，最后被市場淘汰，導(dǎo)致其淘汰的主要原因有4個：其一，當(dāng)時蛋白分離技術(shù)的限制，導(dǎo)致得到的蛇毒制劑中含有其他成分，從而導(dǎo)致蛇毒制劑的效果不一致，有時還會有較大的副作用；其二，對蛇毒制劑的檢測及監(jiān)管不到位，導(dǎo)致蛇毒假制劑四處橫行，最終導(dǎo)致這個行業(yè)的沒落；其三，蛇毒分離成本過高，分離過程中回收率低，損失較多，因而無法產(chǎn)生更廉價的商品；其四，蛇毒的作用機(jī)制研究進(jìn)展緩慢限制了蛇毒的應(yīng)用。

3.2 抗癌研究

目前，CT在抗癌方面的研究報道還不像其鎮(zhèn)痛報道那樣多，不過在抗癌方面的研究并沒有停止過，最近Shen等[18-19]報道了CT的抗癌作用，其研究結(jié)果顯示，CT能夠明顯抑制A549細(xì)胞的體外生長，并且在CT作用過程中，通過激活P38-MARK信號通路上調(diào)細(xì)胞自噬的作用。此外，CT還能抑制A549細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移。盡管CT的抗癌研究還不夠深入，但是從目前的研究報道來看，CT在抗癌的開發(fā)方面具有一定的潛力。人們期待在CT的抗癌效果、范圍、機(jī)制方面進(jìn)行更深入的研究，以便為CT的抗癌應(yīng)用打下堅實(shí)的基礎(chǔ)。

4 眼鏡蛇神經(jīng)毒素體外表達(dá)的研究

眼鏡蛇神經(jīng)毒素的克隆和表達(dá)始于20世紀(jì)90年代，主要得益于分子生物學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的基因被克隆，以及克隆的效率越來越高。對于CT的克隆與表達(dá)的研究目的主要有2個，一是為了方便對CT本身的研究，例如對其序列進(jìn)行分析，或是對CT序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，再進(jìn)行表達(dá)，從而確定某個點(diǎn)對CT的活性、結(jié)構(gòu)的影響，Chang等[20]對特定的氨基酸進(jìn)行改變，研究了單個氨基酸替換對整個分子結(jié)構(gòu)的影響；二是為了獲得CT蛋白，以便應(yīng)用于實(shí)踐中。由于蛇毒資源有限、蛇毒分離成本高、蛇毒成分復(fù)雜藥理作用不同，因而通過基因工程技術(shù)產(chǎn)生成分單一的蛇毒是破解這幾個難題的重要途徑，鄢航等[21-22]利用原核表達(dá)系統(tǒng)和真核系統(tǒng)對CT進(jìn)行了表達(dá)，獲得了該蛋白，并檢測了其活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原核表達(dá)的CT活性不理想，而真核表達(dá)的CT具有較好的鎮(zhèn)痛活性，然而其采用的是昆蟲細(xì)胞表達(dá)，盡管表達(dá)蛋白的活性及產(chǎn)量都還不錯，但是該方法的成本較高，并不適合規(guī)?；a(chǎn)[23-27]。

5 展望

眼鏡蛇神經(jīng)毒素作為突觸后神經(jīng)毒素，有著非常好的鎮(zhèn)痛效果及無成隱的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被研究了幾十年，也取得了不錯的成果，但是就目前情況來看，其鎮(zhèn)痛的機(jī)制及體外表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。人們期待早日在這2個方面取得突破性的成果，為CT的廣泛應(yīng)用鋪平道路。

6 參考文獻(xiàn)

[1] 黃立峰，許云祿.蛇毒神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛作用[J].福州總醫(yī)院學(xué)報，2005（增刊1）：355-357.

[2] 王重洋，顏培鋼.眼鏡蛇神經(jīng)毒素藥理作用實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009（8）：165-167.

[3] YANG C C，CHANG C C，HAYASHI K，et al.Amino acid composition and end group analysis of cobrotoxin[J].Toxicon，1969，7（1）：43-47.

[4] YANG C C，YANG H J，HUANG J S.The amino acid sequence of cobr-otoxin[J].Biochim Biophys Acta，1969，188（1）：65-77.

[5] YANG C C，YANG H J，CHIU R H.The position of disulfide bonds in co-brotoxin[J].Biochim Biophys Acta，1970，214（2）：355-363.

[6] YANG C C.Structure and function of cobrotoxin[proceedings][J].Toxicon，1976，14（6）：421-422.

[7] YU C，BHASKARAN R，CHUANG L C，et al.Solution conformation of cobrotoxin：a nuclear magnetic resonance and hybrid distance geometry-dynamical simulated annealing study[J].BIOCHEMISTRY-US，1993，32（9）：2131-2136.

[8] CHANG L，LIN S，CHANG C，et al.Disulfide isomerization within the C-terminus of cobrotoxin decelerates by thiol compounds and trinitrophen-ylation，but accelerates by modification of carboxyl groups[J].Arch Bioc-hem Biophys，1998，358（1）：164-170.

[9] ENDO T，TAMIYA N.Current view on the structure-function relationship of postsynaptic neurotoxins from snake venoms[J].Pharmacol Therapeut，1987，34（3）：403-406.

[10] MENG Q X，WANG W Y，LU Q M，et al.A novel short neurotoxin，cobr-otoxin c，from monocellate cobra （Naja kaouthia） venom：isolation and purification，primary and secondary structure determination，and tert-iary structure modeling[J].Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol，2002，132（1）：113-121.

[11] CHANG C C，YANG C C，HAMAGUCHI K，et al.Studies on the status of tyrosyl residues in cobrotoxin[J].Biochim Biophys Acta，1971，236（1）：164-173.

[12] YANG C C，CHANG C C，LIOU I F.Studies on the status of arginine residues in cobrotoxin[J].Biochim Biophys Acta，1974，365（1）：1-14.

[13] 常梅艷，韓麗萍，蔣琳蘭.眼鏡蛇（Naja naja atra）神經(jīng)毒素與心臟毒素分離純化研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù)，2009（6）：595-599.

[14] AOYAGI H，YONEZAWA H，TAKAHASHI N，et al.Synthesis of a pep-tide with cobrotoxin activity[J].Biochim Biophys Acta，1972，263（3）：823-826.

[15] CHEN R Z，ROBINSON S E.The effect of cholinergic manipulations on the analgesic response to cobrotoxin in mice[J].Life Sci，1990，47（21）：1949-1954.

[16] 曾才銘.新藥“克痛寧”治療慢性腰腿痛80例療效觀察[J].云南醫(yī)藥，1980（1）：26-28.

[17] 蒲道學(xué).克痛靈治療血管神經(jīng)性頭痛、坐骨神經(jīng)痛、三叉神經(jīng)痛共96例臨床療效觀察[J].云南醫(yī)藥，1980（2）：37-39.

[18] SHEN J，HE J，TANG X，et al.Role of autophagy on cobrotoxin induced cell death of A549[J].Chinese Journal of Lung Cancer，2013，16（7）：339-344.

[19] SHEN J，XIE Y，SUN M L，et al.Antitumor activity of cobrotoxin in human lung adenocarcinoma A549 cells and following transplantation in nude mice[J].Oncol Lett，2014，8（5）：1961-1965.

[20] CHANG L S，CHEN K C，WU B N，et al.Expression and mutagenesis st-udies of cobrotoxin from Taiwan cobra[J].Biochem Biophys Res Comm-un，1999，263（3）：652-656.

[21] 鄢航，楊秀榮，鄧?yán)^賢，等.廣西眼鏡蛇神經(jīng)毒素的原核表達(dá)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（10）：145-147.

[22] 鄢航.廣西眼鏡蛇CT和PLA_2基因的真核表達(dá)和鎮(zhèn)痛活性檢測[D].南寧：廣西大學(xué)，2013.

[23] 葉勇，邢海婷，郭亞.白藜蘆醇二聚體與眼鏡蛇神經(jīng)毒素的作用機(jī)制[J].華南理工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014（2）：21-26.

[24] 郝永龍，陳美榮，黃銘.中華眼鏡蛇神經(jīng)毒素微球的制備及鎮(zhèn)痛作用研究[J].中國藥理學(xué)通報，2014（5）：676-679.

[25] 郝永龍，陳美榮，劉啟萍，等.眼鏡蛇神經(jīng)毒素配伍咖啡因鎮(zhèn)痛作用研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010（7）：565-567.

[26] 班建東，湯圣希.眼鏡蛇神經(jīng)毒素中樞性鎮(zhèn)痛作用的研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000（2）：192-194.

[27] 高紅瑾，許云祿，王少明，等.中華眼鏡蛇神經(jīng)毒素的活性研究[J].藥學(xué)研究，2014（6）：315-318.