Pellet 培養(yǎng)與纖維蛋白凝膠支架體外成軟骨能力的比較

黃亮節(jié) 翁土軍 張春麗 劉彥 錢隆 侯樹勛

Pellet 培養(yǎng)與纖維蛋白凝膠支架體外成軟骨能力的比較

黃亮節(jié) 翁土軍 張春麗 劉彥 錢隆 侯樹勛

目的比較 Pellet 培養(yǎng)和纖維蛋白凝膠支架兩種培養(yǎng)方式誘導脂肪干細胞向軟骨細胞分化及合成細胞外基質的差異。方法 人脂肪組織酶消化分離脂肪干細胞，培養(yǎng)基為 DMEM 含 10% 胎牛血清，利用Pellet 培養(yǎng)和纖維蛋白凝膠支架兩種培養(yǎng)體系將 P3 代脂肪干細胞誘導成軟骨后 21 天取材進行蘇木精－伊紅染色，番紅 O 染色，DMMB 法測定胞外基質中 GAG 含量，熒光定量 PCR 測定 II 型膠原基因表達。結果 蘇木精－伊紅染色與番紅－O 染色顯示，纖維蛋白凝膠實驗組軟骨細胞外基質大量分泌，并融合成片，說明纖維蛋白凝膠支架可更好促進干細胞成軟骨分化、維持軟骨細胞表型。GAG / DNA 結果顯示，纖維蛋白凝膠組促GAG 分泌的能力優(yōu)于其余各組 ( P＜0.05 )，其 II 型膠原 mRNA 表達的能力也最強 ( P＜0.05 )。結論 利用纖維蛋白凝膠支架誘導人脂肪干細胞成軟骨分化的能力優(yōu)于無支架的 Pellet 三維培養(yǎng)體系。

纖維蛋白；干細胞；組織工程；軟骨；Pellet 培養(yǎng)；脂肪源干細胞

關節(jié)軟骨自身修復能力差，如何治療軟骨缺損一直是關節(jié)外科醫(yī)生所面臨的難題。傳統(tǒng)軟骨缺損修復的方法有軟骨下骨微骨折術、鑲嵌式成形術及同種異體骨軟骨移植等[1-3]。近年來又出現了自體軟骨細胞移植等新技術[4]。但以上方法常受到供體數量不足、免疫排斥反應的限制，遠期療效并不理想[5]。新興的組織工程技術利用支架材料聯(lián)合干細胞與誘導因子，在體外或體內構建組織和器官，為軟骨再生提供了新的思路。脂肪干細胞來源廣泛、數量豐富、獲取便捷，且具有成軟骨分化潛能，在適宜條件下可向軟骨分化，相比骨髓間充質干細胞具有明顯優(yōu)勢，是軟骨組織工程中種子細胞的理想選擇[6]。

軟骨組織工程中種子細胞誘導分化為軟骨細胞一直是研究的熱點。轉化生長因子 β ( TGF-β ) 家族因其具有良好的促干細胞成軟骨分化能力，常作為軟骨組織工程中的誘導因子[7-8]，且 TGF-β3 相較于傳統(tǒng)的 TGF-β1，促進人間充質干細胞成軟骨分化能力更強[9]。合適的誘導培養(yǎng)體系還包括培養(yǎng)模式、支架材料等，在脂肪干細胞的誘導分化中也起到關鍵作用。Pellet 培養(yǎng)體系作為無支架培養(yǎng)的代表，在長期培養(yǎng)中軟骨細胞仍可保持較好生物學活性，同時特異性細胞外基質分泌增加，操作簡單，產量較高[10]。近年來基于支架的組織工程技術也發(fā)展迅速，可注射式細胞支架因其創(chuàng)傷較小、可塑性強、操作方便等優(yōu)勢，成為軟骨組織工程的研究熱點[11]。纖維蛋白凝膠具有來源廣泛、價格低廉、生物相容性好，在凝血酶作用下可形成三維立體多孔細胞支架，為種子細胞的均勻分布提供足夠的空間，促進種子細胞的黏附、生長、增殖、分化[12]，在軟骨再生領域具有良好的應用前景。

本實驗以人脂肪干細胞作為種子細胞，在培養(yǎng)體系中加入 TGF-β3 細胞因子，比較無支架的 Pellet培養(yǎng)和纖維蛋白凝膠支架兩種培養(yǎng)方式成軟骨效果的差異，探索誘導效果更好的軟骨誘導培養(yǎng)體系，為下一步臨床利用脂肪干細胞修復軟骨損傷奠定基礎。

材料與方法

本實驗于 2016 年 3 月至 2016 年 9 月在解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍骨科研究所完成。

材料：脂肪來自解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院膝關節(jié)置換術患者，所有患者均簽署知情同意書。

一、實驗步驟

1. 實驗相關試劑的配制：凝血酶溶液及纖維蛋白原溶液：凝血酶溶于氯化鈣，獲得濃度 5 U / ml 溶液 ( A 液 )，用來重懸細胞；纖維蛋白原溶于氯化鈉溶液使?jié)舛葹?100 mg / ml，并含抑酞酶 10000 KIU / ml ( B 液 )，A 液和 B 液混合即可形成纖維蛋白凝膠。DMMB 染色液：1.6 mg DMMB 粉末溶于 100 ml 緩存液中，緩沖液含 3.04 g / L 甘氨酸、2.37 g / L 氯化鈉及 0.01 mmol / L 鹽酸 ( 表1 )。

表1 試驗主要試劑及儀器Tab.1 The main reagent and apparatus

2. 人脂肪干細胞原代培養(yǎng)：收集手術患者髕骨下脂肪組織 20 ml，PBS 沖洗 3 次，將脂肪剪碎轉移到 15 ml 離心管內，加入等體積 0.1% I 型膠原酶，37 ℃ 水浴消化 1.5 h，2000 r / min 離心 5 min；棄上清，PBS 重懸，200 目細胞篩過濾懸液至新離心管中，再次 2000 r / min 離心 5 min；棄上清，加入含10% FBS、1% 雙抗的 DMEM / F12 培養(yǎng)基重懸，將細胞打勻后接種于 10 cm 培養(yǎng)皿，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后 48 h 首次換液，換液后 7 天形成細胞克隆并 80% 融合傳代。

3. 三維培養(yǎng)細胞微球的制備：收集 P3 代脂肪干細胞，重懸計數，在每個 15 ml 離心管中加入5×105個細胞，300 g 離心 5 min，傾棄上清，加入2 ml 不完全軟骨誘導培養(yǎng)基。其成分為：高糖DMEM 加入 100 U / ml 青、鏈霉素、10% FBS、10-7mol / L 地塞米松、ITS＋( 含 10 mg / L 胰島素，5 μg / L 硒，5.5 mg / L 轉鐵蛋白，4.7 mg / L 亞油酸，0.5 g / L BSA )、110 mg / L 丙酮酸鈉溶液、50 mg / L左旋抗壞血酸-2、40 mg / L 脯氨酸。24 h 后細胞聚集成球，實驗組換用添加 10 ng / ml TGF-β3 的完全培養(yǎng)基，對照組繼續(xù)不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。每隔 2 天全量換液，實驗組新鮮加入 TGF-β3，第 21 天收獲細胞。

4. 纖維蛋白凝膠復合脂肪干細胞體外培養(yǎng)：收集 P3 代脂肪干細胞，計數，在干凈 1.5 ml EP 管中加入 5×105個細胞，棄上清，取 A 液 30 μl 重懸細胞，加入內徑 4 mm 的塑料模具內，再取 B 液 30 μl加入，搖晃混勻，37 ℃ 反應 40 min 后混合液凝固成凝膠，將凝膠取出放入 6 孔板內，實驗組加入含TGF-β3 的完全培養(yǎng)基 2 ml，對照組加入不完全培養(yǎng)基 2 ml。每隔 2 天全量換液，第 21 天收獲細胞。

5. 相關指標的檢測：

( 1 ) 組織學評價：成軟骨誘導 21 天，取各組的細胞微球及纖維蛋白凝膠，PBS 洗 1 次，4% 多聚甲醛 4 ℃ 固定過夜，20%、30% 蔗糖多聚甲醛溶液依次沉底，OTC 膠包埋，行冰凍切片和相應染色。

蘇木精－伊紅染色：無水乙醇固定切片數秒，輕柔水洗 1 次，蘇木精染色 10 min，水洗，1% 鹽酸乙醇分化，返藍液返藍，伊紅染色 20 min 后用雙蒸水洗去多余燃料。脫水、透明、封固。觀察組織結構及胞外基質的變化。

番紅－O 染色：無水乙醇固定切片數秒，輕柔水洗 1 次，0.1% 番紅 O 染色 3 min，水洗 3 次，0.1%醋酸分化 1 s，雙蒸水洗 1 min。脫水、透明、封固。酸性黏蛋白、蛋白聚糖均會被染成紅色。

( 2 ) 細胞微球及水凝膠 DNA 含量檢測：第21 天，各組細胞微球及凝膠以 125 μg / ml 木瓜蛋白酶消化，65 ℃ 水浴 18 h，所得組織消化液一半用于GAG 含量檢測，另一半用于 DNA 提?。航M織消化液中加入 200 μg / ml 蛋白酶 K 繼續(xù)消化，55 ℃ 水浴過夜，飽和氯化鈉 / tris 酚 / 氯仿 / 乙醇提取 DNA，Nanodrop2000 檢測 DNA 濃度。

( 3 ) 細胞微球及水凝膠糖胺聚糖 ( GAG ) 含量檢測：每組留存的組織消化液 50 μl 加入 96 孔板，加入 200 μl 預先配置好的 DMMB 染色液。另外取0.1 mg / ml 硫酸軟骨素標準儲存液用雙蒸水稀釋成不同濃度 0.02 mg / ml、0.04 mg / ml、0.06 mg / ml、0.08 mg / ml、0.1 mg / ml 制作標準曲線。室溫靜置2 min，525 nm 波長下測量各孔吸光值。根據標準曲線算出 GAG 濃度。

( 4 ) 實時定量 PCR 檢測 II 型膠原的表達：利用Trizol 法提取微球及水凝膠中總 RNA。根據試劑盒說明書進行反轉錄及 q-PCR 反應，反轉錄試劑盒為Biotool 公司 All-in-One cDNA Synthesis SuperMix，貨號 B24403；定量 PCR 試劑盒為康維世紀公司UltraSYBR Mixture ( Low ROX )，貨號 CW2601S。定量 PCR 所用的儀器為 Thermo Fisher 公司 QuanStudio5型 PCR 儀，反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，57 ℃、1 min，40 個循環(huán)，57 ℃ 延伸 1 min。檢測目的基因為 II 型膠原，以 GAPDH 為內參基因，各引物序列見表2。采用 ΔΔCt 法計算各組基因相對表達量。

表2 PCR 引物序列Tab.2 Primer sequence of each gene

二、統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行分析。組間數據比較采用 t 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、細胞微球和纖維蛋白凝膠蘇木精－伊紅染色情況

為描述方便，將無 TGFβ3 的 Pellet 組、添加TGFβ3 誘導的 Pellet 組、無 TGFβ3 的纖維蛋白凝膠組及添加 TGFβ3 誘導的纖維蛋白凝膠組分別以I 組、II 組、III 組、IV 組表示，下同。培養(yǎng) 21 天，III 組、IV 組仍可見凝膠支架。II 組和 IV 組軟骨細胞外基質表達較 I 組和 III 組明顯增多，融合成片。III 組、IV 組與 I 組、II 組比較，其結構更加均一，有軟骨陷窩樣結構形成，IV 組較其余各組組胞外基質表達更多 ( 圖1 )。

二、細胞微球和纖維蛋白凝膠番紅－O 染色情況

成軟骨誘導 21 天，添加 TGFβ3 誘導的 II 組、IV 組番紅 O 染色呈陽性，證實有大量蛋白聚糖表達。未添加誘導因子的 I 組、III 組，蛋白聚糖表達較弱。IV 組較 II 組異染性著色更強 ( 圖2 )。

三、細胞微球和纖維蛋白凝膠 DNA、GAG 含量檢測

培養(yǎng) 21 天，各組間 DNA 總量差異無統(tǒng)計學意義 ( P＞0.05 )，( 圖3a )。添加 TGFβ3 誘導后，II 組、IV 組 GAG 的表達量顯著高于對應的 I 組、III 組，其差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 ) ( 圖3b )。采用 GAG 含量與 DNA 含量的比值衡量 GAG 分泌能力的相對大小，并將未添加誘導的 I 組數值作為 1，其余各組的數值為相對 I 組的倍數大小。添加了誘導因子 TGFβ3 后，II 組、IV 組 GAG 的分泌能力均高于 I 組、III 組，其差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 )，II 組、III 組 GAG 分泌能力差異無統(tǒng)計學意義 ( P＞0.05 )，IV 組 GAG 的分泌能力顯著高于其余各組 ( P＜0.05 ) ( 圖3c )。

四、細胞微球和纖維蛋白凝膠成軟骨特異性分子基因表達檢測

培養(yǎng) 21 天，II 組 II 型膠原相對表達量高于I 組，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 ) ( 圖4a )。IV 組II 型膠原相對表達量亦高于 III 組，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 ) ( 圖4b )。比較各組間 II 型膠原相對表達量的高低，將 I 組數值作為 1，可見凝膠組添加誘導因子 TGFβ3 后 ( IV 組 )，其 II 型膠原相對表達量高于其余各組，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 )，II 組、III 組 II 型膠原相對表達量差異無統(tǒng)計學意義( P＞0.05 ) ( 圖4c )。

圖1 細胞微球和纖維蛋白凝膠蘇木精 -伊紅染色情況 ( × 400 ) a：為未添加TGFβ3 誘導的 Pellet 組；b：為添加了TGFβ3 誘導的 Pellet 組；c：為未添加TGFβ3 誘導的纖維蛋白凝膠組；d：為添加了 TGFβ3 誘導的纖維蛋白凝膠組。標尺 = 25 μm圖2 細胞微球和纖維蛋白凝膠番紅 - O染色情況 ( × 400 ) a：為未添加 TGFβ3誘導的 Pellet 組；b：為添加了 TGFβ3 誘導的 Pellet 組；c：為未添加 TGFβ3 誘導的纖維蛋白凝膠組；d：為添加了 TGFβ3 誘導的纖維蛋白凝膠組。標尺 = 25 μmFig.1 Cell microspheres and fi brin gel HE staining ( × 400 ) a: Pellet without TGFβ3 induction; b: Pellet with TGFβ3 induction; c: Fibrin gel without TGFβ3 induction; d: Fibrin gel with TGFβ3 induction. Bar = 25 μmFig.2 Cell microspheres and fi brin gel red-O staining ( × 400 ) a: Pellet without TGFβ3 induction; b: Pellet with TGFβ3 induction; c: Fibrin gel without TGFβ3 induction; d: Fibrin gel with TGFβ3 induction. Bar = 25 μm

討 論

軟骨組織工程利用三維立體支架材料結合種子細胞體外構建有功能的軟骨，修復缺損，給軟骨損傷的治療帶來了曙光。多項研究已表明，TGF-β 結合特定的培養(yǎng)條件，可在體外誘導胚胎干細胞、骨髓間充質干細胞及脂肪源干細胞成軟骨分化[13]。脂肪干細胞可從全身多處部位提取，來源豐富。與其它來源干細胞相比，還具有增殖快、數量眾多、免疫源性低、不易造成損傷等優(yōu)點。研究表明，利用瓊脂糖凝膠支架，搭載脂肪源干細胞與搭載骨髓間充質干細胞，兩者形成的軟骨組織在力學性能上差異無統(tǒng)計學意義[14]，而單位體積脂肪組織內的干細胞數目是同體積骨髓中骨髓間充質干細胞數目的40 倍[15]。脂肪干細胞作為一種優(yōu)秀的種子細胞，具有良好的應用前景。

有報道表明，軟骨細胞采用二維培養(yǎng)容易發(fā)生去分化，軟骨相關細胞外基質的合成減少[16]。一個可供細胞黏附、增殖與分化的三維結構是體外誘導干細胞成軟骨所必需的。既往研究表明，細胞通過 Pellet 培養(yǎng)無需支架即可形成類軟骨組織[17]。Pellet 培養(yǎng)能較好地模擬體內微環(huán)境，高密度細胞聚集又可增強細胞間相互作用，促進細胞因子的誘導效應。纖維蛋白凝膠由機體自身產生，種屬間差異小，免疫源性低，在臨床上應用廣泛，常作為止血劑和密封劑[18]，在組織工程領域也被廣泛應用。其多孔的網狀微觀結構，是種子細胞的良好載體。有研究也將纖維蛋白作為藥物的緩釋系統(tǒng)[19]，進行藥物投遞。Homminga 等[20]利用纖維蛋白凝膠體外結合兔軟骨細胞，體外培養(yǎng) 7 天，發(fā)現軟骨細胞可保持良好的形態(tài)與增殖能力并分泌軟骨細胞外基質。通常認為，軟骨細胞胞外基質成熟需要 6 周，而纖維蛋白凝膠在體內 2～3 周已降解完全。王九現等[21]研究表明，在纖維蛋白凝膠中加入少量抑酞酶可抑制其降解。朱立新等[22]利用兔軟骨細胞復合加入抑酞酶、氨甲環(huán)酸改良的纖維蛋白凝膠支架，植入兔關節(jié)軟骨損傷處，植入后 12 周取材發(fā)現纖維蛋白凝膠降解速度明顯減緩。改良后的纖維蛋白凝膠，已日益成為軟骨組織工程支架的首選。

圖3 細胞微球和纖維蛋白凝膠 DNA、GAG 含量檢測 a：各組 DNA 含量情況；b：各組 GAG 含量情況；c：各組 GAG / DNA 比值的大小情況Fig.3 Cell microspheres and fi brin gel DNA, GAG content detection a: The DNA content of each group; b: The content of GAG in each group; c: The size of each group GAG / DNA ratio

圖4 細胞微球和纖維蛋白凝膠成軟骨特異性分子基因表達檢測 a：示細胞微球組 II 型膠原相對表達量；b：示纖維蛋白凝膠組 II 型膠原相對表達量；c：示各組間 II 型膠原相對表達量的大小情況Fig.4 Cell microspheres and fi brin gel cartilage-specif i c molecular gene expression detection a: The relative expression of type II collagen in cell microspheres group; b: The relative expression of type II collagen in fi brin gel group; c: The relative amount of type II collagen of each group

本研究結果表明，在改良的纖維蛋白凝膠中，添加 TGF-β3 誘導因子，可成功誘導人脂肪干細胞向軟骨分化，構建軟骨樣組織。蘇木精－伊紅染色顯示，添加誘導的凝膠支架組中細胞已具有軟骨細胞的典型形態(tài)，即圓形或橢圓形的軟骨細胞，番紅－O 染色顯示，添加誘導的凝膠支架組軟骨細胞外基質大量分泌，并融合成片，表明纖維蛋白凝膠支架聯(lián)合誘導因子能夠更好地促進干細胞成軟骨分化、維持軟骨細胞表型。糖胺聚糖 ( glycosaminoglycan，GAG ) 是關節(jié)軟骨基質中的特征性物質，具有黏滯性，常覆蓋在關節(jié)面上，具有潤滑和保護作用。本研究通過 DMMB 染色法測定各組中 GAG的含量。研究結果顯示，添加 TGF-β3 誘導后，纖維蛋白凝膠組和細胞微球組 GAG 表達均升高，而GAG / DNA 結果顯示，纖維蛋白凝膠組促 GAG 分泌的能力相對更強，從而合成的組織工程軟骨在功能上更接近原生軟骨組織。II 型膠原是軟骨基質中最重要的標志物，絲狀的膠原蛋白纖維與彈性蛋白及多糖蛋白相互交織形成網狀結構，產生一定的機械強度，維持關節(jié)軟骨的彈性與韌性。本研究通過實時定量 PCR 觀察 II 型膠原 ( Col2a1 ) 基因的表達，結果顯示，添加 TGFβ3 的纖維蛋白凝膠組誘導 II 型膠原 mRNA 表達的能力最強。纖維蛋白凝膠組 Col2a1 mRNA 及 GAG 的表達均顯著高于 Pellet 組，這可能是由于纖維蛋白凝膠具有三維微觀孔隙結構，表面積 / 體積比較大，細胞間交互作用更強[23]；且纖維蛋白凝膠自身亦可釋放血小板生成因子 PDGF 及TGF-β[24]，進一步促進細胞增殖和軟骨基質的合成。未添加 TGFβ3 的凝膠支架組，其 GAG 水平及II 型膠原基因表達與添加了 TGFβ3 誘導的 Pellet 組幾乎一致，這可能是由于基礎培養(yǎng)基中的 ITS＋及地塞米松具有一定的誘導成軟骨效應[25-26]，在纖維凝膠多孔支架中能較好地發(fā)揮成軟骨誘導效應。

本研究表明利用纖維蛋白凝膠支架誘導人脂肪干細胞成軟骨分化的能力優(yōu)于無支架的單純 Pellet培養(yǎng)，所形成的軟骨組織在功能與結構上更接近天然軟骨，說明利用纖維蛋白支架誘導成軟骨效率更高。這為今后利用纖維蛋白凝膠復合自體脂肪干細胞再生組織工程軟骨提供了實驗依據，并為軟骨損傷的臨床治療提供了新的思路。

[1]Aichroth PM, Patel DV, Moyes ST. A prospective review of arthroscopic debridement for degenerative joint disease of the knee[J]. Int Orthop, 1991, 15(4):351-355.

[2]Aubin PP, Cheah HK, Davis AM, et al. Long-term follow up of fresh femoral osteochondral allografts for posttraumatic knee defects[J]. Clin Orthop Relat Res, 2001, (391 Suppl):S318-327.

[3]Ghazavi MT, Pritzker KP, Davis AM, et al. Fresh osteochondral allografts for post-traumatic osteochondral defects of the knee[J]. J Bone Joint Surg Br, 1997, 79(6):1008-1013.

[4]Knutsen G, Drogset JO, Engebretsen L, et al. A randomized multicenter trial comparing autologous chondrocyte implantation with microfracture: long-term follow-up at 14 to 15 years[J]. J Bone Joint Surg Am, 2016, 98(16):1332-1339.

[5]Zhu H, Yang F, Tang B, et al. Mesenchymal stem cells attenuated PLGA-induced in fl ammatory responses by inhibiting host DC maturation and function[J]. Biomaterials, 2015, 53:688-698.

[6]Ringe J, Sittinger M. Tissue engineering in the rheumatic diseases[J]. Arthritis Res Ther, 2009, 11(1):211.

[8]Mehlhorn AT, Niemeyer P, Kaschte K, et al. Differential effects of BMP-2 and TGF-beta1 on chondrogenic differentiation of adipose derived stem cells[J]. Cell Prolif, 2007, 40(6):809-823.

[9]Eslaminejad MB, Karimi N, Shahhoseini M. Chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells treated by GSK-3 inhibitors[J]. Histochem Cell Biol, 2013, 140(6):623-633.

[10]An HS, Thonar EJ, Masuda K. Biological repair of intervertebral disc[J]. Spine, 2003, 28(15 Suppl):S86-92.

[11]曹誼林. 組織工程學研究進展[J]. 上海交通大學學報醫(yī)學版, 2008, 28(7):763-766.

[12]Dare EV, Griffith M, Poitras P, et al. Fibrin sealants from fresh or fresh/frozen plasma as scaffolds for in vitro articular cartilage regeneration[J]. Tissue Eng Part A, 2009, 15(8): 2285-2297.

[13]Lieb E, Milz S, Vogel T, et al. Effects of transforming growth factor beta1 on bonelike tissue formation in three-dimensional cell culture. I. Culture conditions and tissue formation[J]. Tissue Eng, 2004, 10(9-10):1399-1413.

[14]Vinardell T, Buckley CT, Thorpe SD, et al. Compositionfunction relations of cartilaginous tissues engineered from chondrocytes and mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and infrapatellar fat pad[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2011, 5(9):673-683.

[15]Zhu Y, Liu T, Song K, et al. Adipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC[J]. Cell Biochem Funct, 2008, 26(6): 664-675.

[16]Cancedda R, Dozin B, Giannoni P, et al. Tissue engineering and cell therapy of cartilage and bone[J]. Matrix Biol, 2003, 22(1):81-91.

[17]Ishihara K, Nakayama K, Akieda S, et al. Simultaneous regeneration of full-thickness cartilage and subchondral bone defects in vivo using a three-dimensional scaffold-free autologous construct derived from high-density bone marrowderived mesenchymal stem cells[J]. J Orthop Surg Res, 2014, 9:98.

[18]Spicer PP, Mikos AG. Fibrin glue as a drug delivery system[J]. J Control Release, 2010, 148(1):49-55.

[19]Ahearne M, Buckley CT, Kelly DJ. A growth factor delivery system for chondrogenic induction of infrapatellar fat padderived stem cells in fibrin hydrogels[J]. Biotechnol Appl Biochem, 2011, 58(5):345-352.

[20]Homminga GN, Buma P, Koot HW, et al. Chondrocyte behavior in fibrin glue in vitro[J]. Acta Orthop Scand, 1993, 64(4):441-445.

[21]王九現, 朱立新, 靳安民, 等. 抑肽酶/氨甲環(huán)酸改良可注射性纖維蛋白凝膠的體外實驗[J]. 中國組織工程研究, 2008, 12(49):9703-9708.

[22]朱立新, 李奇, 林荔軍, 等. 改良纖維蛋白膠軟骨膜塊在模擬微重力培養(yǎng)下修復關節(jié)軟骨缺損[J]. 中國骨與關節(jié)損傷雜志, 2008, 23(9):741-744.

[23]Sheehy EJ, Mesallati T, Vinardell T, et al. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels[J]. Acta Biomaterialia, 2014, 13:245-253.

[24]Sims CD, Butler PE, Cao YL, et al. Tissue engineered neocartilage using plasma derived polymer substrates and chondrocytes[J]. Plastic Reconstr Surg, 1998, 101(6): 1580-1585.

[25]Liu X, Liu J, Kang N, et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(1):1525-1537.

[26]Sher L, Oquendo MA, Burke AK, et al. Combined dexamethasone suppression-corticotrophin-releasing hormone stimulation test in medication-free major depression and healthy volunteers[J]. J Affect Disord, 2013, 151(3):1108-1112.

( 本文編輯：李貴存 )

Comparison of in vitro chondrogenic ability between two culture modes: pellet culture system and fi brin gel scaffold

HUANG Liang-jie, WENG Tu-jun, ZHANG Chun-li, LIU Yan, QIAN Long, HOU Shu-xun. Xijing Hospital,the fourth Military Medical University, Xi’an, Shanxi, 710032, China

HOU Shu-xun, Email: hsxortho@hotmail.com

ObjectiveTo compare the effects of 2 different culture modes: pellet culture system and fi brin gel scaffold on the chondrocytic differentiation of adipose-derived stem cells ( ADSCs ) and the synthesis of cartilage extracellular matrix. Methods Adipose tissues were used to isolate human ADSCs and grown in Dulbecco’s modif i ed Eagle’s medium ( DMEM ) containing 10% fetal bovine serum ( FBS ). After the human ADSCs were cultured to the 3rd generation, they were induced into cartilage by 2 kinds of culture modes respectively. At the 21st day, the cells were observed by hematoxylin-eosin ( HE ) staining and safranine-O staining. The glycosaminoglycan ( GAG ) content in extracellular matrix was determined by content dimeth-ylmethylene blue ( DMMB ) method. The expression of type II collagen gene was assessed by real-time polymerase chain reaction ( PCR ). Results HE staining and safranine-O staining showed that the extracellular matrix of chondrocytes was strongly secreted in the fi brin gel scaffold group with transforming growth factor β3 ( TGFβ3 ) and fused into a sheet. It’s indicated that the fi brin gel scaffold could better promote cartilage differentiation of stem cells and maintain chondrocyte type. The results of GAG / deoxyribonucleic acid ( DNA ) showed that the ability to secrete GAG in the fi brin gel scaffold group with TGFβ3 was better than that of the other group ( P ＜ 0.05 ), and the expression of type II collagen messenger ribonucleic acid ( mRNA ) was the strongest ( P ＜ 0.05 ). Conclusions The ability of fi brin gel scaffold to differentiate ADSCs into cartilage is better than that of scaffold-free pellet culture system.

Fibrin; Stem cells; Tissue engineering; Cartilage; Pellet culture; Adipose-derived stem cell

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.03.008

Q254, R318

710032 西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院 ( 黃亮節(jié) )；100048 北京，解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院骨科、北京市骨科植入醫(yī)療器械工程技術研究中心 ( 翁土軍、張春麗、劉彥、錢隆、侯樹勛 )

侯樹勛，Email: hsxortho@hotmail.com

2016-10-11 )