皮膚結(jié)核診斷的新進(jìn)展

白 潔，張全華，頡玉勝(綜述)，趙紅斌(審校)

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院安寧分院 a.檢驗科，b.皮膚美容科，蘭州730070)

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，結(jié)核分枝桿菌(簡稱結(jié)核桿菌)每年引起全球約300萬人死亡［1］。隨著結(jié)核病呈流行性趨勢，皮膚結(jié)核(非肺性結(jié)核)也呈上升趨勢。不斷出現(xiàn)的耐藥結(jié)、耐多藥結(jié)核病，使有效控制結(jié)核病面臨更大的挑戰(zhàn)［2］。皮膚結(jié)核早期一般無癥狀，臨床表現(xiàn)多樣性，且與有些皮膚病表現(xiàn)相似，易造成誤診。實現(xiàn)對皮膚結(jié)核(非肺性結(jié)核)的有效診斷迫在眉睫?，F(xiàn)皮膚結(jié)核桿菌的細(xì)菌學(xué)檢測和免疫學(xué)檢測，分子生物學(xué)檢測等方面進(jìn)行綜述。

1 皮膚結(jié)核病的傳統(tǒng)診斷方法缺點

1.1 細(xì)菌學(xué)診斷 常規(guī)的細(xì)菌學(xué)診斷包括直接涂片抗酸染色和常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)法。抗酸染色是最基本的檢測結(jié)核桿菌的方法［3］。由于皮膚標(biāo)本中［活組織檢查(活檢)，膿液中］含菌量很小，所以陽性率很低。如果是非結(jié)核桿菌感染的皮膚結(jié)核則沒辦法檢測出結(jié)果。其次，細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)時間長，周期慢，要求高，通常需要2～3個月才能出結(jié)果而且培養(yǎng)出的結(jié)果陰性居多，從而影響結(jié)果的判讀。另外，與常規(guī)的結(jié)核桿菌細(xì)菌培養(yǎng)比［4］，非結(jié)核桿菌的檢測及鑒定通常操作要求更復(fù)雜。

1.2 免疫學(xué)診斷

1.2.1 結(jié)核菌素皮膚試驗 結(jié)核菌素皮膚試驗作為一項輔助診斷判斷機(jī)體是否感染結(jié)核桿菌，但此方法無法確定出是新感染的結(jié)核還是過去感染的結(jié)核桿菌，因此有一定的局限性［5-6］。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附法可以檢測患者血清中結(jié)核特異性抗體，此方法無需特殊儀器而且能快速診斷出結(jié)核桿菌，所以在結(jié)核病血清學(xué)診斷方面研究最多也最廣［7-9］。近年來免疫層析法、蛋白印跡和免疫斑點法均對皮膚結(jié)核的診斷發(fā)揮重要的作用，尤其是免疫斑點法對皮膚結(jié)核的膿液、分泌物的檢測更為有效、快速。但觀察對象不同，檢測使用抗原不同，質(zhì)量控制困難，人員操作等因素影響試驗結(jié)果［10］。

1.3 病理組織學(xué)檢查 結(jié)核桿菌皮膚感染常有典型的病理學(xué)特點，如朗格漢斯巨細(xì)胞，淋巴細(xì)胞為主形成的結(jié)核結(jié)節(jié)，中央有干酪樣壞死區(qū)域［10］。但由于非結(jié)核桿菌毒力較弱，中性粒細(xì)胞浸潤，嗜酸粒細(xì)胞增多，可發(fā)生非干酪壞死性組織細(xì)胞的反應(yīng)，有的甚至不發(fā)生類上皮細(xì)胞反應(yīng)［11］。另外，皮膚結(jié)核活檢的標(biāo)本小，有些結(jié)核發(fā)生于面部，頸部不容易取材觀察。

2 新型皮膚結(jié)核診斷的方法

2.1 分子生物學(xué)診斷方法 近幾年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，結(jié)核桿菌分子分類鑒定方法也逐漸建立并完善起來。目前用于檢測皮膚結(jié)核的方法有聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，核酸雜交，基因芯片等技術(shù)。

2.1.1 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR檢測，具有高特異性、高敏感性、快速簡便等特點。結(jié)核桿菌易受物理、化學(xué)、藥物及免疫因素的影響而發(fā)生變異(細(xì)胞壁缺陷或稱L型菌、耐藥變異菌、持續(xù)菌或休眠菌等)，用傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)技術(shù)難以檢出，造成漏診和假陰性。PCR方法檢測對象是結(jié)核桿菌基因保守區(qū)段不受細(xì)胞表型和耐藥等因素的影響，可提高陽性的檢出率。丘疹壞死性結(jié)核用傳統(tǒng)方法通常在其皮損中查不到結(jié)核桿菌，文獻(xiàn)報道，在上述病例中丘疹壞死性結(jié)核疹中用PCR檢測到結(jié)核桿菌，這為皮膚結(jié)核的診斷提供可靠的依據(jù)［12］。熒光定量PCR是一種準(zhǔn)確、快速、敏感性高、特異性好的方法，尤其對包埋的標(biāo)本和組織蠟塊的檢測更為有效。弓顯鳳等［13］檢測15例臨床與病理上診斷為皮膚結(jié)核的石蠟包埋活檢標(biāo)本，結(jié)果8例檢出結(jié)核桿菌復(fù)合群，比直接鏡檢與培養(yǎng)法所得的陽性率要高得多。李曉非等［14］應(yīng)用實時熒光定量PCR法用于結(jié)核病診斷，其特異性和敏感性均有所提高，顯著高于涂片，且操作簡便，對于結(jié)核病尤其是肺外結(jié)核的診斷具有較高的應(yīng)用價值。陳淑云和采云［15］報道用熒光定量PCR，敏感性要比一般PCR高，菌陽性尋常型狼瘡結(jié)核分泌物中陽性率為93.7%，在菌陰性尋常型狼瘡中為28.6%，而一般PCR在菌陰性的尋常型狼瘡中陽性率僅為24.8%。

2.1.2 核酸分子雜交 Posteraro等［16］將擴(kuò)增的16SrRNA13種探針進(jìn)行雜交，再與抗生蛋白鏈菌素-堿性磷酸酶共同孵育一段時間后加入相應(yīng)底物，已雜交的產(chǎn)物即可顯色。用這種方法檢測從鏡檢及培養(yǎng)均為陰性的尋常狼瘡患者皮損中檢測到結(jié)核桿菌DNA，證實此技術(shù)的可靠性和更高的敏感性。

2.1.3 基因芯片技術(shù) 近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基因芯片技術(shù)已初步應(yīng)用于結(jié)核桿菌的實驗室診斷?；蛐酒夹g(shù)是針對不同的基因突變型，將核酸探針固定在載體上，同時用PCR技術(shù)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，并將擴(kuò)增片段與基因芯片進(jìn)行雜交。最后芯片掃描成像，用配套軟件進(jìn)行判讀，可以在6～8 h內(nèi)得出鑒定結(jié)果，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡技術(shù)的操作繁瑣、自動化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測效率低等缺點。張立群等［17］試驗的新型基因芯片技術(shù)，基因芯片集芯片技術(shù)與PCR技術(shù)為一體，具有較好的敏感性和特異性，而且芯片背景干凈清晰，可以快速檢測17種臨床常見分枝桿菌，將常規(guī)的檢測時間由6～8周縮短為6 h。與傳統(tǒng)方法相比，此法有效地解決了傳統(tǒng)基因芯片應(yīng)用過程中，需要大型檢測設(shè)備不便于臨床應(yīng)用推廣的瓶頸問題，但成本高［18］。

2.2 結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測 結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測作為新的體外細(xì)胞免疫檢測的手段，因其不受卡介苗接種后的交叉反應(yīng)，以及不受絕大多數(shù)非結(jié)核桿菌的影響，主要用于結(jié)核的診斷［19］，其靈敏度和特異度可以達(dá)到90%以上;結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測釋放試驗利用結(jié)核桿菌而非牛分枝桿菌BCG株系表達(dá)的抗原刺激外周血單核產(chǎn)生γ干擾素，用于結(jié)核桿菌潛伏感染或活動感染的輔助診斷，經(jīng)體外全血培養(yǎng)，刺激全血標(biāo)本中結(jié)核抗原特異性T細(xì)胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，從而提供一種結(jié)核桿菌感染T細(xì)胞檢測方法。檢測結(jié)果在血樣采集后12～18 h得出，報告結(jié)果分為陽性、陰性和不確定。與目前我國廣泛使用結(jié)核菌素皮膚試驗皮試比較，結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測在發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌感染的敏感性方面更有優(yōu)勢，不僅如此，相比結(jié)核菌素皮膚試驗的診斷方面敏感性更高［20］。此外，由于結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測不存在無法留取痰標(biāo)本的問題，這對于一些無法留取痰標(biāo)本的患者，尤其是肺外結(jié)核的輔助診斷具有較重要的實踐意義。

世界上1/3的人口都存在潛伏性結(jié)核桿菌的感染［21］。近年來，大量實驗結(jié)果表明結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測與結(jié)核菌素皮膚試驗相比較，結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測具有較高的特異性。對于潛伏感染結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測的特異度在90%以上，結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測對于判斷皮膚結(jié)核是否存在結(jié)核潛伏感染的結(jié)果比結(jié)核菌素皮膚試驗更準(zhǔn)確［22-23］。

3 結(jié)語

運用新型、高效的技術(shù)及合理的診斷方案來診斷皮膚結(jié)核，成為皮膚結(jié)核病研究的主要課題。對皮膚結(jié)核診斷的新方案還有待于進(jìn)一步研究。在診斷與治療皮膚結(jié)核桿菌感染時把傳統(tǒng)方法與分子分類鑒定方法相結(jié)合，綜合考慮各種檢測結(jié)果，可為皮膚結(jié)核桿菌感染的早期診斷與治療提供可靠依據(jù)。

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