“菊花組織培養(yǎng)”實驗選取不同部位為外植體的結果比較

石虹梅　俞明月

（江蘇省蘇州中學　江蘇蘇州　215007）

“植物組織培養(yǎng)”技術在人教版必修1“細胞的生命歷程”這一章節(jié)中有介紹，美國科學家斯圖爾德利用胡蘿卜組織甚至細胞培養(yǎng)成了完整的植株；選修3專題2又一次提及植物組織培養(yǎng)技術及實驗；選修1生物技術實踐中將植物的組織培養(yǎng)技術列為一個專題。雖然“植物組織培養(yǎng)實驗”并未列在高考說明中，但是此實驗對于學生理解細胞的增殖分化、植物激素在植物生長發(fā)育中的作用，以及無菌操作、植物生長發(fā)育中影響的因素等都是一次很好的體驗探索活動。同時，也讓學生體會實驗操作的規(guī)范性、實驗設計的嚴謹性，對于提升學生的科學素養(yǎng)都有很大的幫助。筆者在多年的植物組織培養(yǎng)的中學教學實踐研究中，獲得了一些經驗體會，希望能為植物組織培養(yǎng)的中學實驗教學提供參考。

1　實驗目的

選取菊花的不同部位為外植體進行組織培養(yǎng)的結果比較。

2　實驗器具與材料

高壓蒸汽滅菌鍋、光照培養(yǎng)箱、無菌操作臺、MS培養(yǎng)基、6-BA溶液、NAA溶液、蒸餾水、NaOH溶液、培養(yǎng)瓶、量筒、燒杯、酒精燈、電爐、尖嘴鑷、剪刀、培養(yǎng)皿、pH精密試紙、菊花無菌苗等。

3　實驗操作

1）制備培養(yǎng)基。配制MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L 培養(yǎng)基 500 mL,瓊脂每升 7 g［1］，攪拌均勻。調節(jié)pH為5.6～5.8，分裝至15個100 mL的培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)基與接種時所需的剪刀、鑷子、培養(yǎng)皿等工具放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃滅菌20 min。

2）接種。將滅菌的培養(yǎng)基及操作工具放入無菌操作臺，打開鼓風機，紫外燈照射0.5 h后進行接種。接種前，無菌苗培養(yǎng)瓶、工作臺消毒后，點燃酒精燈，所有操作均在酒精燈附近進行。實驗分3組，每組5瓶。選取生長健壯的菊花嫩枝，取帶芽的莖段 3～4 mm、 節(jié)間中段 3～4 mm、（5×5）mm 左右的葉片小塊，分別接種到培養(yǎng)基中。標記接種日期和相關信息。

3）培養(yǎng)。將接種好的培養(yǎng)瓶放在光照培養(yǎng)箱中25℃、12 h光照/d培養(yǎng),每隔7 d觀察記錄實驗現(xiàn)象（圖1～圖3為外植體初始狀態(tài)，本文附圖見封四）。

4　實驗結果與分析

1）愈傷組織的誘導。外植體在MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后觀察到愈傷組織，4周后愈傷組織明顯（圖4～圖6）。

重復實驗中發(fā)現(xiàn)，有些帶芽的外植體腋芽生長比較快，愈傷組織形成不明顯。

2）愈傷組織的再分化。上述愈傷組織在培養(yǎng)6周后觀察到有再分化形成叢芽，8周后增大明顯（圖 7～圖 9）。

重復實驗中發(fā)現(xiàn)，葉片的愈傷組織再分化形成叢芽成功率很低，常常是愈傷組織長到一定程度不再生長也不分化，最后死亡。

在本實驗的激素條件下，菊花的帶芽莖段、節(jié)間中段、葉片作為外植體均有觀察到脫分化形成愈傷組織，但是帶芽莖段有一部分直接由腋芽發(fā)育長大，由愈傷組織再分化形成叢芽觀察不明顯；葉片形成的愈傷組織多數(shù)并沒有再分化形成叢芽，最后死亡；而節(jié)間中段的脫分化、再分化過程明顯且成功率高。

5　進一步實驗

菊花帶芽莖段、節(jié)間中段及葉片在不添加植物激素的情況下，組織培養(yǎng)能否成功？實驗材料與方法同上，結果表明，帶芽莖段直接由腋芽發(fā)育成幼苗，未能觀察到脫分化現(xiàn)象（圖10），長成的幼苗基本無分枝或分枝較少（圖13）；節(jié)間中段先脫分化形成愈傷組織（圖11），然后再分化形成叢芽（圖14），但是有部分莖段在培養(yǎng)2周后開始褐化，最后死亡；葉片在培養(yǎng)2周后均逐漸死亡（圖12）。

事實上，適合菊花芽、莖、葉組培的激素濃度和比例都不相同，哪種激素配比適合菊花的哪個器官也可以進行探究。

6　教學建議

高中生物學實驗教學要能全面開展，重要的是實驗有意義、容易開展、成功率高，因此在植物組織培養(yǎng)實驗的摸索中,提出以下建議供中學教師參考。

1）培養(yǎng)基的配制。首先配制MS培養(yǎng)基比較繁瑣，且保存時間較短，建議使用試劑盒。在制備固體培養(yǎng)基時，瓊脂的含量會影響培養(yǎng)基的硬度，培養(yǎng)基配好后分裝時，要充分搖勻，以免瓊脂不均勻而使得部分瓶中培養(yǎng)基未凝固，而部分瓶中培養(yǎng)基又太硬。此外，pH值也會影響培養(yǎng)基的凝固，所以滅菌前一定要調節(jié)pH值。

2）外植體的選擇。高中生物學課堂時間比較緊張，為節(jié)約時間，建議學生實驗采用無菌苗，省略外植體消毒步驟。本研究在學生實驗過程中，經過外植體消毒獲得組培材料，成功率比較低，多數(shù)都因污染而失敗。

此外建議選擇菊花的節(jié)間中段為外植體,觀察到脫分化、再分化現(xiàn)象明顯，且成活率高。

3）實驗過程。建議實行分組實驗，每組人員分工合作：接種操作、手機拍照錄像、觀察記錄、交流討論等，人人參與，最后完成整個實驗報告，匯報交流。整個班級小組可以進行同樣的實驗作為重復實驗，也可以分工進行不同的實驗，以探究不同的問題，例如菊花不同部位作外植體進行組織培養(yǎng)的比較、有無植物激素對菊花組織培養(yǎng)的影響、植物激素比例對菊花組織培養(yǎng)的影響等。鼓勵學生提出問題、作出假設、設計并進行實驗，并用實驗驗證自己的推測。在實驗過程中出現(xiàn)的任何問題都是教學的一種資源，不可輕易否定或忽視。

［1］秘嘉.MS培養(yǎng)基發(fā)硬問題淺析.現(xiàn)代閱讀,2012(5):5.

［2］周鑫.植物組織培養(yǎng).北京.航空工業(yè)出版社,2012:142.