秋石斛叢生芽誘導增殖技術(shù)研究*

陳齊明鮑曉紅高小坤舒婷

（1.福建省鑫閩種業(yè)有限公司，福建福清350301；2.福建省林業(yè)科學研究院，福建福州350012；3.福建省林業(yè)科技試驗中心，福建南靖363600）

秋石斛（Dendrobiumhybrida）為蘭科（Orchidaccac）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，其葉四季常綠、其花色彩艷麗且花形優(yōu)雅，是石斛蘭（Dendrobiumspp.）中最具觀賞價值的族群[1-2]。秋石斛花期長達1個多月，花序著生于假鱗莖頂端，每個花序著花3~20朵，具有剛強堅毅、祥和可親的氣質(zhì)，花語為“歡迎您，親愛的”，被不少國家定為“父親節(jié)之花”，為新加坡、泰國、馬來西亞等東南亞國家主要的切花創(chuàng)匯品種[3-4]。我國在改革開放后才陸續(xù)引進秋石斛蘭，起步較晚，同時由于地域氣候的限制，造成秋石斛蘭的規(guī)?；耘喟l(fā)展緩慢，以及在育種方面的滯后[5-6]。尤其是在優(yōu)良品種選育和育種方面，與國外相比還存在很大差距，具有自主知識產(chǎn)權(quán)的秋石斛新品種仍然不多。而且我國秋石斛市場上商品種魚龍混雜，質(zhì)量參差不齊，栽培的商品種多為雜交一代。通過種子進行播種育苗，子代分化大，無法得到與親本性狀一致的植株。采用分株繁殖，多代后會因病毒的積累造成品種退化[7]。利用植物組織培養(yǎng)方法擴繁秋石斛優(yōu)良品種，既可以完美保持親本性狀，又可提高秋石斛種苗繁育效率。為加速我國秋石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展，福建省鑫閩種業(yè)有限公司利用秋石斛“三亞陽光”這一優(yōu)良品種，對其組培擴繁中的叢生芽誘導增殖這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行了研究，以期為秋石斛的快速繁殖及其雜交育種后代優(yōu)良單株擴繁提供技術(shù)支持，為后期的秋石斛品種的工廠化組培育苗奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

從福建省鑫閩種業(yè)有限公司的秋石斛種質(zhì)資源收集圃選取“三亞陽光”植株健壯、芽飽滿、無病蟲害新生側(cè)芽做為外植體材料，低溫包裝帶回實驗室。

1.2　試驗方法

1.2.1　消毒滅菌

將選取的秋石斛新生側(cè)芽，剝?nèi)ネ饷嫒~鞘，放入飽和洗衣粉水中浸泡并輕輕搖蕩30min，再清水沖洗1 h后裝入廣口瓶中并放置于超凈工作臺內(nèi)，用75%酒精消毒30s后無菌水沖洗3次，然后用0.1%升汞消毒15min后，再用無菌水沖洗5次，用消毒過的濾紙吸干外植體表體水分后，將外植體剪成0.8~1cm左右?guī)Ч?jié)小段，接入配置好的誘導培養(yǎng)基。

1.2.2　誘導培養(yǎng)

選用MS、1/2 MS、4/5 MS、B5和WPS作為秋石斛誘導的基本培養(yǎng)基，采用不同濃度的6-BA外源激素與各基本培養(yǎng)基進行組合配置，調(diào)整培養(yǎng)基pH值為6.0±0.2，在121℃下滅菌30 min。每個處理20瓶，每瓶接入6個芽，每個處理3個重復(fù)。在溫度為25±1℃、光強2500±100 Lx，光照時間為12 h·d-1的培養(yǎng)室中培養(yǎng)45d后，調(diào)查統(tǒng)計外植體誘導出芽率。

1.2.3　秋石斛芽的增殖培養(yǎng)

采用L9（34）正交試驗設(shè)計，對秋石斛的增殖培養(yǎng)基進行配制，并根據(jù)實際操作中的經(jīng)驗，添適量的加卡拉膠、活性炭、微量元素等改良KC、B5和MS培養(yǎng)基。各基礎(chǔ)培養(yǎng)基、激素以及激素濃度的設(shè)置如表1所示。然后依據(jù)正交設(shè)計表的9個處理對秋石斛進行初代培養(yǎng)試驗，每處理20瓶，每瓶6個，3個重復(fù)。在溫度為25±1℃、光強2500±100 Lx，光照時間為12 h·d-1的培養(yǎng)室中培養(yǎng)45d后，調(diào)查統(tǒng)計芽的數(shù)量，計算芽增殖倍數(shù)。

1.3　數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2003和DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和處理。

表1　秋石斛增殖培養(yǎng)正交試驗因子及水平

表2　秋石斛增殖培養(yǎng)正交試驗設(shè)計表

2　結(jié)果與分析

2.1　秋石斛芽的誘導

切取秋石斛側(cè)芽莖尖接種在以MS為基礎(chǔ)的誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)并連續(xù)觀察28d。試驗結(jié)果如表3、4所示，由表6可知當6-BA的濃度在0.1~0.3mg·L-1之間時，隨著6-BA的濃度的升高，芽誘導率呈遞增趨勢，并在0.3 mg·L-1時誘導率達到最高（92.86%），當6-BA濃度超過0.3 mg·L-1并繼續(xù)增高時，秋石斛芽誘導率開始極顯著下降。而且，對各個處理進行多重比較，處理4與其它5個處理間存在極顯著差異。因此，秋石斛側(cè)芽莖尖外植體誘導芽時所需6-BA最佳濃度為0.3 mg·L-1。

從表4中可以看出，將6-BA 0.3 mg·L-1分別添加入1/2 MS、4/5 MS和WPS基本培養(yǎng)基中，其中MS基本培養(yǎng)基的誘導率最高達到92.86%，芽體生長良好且在基部產(chǎn)生了大量的愈傷組織，同時愈傷組織上出現(xiàn)了芽點；B5基本培養(yǎng)基的誘導也達到88.33%，但是芽體生長后期缺乏營養(yǎng)，28d后芽體上生長出的葉片會出現(xiàn)黃化現(xiàn)象；1/2 MS、4/5 MS、WPS三種基本培養(yǎng)基對芽的誘導率較之MS基本培養(yǎng)基要低，誘導率在52.71~78.96%之間，且芽體在這三種基本培養(yǎng)基上長勢均較MS培養(yǎng)基要弱，愈傷組織產(chǎn)生也相對較少。因此，秋石斛莖段進行芽誘導時應(yīng)選擇MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基。

表3　不同濃度的6-BA對芽誘導的影響

表4　不同的培養(yǎng)基對芽誘導的影響

2.2　不同培養(yǎng)基配比下秋石斛的增殖情況

采用正交設(shè)計試驗研究了3種基本培養(yǎng)基以及6-BA、NAA、葡萄糖等4種因素對秋石斛側(cè)芽誘導增殖的影響，由表5、表6可知，當培養(yǎng)基和外源激素配比情況相同時，秋石斛側(cè)芽的增殖系數(shù)差異不顯著（P=0.6608＞0.05），而不同培養(yǎng)基以及不同激素濃度配比情況下，秋石斛側(cè)芽的誘導增殖系數(shù)存在著極顯著差異（P=0.0001＜0.01）。9個處理組中除第5組的誘導增殖系數(shù)為2.50外，其它8個組的誘導增殖系數(shù)均超過了3，其中第8處理組的誘導增殖系數(shù)高達8.15，極顯著高于其它9個處理組。說明采用秋石斛的側(cè)芽進行誘導增殖是可行的，但要想取得較高的增殖系數(shù)，需要進一步對培養(yǎng)基進行合理的調(diào)整和配比。

正交試驗結(jié)果（表7）表明，基本培養(yǎng)基、6-BA濃度、NAA濃度、葡萄糖濃度的R值分別為3.9633、0.8466、0.9727和0.5614，即這4個因素對秋石斛繼代增殖的影響力的大小順序為：基本培養(yǎng)基＞NAA濃度＞6-BA濃度＞葡萄糖濃度。這說明秋石斛側(cè)芽增殖起主要作用的是基本培養(yǎng)基，其次是NAA濃度，而葡萄糖濃度對增殖的影響相對最小。秋石斛芽誘導的最佳處理組合為A3B1C1D3，即采用改良MS+6-BA 0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+葡萄糖30g·L-1作為秋石斛的繼代增殖培養(yǎng)基，能獲得最高的增殖系數(shù)。

表5　不同培養(yǎng)基配方下秋石斛增殖系數(shù)方差分析及顯著性檢驗

表6　不同培養(yǎng)基配方下秋石斛增殖情況分析

表7　秋石斛增殖培養(yǎng)正交試驗結(jié)果

3　小結(jié)與討論

采用秋石斛的新生側(cè)芽為外植體培養(yǎng)秋石斛組培苗，結(jié)果表明：秋石斛側(cè)芽莖尖的最佳誘導培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.3mg·L-1，誘導率高達92.86%，外植體基部產(chǎn)生了大量的愈傷組織，同時愈傷組織上出現(xiàn)了芽點，芽點陸續(xù)發(fā)育成芽體粗壯，伸長明顯的不定芽，芽體的莖段的節(jié)間陸續(xù)冒出葉芽發(fā)育成葉，葉片濃綠，生長較好。秋石斛繼代增殖培養(yǎng)過程中，不同培養(yǎng)基配方下秋石斛的增殖系數(shù)存在極顯著差異，而同種配方下秋石斛的增殖系數(shù)不顯著?；九囵B(yǎng)基、6-BA濃度、NAA濃度、葡萄糖濃度均會影響到秋石斛的增殖系數(shù)，其中對秋石斛誘導增殖的影響最大的為基本培養(yǎng)基種類。秋石斛最佳培養(yǎng)基配方為改良MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+葡萄糖30g·L-1，秋石斛繼代增殖系數(shù)可達8.15倍。采用其它培養(yǎng)基配方，繼代增殖系數(shù)變化很大，從2.50~7.03不等。

培養(yǎng)基種類和生長調(diào)節(jié)劑種類與濃度、營養(yǎng)添加物的種類與濃度均影響著秋石斛的誘導與增殖，這些因子間又存在相互作用的關(guān)系。在生產(chǎn)實踐中，為克服秋石斛組織培養(yǎng)過程中褐化現(xiàn)象的發(fā)生，還會在培養(yǎng)基中添加抗褐化劑，而抗褐化劑的添加會在一定程度上影響最佳增殖培養(yǎng)基增殖效果的發(fā)揮。因此，從試驗得出的最佳培養(yǎng)基配方，應(yīng)用到生產(chǎn)實踐，還需進一步探索秋石斛組培育苗過程中的各種因素的平衡點，使秋石斛在實現(xiàn)誘導率最高的同時，能順利進入繼代增殖環(huán)節(jié)獲得最高的增殖系數(shù)，進入生根培養(yǎng)環(huán)節(jié)能獲得生根較好、個體壯實的組培苗，同時還能兼顧育苗成本，實現(xiàn)秋石斛組培育苗的效益最大化。

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