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    “低溫誘導(dǎo)植物染色體數(shù)目變化”實(shí)驗(yàn)的探究與思考

    2017-04-08 08:40:44李加重
    生物學(xué)通報(bào) 2017年7期
    關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)學(xué)生

    鄧 琳 李加重

    (1天津市靜海區(qū)瀛海學(xué)校 天津 301600 2天津市靜海區(qū)教育教學(xué)研究室 天津 301600)

    “低溫誘導(dǎo)植物染色體數(shù)目變化”實(shí)驗(yàn)是人教版高中生物學(xué)必修2“染色體變異”一節(jié)中的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。該實(shí)驗(yàn)的目的是幫助學(xué)生理解低溫誘導(dǎo)植物細(xì)胞染色體數(shù)目變化的作用機(jī)制,有利于了解染色體變異在實(shí)際生活中的應(yīng)用。但是在實(shí)際教學(xué)中,按照教材介紹的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)遇到了很多問題,例如成功率低、觀察效果不理想等,不利于學(xué)生對誘導(dǎo)機(jī)制形成直觀感受與認(rèn)知。分析原因,一方面是低溫誘導(dǎo)的溫度和處理時(shí)間的選擇存在爭議;另一方面是在制作裝片的過程中對解離、染色等環(huán)節(jié)條件的控制有待改進(jìn)。因此筆者組織學(xué)生在實(shí)際操作中對該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了進(jìn)一步的探究和改進(jìn)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料 結(jié)合教材,實(shí)驗(yàn)小組本著實(shí)驗(yàn)材料易獲得、操作簡單、染色體條數(shù)少、易觀察等原則,確定了幾種實(shí)驗(yàn)材料:蠶豆(2n=12)、洋蔥(2n=16)、豌豆(2n=14)、大蔥、大蒜。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

    1.2.1 培養(yǎng)根尖 將蠶豆和豌豆種子在清水中浸泡,待種子泡發(fā)后放入鋪有濕潤紗布的培養(yǎng)皿中于室溫下培養(yǎng)。因氣溫較高,培養(yǎng)皿置于無光陰涼處,且每天換水2次。若實(shí)驗(yàn)室具備恒溫箱,可將培養(yǎng)皿放入10℃中培養(yǎng),每2天換一次水(水浸沒種子的1/3或1/2)。洋蔥需在實(shí)驗(yàn)前去除老根和干枯的鱗片葉,放入盛有清水的容器中,水以沒過洋蔥根部為宜,于室溫下培養(yǎng)。

    1.2.2 低溫誘導(dǎo)處理 待實(shí)驗(yàn)材料根的長度達(dá)到1 cm左右時(shí),將實(shí)驗(yàn)材料平均分為3組,分別置于2℃、4℃的冰箱中進(jìn)行低溫處理;對照組于室溫下進(jìn)行培養(yǎng)。低溫處理時(shí)長控制在36 h(換水時(shí)注意用相應(yīng)溫度的水以減少實(shí)驗(yàn)誤差)。低溫處理后恢復(fù)常溫培養(yǎng)10 h。

    1.2.3 材料處理制作裝片

    1)固定和解離:借助卡諾氏液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)進(jìn)入組織和細(xì)胞并將其殺死,使其形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)容物盡可能保持完整,還能增強(qiáng)染色體的染色效果。用解離液(15%HCl∶95%酒精=1∶1)去除細(xì)胞壁間的果膠使細(xì)胞壁軟化,并使細(xì)胞間中膠層物質(zhì)溶解便于細(xì)胞分離。依據(jù)教材實(shí)驗(yàn)步驟[1],取 0.5~1 cm 的根尖(可取 1 cm,便于在之后的操作中取放,在染色時(shí)再將多余部分去除)放入卡諾氏液中浸泡。教材要求固定0.5~1 h,解離3~5 min,因考慮解離效果受到自身材料、溫度和時(shí)長及固定效果的影響[2],實(shí)驗(yàn)小組學(xué)生將固定和解離結(jié)合考慮,設(shè)置多組對比實(shí)驗(yàn)。通過不斷調(diào)整固定和解離的時(shí)間發(fā)現(xiàn),固定時(shí)間控制在0.5 h對于之后的操作效果更好。固定后的材料用95%的酒精進(jìn)行充分沖洗,以免影響解離效果。為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,固定過程中借助恒溫箱將溫度設(shè)定為25℃,濕度40%。解離效果蠶豆以25~30 min為宜;豌豆15 min為宜;洋蔥 10 min為宜(材料保持完整形態(tài),染色時(shí)可被搗碎,壓片時(shí)蓋上蓋玻片即可將材料壓碎使細(xì)胞分散開)。解離時(shí)間不足會(huì)導(dǎo)致壓片不能成霧狀、細(xì)胞不能充分分散重疊度高、染色不充分等情況。

    2)漂洗:依據(jù)教材介紹的實(shí)驗(yàn)步驟,解離后使用清水對實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行漂洗以去除殘留的解離液,防止解離過度。注意應(yīng)漂洗3次,每次2~3 min,且注意動(dòng)作力度,防止破壞根尖形態(tài)。

    3)染色:可選染液包括龍膽紫、醋酸洋紅和改良苯酚品紅溶液。本次實(shí)驗(yàn)選擇龍膽紫(缺點(diǎn)在于易對細(xì)胞質(zhì)染色,染色體觀察不清,增大觀察難度)和醋酸洋紅(缺點(diǎn)在于配制復(fù)雜,購買配制好的染液價(jià)格昂貴)。采取2種染色方法,其一將實(shí)驗(yàn)材料浸泡在染液中3~5 min;其二在載玻片上滴一滴清水,將已漂洗的實(shí)驗(yàn)材料置于清水中,滴加一滴染液,再用鑷子將根尖輕輕搗碎至組織分散,染色 2 min[3](通過比較,學(xué)生發(fā)現(xiàn)第 2 種方法染色更快、更均勻)。

    4)蓋上蓋玻片,在蓋玻片上鋪吸水紙并加一層載玻片,輕輕按壓,注意力度。也可用鑷子鈍頭輕輕敲打蓋玻片下的材料,使材料分散成霧狀。用高倍鏡觀察細(xì)胞的染色體情況。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 洋蔥和蠶豆實(shí)驗(yàn)效果的比較 實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn),蠶豆根尖因培養(yǎng)時(shí)間較長、根比較粗壯、細(xì)胞質(zhì)豐富等原因,使得現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下不利于染色體數(shù)目的觀察。豌豆根尖質(zhì)地堅(jiān)硬,不易制作壓片。與前2種材料相比,洋蔥根的培養(yǎng)時(shí)間較短、分裂旺盛、便于染色觀察。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察,洋蔥試驗(yàn)比較容易獲得對比度較好的染色體(染色質(zhì))染色效果。

    2.2 洋蔥根尖于龍膽紫、醋酸洋紅染液染色效果的比較(圖1、圖2,本文附圖見封四)。

    如圖可見,0.02%龍膽紫染液較0.01%龍膽紫染液染色效果深,影響染色體(染色質(zhì))觀察,醋酸洋紅染液染色效果清晰、明亮,可清晰地觀察到細(xì)胞中染色體(染色質(zhì))的分布情況。

    2.3 蠶豆、洋蔥根尖在不同處理?xiàng)l件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    1)蠶豆在 2℃、4℃條件下培養(yǎng)36 h,然后在室溫培養(yǎng)10 h,隨后鏡檢,分析實(shí)驗(yàn)效果(圖3)可見,細(xì)胞分裂的中期和后期,部分細(xì)胞大小和染色區(qū)域面積明顯較大。因染色條件不易把握,不易觀察到清晰的分裂前期圖像和染色體數(shù)量加倍的現(xiàn)象。

    2)洋蔥根尖 2℃、4℃條件下培養(yǎng) 36 h,然后在室溫培養(yǎng)10 h,隨后鏡檢。結(jié)果(圖4、圖5)顯示,2種溫度誘導(dǎo)處理后再進(jìn)行常溫培養(yǎng)的根尖,細(xì)胞分裂均比較旺盛,少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)染色體數(shù)目加倍的現(xiàn)象。其中,4℃條件下能觀察到根尖細(xì)胞分裂更旺盛,說明洋蔥在這樣的誘導(dǎo)條件下實(shí)驗(yàn)效果相對更好。

    3 討論和分析

    本次實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)前學(xué)生按教材過程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,針對操作中發(fā)現(xiàn)的問題對實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行了分析和討論,并分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。針對實(shí)驗(yàn)材料、原理、自變量和因變量進(jìn)行了設(shè)定,例如以溫度為自變量,以誘導(dǎo)時(shí)間為自變量等。

    3.1 對低溫范圍的設(shè)定 在操作中要將溫度控制在多少度才能更好地使植物細(xì)胞發(fā)生染色體數(shù)目變化?教材中要求將溫度設(shè)定在4℃,但學(xué)生對“低溫”這一概念存在許多疑問。在進(jìn)行低溫誘導(dǎo)研究時(shí),通過分組實(shí)驗(yàn),學(xué)生將溫度分別控制在2℃、4℃。對于學(xué)生提出的為何不能將溫度設(shè)置在零下,筆者保留了問題,要求學(xué)生參考低溫誘導(dǎo)染色體加倍和酶活性原理查閱相關(guān)資料進(jìn)行思考。學(xué)生經(jīng)實(shí)際培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),0℃誘導(dǎo)條件下根尖出現(xiàn)凍害變黑、變軟,不能用于鏡檢。

    3.2 對低溫處理時(shí)間的探究 學(xué)生通過查閱低溫誘導(dǎo)植物染色體數(shù)目變化的原理可知,低溫阻礙細(xì)胞內(nèi)酶促反應(yīng)的進(jìn)行,從而導(dǎo)致細(xì)胞分裂時(shí)紡錘體的形成途徑受阻,以致影響子染色體被拉向細(xì)胞兩極,使細(xì)胞不能分裂成2個(gè)子細(xì)胞,于是植物細(xì)胞染色體數(shù)目加倍。觀察染色體數(shù)目的最佳時(shí)期是細(xì)胞分裂的中期。因此,要在低溫條件下處理多長時(shí)間成為另一個(gè)重要問題。學(xué)生討論得出答案:只有當(dāng)細(xì)胞分裂進(jìn)入到第2個(gè)細(xì)胞周期的中期時(shí)才能確保觀察比較低溫誘導(dǎo)染色體數(shù)目變化是否成功。因此低溫處理時(shí)長至少需要長于1個(gè)細(xì)胞周期。其次,低溫降低酶的活性,細(xì)胞代謝水平整體下降,分裂速度變緩,使得細(xì)胞周期延長。筆者提供常溫下蠶豆根尖的細(xì)胞周期為17.3 h[4],洋蔥根尖的細(xì)胞周期大于12 h,因此,實(shí)驗(yàn)小組決定按教材要求將低溫處理時(shí)間設(shè)定為36 h。

    3.3 實(shí)驗(yàn)中如何確定染色體數(shù)目發(fā)生變化的細(xì)胞 為便于比較細(xì)胞中染色體數(shù)目是否發(fā)生變化,進(jìn)行常溫培養(yǎng)對照實(shí)驗(yàn),用以觀察不經(jīng)低溫誘導(dǎo)的根尖分生區(qū)細(xì)胞中染色體數(shù)目及分布情況。但在實(shí)際觀察中很難數(shù)清染色體條數(shù)。

    在實(shí)驗(yàn)裝片的觀察中,學(xué)生發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞中存在2個(gè)距離很近且清晰的細(xì)胞核(圖6、圖7),不同于分裂末期的細(xì)胞。學(xué)生提出質(zhì)疑后,筆者組織學(xué)生對比觀察對照組材料裝片和實(shí)驗(yàn)組裝片,設(shè)置表格記錄雙核細(xì)胞出現(xiàn)的頻率。比較發(fā)現(xiàn)只有實(shí)驗(yàn)組裝片存在這一現(xiàn)象,就此問題學(xué)生深入思考雙細(xì)胞核形成的原因。經(jīng)查閱資料和分析得出,低溫誘導(dǎo)過程中細(xì)胞分裂并未阻斷細(xì)胞的分裂行為而使分裂停止在前期或中期。由于低溫使紡錘體裝配組件受到影響,使分開的染色單體不能拉向細(xì)胞兩極,也未形成2個(gè)子細(xì)胞。對于已經(jīng)進(jìn)入后期但染色體未到達(dá)兩極的細(xì)胞來說,子染色體將停止運(yùn)動(dòng)隨后形成2個(gè)新的細(xì)胞核,同時(shí)低溫影響細(xì)胞質(zhì)分裂2個(gè)子核保留在同一個(gè)母細(xì)胞中[5]。學(xué)生提出可利用雙核細(xì)胞作為“低溫誘導(dǎo)細(xì)胞染色體數(shù)目變化”的實(shí)驗(yàn)輔助觀察指標(biāo),提高實(shí)驗(yàn)的成功率。

    3.4 實(shí)驗(yàn)中一些細(xì)節(jié)問題 實(shí)驗(yàn)小組學(xué)生通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)過低溫處理的根尖直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn),可觀察到的進(jìn)行細(xì)胞分裂的細(xì)胞較少。分析原因可能是低溫處理后,細(xì)胞未能進(jìn)入新的分裂期,即出現(xiàn)細(xì)胞同步化[6]。針對這一問題,選擇在低溫誘導(dǎo)后恢復(fù)常溫培養(yǎng)使細(xì)胞分裂再次進(jìn)行?;謴?fù)常溫培養(yǎng)的時(shí)間嚴(yán)格控制在實(shí)驗(yàn)材料的1個(gè)細(xì)胞周期以內(nèi)即10 h,從而使低溫誘導(dǎo)后的細(xì)胞再次出現(xiàn)一個(gè)細(xì)胞分裂的高峰。

    細(xì)胞分裂在24 h內(nèi)旺盛程度不同,考慮細(xì)胞分裂于上午10時(shí)至下午14時(shí)較旺盛,選擇將放入冰箱進(jìn)行低溫誘導(dǎo)的時(shí)間定為上午10時(shí)。對誘導(dǎo)處理后的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察也應(yīng)將時(shí)間選擇在上午10時(shí)左右進(jìn)行。

    4 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)通過學(xué)生分組探究,對“低溫誘導(dǎo)植物染色體數(shù)目的變化”實(shí)驗(yàn)中的一些細(xì)節(jié)進(jìn)行了補(bǔ)充,對固定、解離、染色等常規(guī)操作步驟做了更詳細(xì)的處理,以提高實(shí)驗(yàn)的成功率。染色體觀察效果證明,雖然蠶豆的染色體數(shù)目少、細(xì)胞大,但在高中實(shí)驗(yàn)中洋蔥相比于蠶豆、豌豆等實(shí)驗(yàn)材料更理想,具有操作簡單、解離時(shí)間短、染色體染色效果清晰等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn),醋酸洋紅染色較龍膽紫更易獲得對比度高的染色體(染色質(zhì))圖像;考慮使用安全和經(jīng)濟(jì)條件等因素,可使用0.01%龍膽紫染液。

    需要說明的是,蠶豆、洋蔥等都是經(jīng)過許多人探索,適于教學(xué)實(shí)驗(yàn)的材料;龍膽紫、醋酸洋紅等均被長期用于染色體顯色實(shí)驗(yàn)。有經(jīng)驗(yàn)、有水平的實(shí)驗(yàn)者均可利用這些材料、方法獲得高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所以,這里僅從探究角度進(jìn)行分析,所獲的經(jīng)驗(yàn)在同等條件下具有參考價(jià)值和教學(xué)意義,但不試圖無條件推廣。相反,同行在此基礎(chǔ)上的進(jìn)一步改進(jìn)(甚至糾偏)一定更有價(jià)值。

    本實(shí)驗(yàn)仍有許多改進(jìn)之處。例如:將實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)溫度和時(shí)間進(jìn)行更細(xì)化處理;在處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí),可通過列表對細(xì)胞分裂指數(shù)進(jìn)行計(jì)算和比較,從而更準(zhǔn)確探究更好地誘導(dǎo)染色體數(shù)量變化的條件。筆者將進(jìn)一步嘗試,并組織學(xué)生設(shè)置后續(xù)實(shí)驗(yàn)方案,繼續(xù)探究。

    本次實(shí)驗(yàn)在教師的引導(dǎo)和提示下,學(xué)生充分參與實(shí)驗(yàn)的探究和思考,更好地體現(xiàn)了學(xué)生的主導(dǎo)地位,從而培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)思維和實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?,逐步養(yǎng)成不斷質(zhì)疑、不斷研究的學(xué)習(xí)習(xí)慣。

    [1]人民教育出版社,課程教材研究所,生物課程教材研究開發(fā)中心.生物:必修2.北京:人民教育出版社,2007.

    [2]郁建強(qiáng),陸文初.植物細(xì)胞有絲分裂實(shí)驗(yàn)技術(shù)的改進(jìn).實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2001(6):70.

    [3]林荔,肖義軍,詹曉梅.低溫誘導(dǎo)植物細(xì)胞數(shù)目變化實(shí)驗(yàn)的改進(jìn).中學(xué)生物學(xué),2012,28(1):45.

    [4]顧文波.細(xì)胞周期與細(xì)胞同步化.生物學(xué)教學(xué),2011,36(6):54.

    [5]利榮千.植物細(xì)胞學(xué)專題講座:第2講:植物細(xì)胞周期與細(xì)胞的異常分裂.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),1980(8):35.

    [6]周愛文,柯鐵,梅興國.低溫誘導(dǎo)紅豆杉細(xì)胞同步化的研究.武漢化工學(xué)院學(xué)報(bào),2001,34(1):12.

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