液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定育肥豬配合飼料中的阿奇霉素

唐 祥，趙立軍，羅 成，吳彩梅*，閆珊珊，劉光芒，林 燕，吳 德

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物營養(yǎng)研究所，四川省動物抗病營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部動物抗病營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130；2.農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室(成都)，四川 成都 610041；3.四川大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定育肥豬配合飼料中的阿奇霉素

唐 祥1，趙立軍2,3，羅 成1，吳彩梅1*，閆珊珊1，劉光芒1，林 燕1，吳 德1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物營養(yǎng)研究所，四川省動物抗病營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部動物抗病營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130；2.農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室(成都)，四川 成都 610041；3.四川大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065)

通過對提取溶劑、凈化方法及色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了配合飼料中阿奇霉素(AZM)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。樣品經(jīng)乙腈超聲波提取，MCX固相萃取柱凈化，BDS Hypersil C18(2.4 μm，100 mm×2.1 mm)色譜柱分離，以甲醇-0.05 mol/L乙酸銨水溶液為流動相梯度洗脫，正離子模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。在優(yōu)化條件下，AZM在1～250 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 1，檢出限(S/N≥3)為2.8 μg/kg，定量下限(S/N≥10)為8.4 μg/kg；在0.5，1，5，10 mg/kg加標(biāo)水平下，回收率為87.0%～106.6%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.58%～5.4%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～5.4%。該方法準(zhǔn)確、靈敏，選擇性強(qiáng)，基質(zhì)干擾小，可用于配合飼料中AZM的測定。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)；阿奇霉素；育肥豬；配合飼料

阿奇霉素(Azithromycin，AZM)是結(jié)構(gòu)類似于紅霉素的15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯(Macrolide，MAL)抗生素[1]，廣泛用于人上下呼吸道、泌尿道、皮膚及軟組織感染和性傳播疾病的預(yù)防和治療[2-3]。地方獸藥標(biāo)準(zhǔn)曾收錄AZM用于獸醫(yī)臨床治療，但人用抗菌藥物用于食品動物，會產(chǎn)生耐藥性問題，從而影響動物疫病控制、食品安全和人類健康。2005年8月農(nóng)業(yè)部發(fā)布第560號公告，AZM不符合獸藥安全有效審批原則，取消收錄AZM等MALs為獸藥的地方標(biāo)準(zhǔn)，將AZM列為禁用獸藥[4]。雖然國家明令禁止，但養(yǎng)殖環(huán)節(jié)帶來的經(jīng)濟(jì)效益受損，養(yǎng)殖戶將抗生素添加于飼料或針劑注射等方式給藥，導(dǎo)致人用抗生素仍被濫用于畜禽，已成為威脅畜禽產(chǎn)品安全的新隱患。因此，建立飼料中AZM準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法是加快實(shí)現(xiàn)無抗養(yǎng)殖，保證食品安全的重要任務(wù)。

目前AZM的檢測研究主要集中在AZM制藥原料、人和動物的血液等基質(zhì)，檢測技術(shù)主要有微生物法[5-6]、電化學(xué)法[7-8]、液相色譜法(LC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等。其中，微生物法操作繁瑣、費(fèi)時、精密度差、檢出限高，無法滿足殘留分析要求。美國藥典使用安培電化學(xué)檢測器測定AZM含量，其要求流動相pH值達(dá)到11和使用價格昂貴的氧化鋁色譜柱[9]。AZM的紫外吸收弱，采用配備紫外檢測器的LC法[10-12]進(jìn)行測定時，會導(dǎo)致峰形不對稱和柱效降低。配備熒光檢測器的檢測方法[13-14]可提高檢測靈敏度，但樣品需衍生，其處理過程費(fèi)時，結(jié)果易受衍生條件影響。而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法無需衍生、選擇性好、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣。

由于飼料中AZM的檢測方法未見研究報(bào)道，國內(nèi)及國際有關(guān)AZM的檢測標(biāo)準(zhǔn)亦未見報(bào)道，因此本研究通過對提取溶劑、凈化方法及色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化首次建立了配合飼料中阿奇霉素的HPLC-MS/MS法。通過對方法的選擇性、精密度和準(zhǔn)確度、檢出限和定量下限、基質(zhì)效應(yīng)和提取效率的測試，對方法的可行性進(jìn)行了分析。并將該方法用于育肥豬配合飼料樣品中AZM的測定，相關(guān)數(shù)據(jù)為配合飼料中AZM的風(fēng)險評估以及檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent 1200-6430 Triple Quad，美國Agilent公司)；渦旋振蕩混合器(德國IKA公司)；低溫離心機(jī)(日本Hitachi公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(美國Organomation公司)；固相萃取裝置(美國Agilent公司)；超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)對照品(純度≥97.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；阿奇霉素同位素內(nèi)標(biāo)(Azithromycin-d3，純度≥98.0%，加拿大Toronto Research Chemicals公司)；Oasis MCX固相萃取柱、Oasis HLB固相萃取柱、C18固相萃取柱(3 mL，60 mg；美國Waters公司)；甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、乙酸銨(色譜純，美國Sigma公司)；乙酸乙酯、乙醚(分析純，中國川東化工有限公司)；氨水(分析純，中國西隴化工有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備的超純水18.2 MΩ·cm。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取適量的AZM和AZM-d3對照品，用甲醇溶解稀釋，分別制成1 mg/mL和0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃條件下保存。使用時，用初始流動相逐級稀釋至所需濃度。

1.3 HPLC-MS/MS條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：BDS Hypersil C18(2.4 μm，100 mm×2.1 mm)；流動相為甲醇(A)和50 mmol/L乙酸銨水溶液(B)；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：30 ℃；梯度洗脫程序：0～3 min，90% A；3～3.5 min，線性變化至100% A；3.5～5 min，100% A；5～5.5 min，線性變回至90% A；5.5～8.5 min，90% A；分析總時間為12 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測。離子源溫度：300 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；氮?dú)庾鳛槿ト軇怏w，流速：10 L/min；霧化器壓力：40 psi；輔助氣壓力：15 psi；毛細(xì)管電壓：4 000 kV；錐孔電壓：4 000 kV；碰撞氣體為氬氣。定性、定量離子對及碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 AZM和AZM-d3的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for AZM and AZM-d3

1.4 樣品前處理

稱取1 g(精確至0.000 1 g)飼料樣品，置于50 mL帶蓋離心管中，加入1 mL水浸潤，加入1 μg/mL內(nèi)標(biāo)25 μL，加入10 mL乙腈超聲提取30 min，8 000 r/min離心10 min，收集上清液于50 mL聚丙烯離心管，沉淀物加入10 mL乙腈重復(fù)提取1次，合并上清液，45 ℃水浴氮?dú)鉂饪s至3 mL，待凈化。

將MCX柱置于固相萃取裝置上，分別用3 mL甲醇、3 mL水活化，上樣量2 mL，依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，負(fù)壓抽干，3 mL 15%的氨化甲醇洗脫，氮?dú)獯蹈桑? mL 90%的甲醇水溶液溶解殘?jiān)?.22 μm濾膜過濾，上機(jī)測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性、定量離子對的確定

正離子模式條件下，對AZM和AZM-d3進(jìn)行母離子掃描和子離子掃描，由所得質(zhì)譜圖確定AZM和AZM-d3的MRM通道分別為m/z749.6>591.3，m/z749.6>158.0和m/z752.5>594.2，AZM和AZM-d3的MRM通道與Filist等[15]報(bào)道一致。因此AZM的定性離子對為m/z749.6>591.3和m/z749.6>158.0，由于m/z749.6>591.3的相對豐度高，被確定為AZM的定量離子對。根據(jù)歐盟2002/EC/657[16]指令要求，該方法的定性需要滿足以下條件：①全掃描時，所選擇的離子的相對豐度超過濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液離子相對豐度的10%；②特征離子色譜峰的信噪比(S/N)應(yīng)在 3∶1 以上；③針對HPLC-MS/MS的檢測方法，1個母離子為1.0個識別點(diǎn)，2個對應(yīng)的子離子為2×1.5個識別點(diǎn)，方法應(yīng)滿足4個識別點(diǎn)的要求。在同時滿足上述3個條件時，可判斷樣品中存在AZM。而定量分析是采用內(nèi)標(biāo)法，以標(biāo)準(zhǔn)品MRM色譜峰面積/同位素內(nèi)標(biāo)MRM色譜峰面積對標(biāo)準(zhǔn)品AZM濃度/同位素內(nèi)標(biāo)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)對AZM添加量為1 mg/kg的飼料樣品測定，發(fā)現(xiàn)AZM的出峰時間與標(biāo)準(zhǔn)品一致，特征離子的豐度與標(biāo)準(zhǔn)品基本一致，因此本方法可用于配合飼料中AZM的確證檢測。

2.2 流動相的選擇

分別選用乙腈-0.2%甲酸水溶液、乙腈-50 mmol/L乙酸銨水溶液、甲醇-0.2%甲酸水溶液和甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液作流動相，其他色譜-質(zhì)譜條件同“1.3”所述，對質(zhì)量濃度為50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值和分離效果為評判依據(jù)，確定最佳流動相組成。結(jié)果表明，采用甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液作流動相時的信號響應(yīng)值最高，分離效果最好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[15,17-18]一致。由于流動相組成會顯著影響分析物的離子化效率，添加一定量的乙酸銨和甲酸有利于化合物的離子化和峰形的改善，本實(shí)驗(yàn)以甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相時，能提高信號的響應(yīng)值，提高方法的靈敏度，且色譜峰無拖尾，因此本方法選其作為流動相。

2.3 樣品提取試劑的確定

AZM屬于親脂類化合物，極性小，不溶于水，易溶于甲醇、乙酸乙酯、乙腈、乙醚等有機(jī)溶劑。實(shí)驗(yàn)分別選擇甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、乙酸乙酯作為提取溶劑，以響應(yīng)值為評判依據(jù)，確定最佳的提取試劑。按照“1.4”前處理方法和“1.3”色譜-質(zhì)譜條件，對添加濃度為1 mg/kg的質(zhì)控樣品進(jìn)行測定。結(jié)果表明，使用乙腈提取AZM的回收率最高，且提取液澄清，濃縮時間最短，滿足提取和后續(xù)凈化的要求，而與Filist等[15]采用叔丁基甲醚-正己烷(50∶50)為提取溶劑的處理方法相比，本方法更環(huán)保和安全。

表2 不同SPE柱的保留率與回收率Table 2 Retention rates and recoveries of different SPE column

2.4 樣品凈化方法的優(yōu)化

2.4.1 固相萃取柱的選擇 SPE能有效去除樣品中的雜質(zhì)，根據(jù) SPE 柱填料的種類不同，可分為正相柱、反相柱、離子交換柱、吸附柱和混合柱等。實(shí)驗(yàn)以MCX，C18，HLB 3種SPE柱分別凈化1 mg/kg的質(zhì)控樣品，考察其保留和絕對回收率，結(jié)果見表2。結(jié)果表明HLB柱未能全部富集樣品中AZM，出現(xiàn)穿漏現(xiàn)象，絕對回收率最低，MCX和C18柱的絕對回收率差別小，均能較好富集樣品中的AZM，但是吳獻(xiàn)花、張紅等[19-20]使用C18柱凈化尿液、血漿中的AZM時，發(fā)現(xiàn)柱中液體流干會嚴(yán)重影響回收率?？紤]到AZM屬于弱堿性化合物[21]，MCX萃取柱具有反相陽離子交換雙重保留性能，對弱堿性化合物具有良好的保留能力，絕對回收率最高，因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇MCX萃取柱為固相萃取柱。

2.4.2 洗脫溶劑中氨水比例和洗脫體積的選擇 選擇氨化甲醇為洗脫溶劑，以AZM絕對響應(yīng)值為評價依據(jù)，確定MCX柱氨化甲醇最佳洗脫比例和洗脫液的洗脫體積。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇中氨水濃度為15%時，AZM的響應(yīng)值最高。采用MCX凈化，洗脫液pH值應(yīng)大于AZM的pKa 2個值，AZM的pKa為8.795，本實(shí)驗(yàn)使用的10%，15%，20%，25%氨化甲醇的pH值分別為9.86，11.93，13.75和14.00，隨著洗脫液pH值的升高，AZM的響應(yīng)值逐漸降低，可能是由于AZM在高pH值的溶液中發(fā)生了降解。當(dāng)洗脫液體積從3 mL增至6 mL時，AZM的響應(yīng)值差異不顯著(P>0.05)，說明3 mL氨化甲醇溶液可將AZM洗脫完全。因此本實(shí)驗(yàn)選擇3 mL的15%氨化甲醇作為洗脫液。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 方法的選擇性 采用已建立的HPLC/MS/MS法分別測定空白育肥豬配合飼料樣品、空白樣品加入AZM標(biāo)準(zhǔn)品和AZM-d3的質(zhì)控樣品，平行測定6次，進(jìn)行方法選擇性評估，結(jié)果如圖1。結(jié)果表明，AZM和AZM-d3保留時間處未見干擾色譜峰。因此方法能準(zhǔn)確鑒別配合飼料中AZM和其他雜質(zhì)，無潛在干擾物質(zhì)，選擇性強(qiáng)。

2.5.2 方法的遺留影響 為考察高濃度樣品先于低濃度樣品上機(jī)對低濃度樣品MRM的影響，本實(shí)驗(yàn)先分析高濃度(225 μg/L)的質(zhì)控樣品后再對空白飼料樣品進(jìn)行分析，重復(fù)6次。結(jié)果表明，先分析高濃度樣品再分析低濃度樣品時，低濃度樣品未發(fā)現(xiàn)高濃度樣品的AZM的干擾峰，因此，本方法無高濃度樣品遺留分析物的影響。

2.5.3 方法的基質(zhì)效應(yīng) 分別采用空白飼料的基質(zhì)液和流動相制備0.5，1，5，10 mg/kg質(zhì)控樣品(n=6)，測定的AZM峰面積分別標(biāo)識為Am和Ar，按照ME=Am/Ar×100%計(jì)算AZM的基質(zhì)效應(yīng)。分別采用空白飼料的基質(zhì)液和流動相配制25 ng/mL 的AZM-d3(n=6)，計(jì)算AZM-d3的基質(zhì)效應(yīng)。

AZM和AZM-d3的基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算值分別為(99.1± 1.4)%和(102.7± 1.2)%，RSD分別為1.4%和1.2%。結(jié)果表明，AZM和AZM-d3的基質(zhì)效應(yīng)和RSD值滿足歐盟 2002/657/EC 規(guī)定的要求，方法的基質(zhì)干擾小。

2.5.4 方法的線性、檢出限及定量下限 為使標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液具有相似的離子化環(huán)境和消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量，以空白樣品提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。在樣品提取液中分別添加1，10，50，125，150，200，250 μg/L的AZM標(biāo)準(zhǔn)工作液，AZM-d3濃度為25 μg/L，以標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜峰面積/內(nèi)標(biāo)MRM色譜峰面積(y)對標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度/內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(內(nèi)標(biāo)法)。得到AZM的線性范圍為1～250 μg/L，線性方程為y=1.833x-0.144，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 1。

制備0.5 mg/kg的質(zhì)控樣品，按照“1.4”過程處理，稀釋上機(jī)液，上機(jī)測定，以分析樣品的信噪比(S/N)≥3和信噪比(S/N)≥10分別確定本方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，育肥豬配合飼料中AZM的LOD為2.8 μg/kg，LOQ為8.4 μg/kg。譚亞亞[22]、賈有志等[23]采用HPLC-MS/MS法分別測定人血漿、雞肉中AZM，其LOD分別為2.37 ng/mL和0.3 μg/kg。本文建立的飼料中AZM測定方法的檢出限與人血漿的HPLC-MS/MS法相當(dāng)，且前者的基質(zhì)雜質(zhì)繁多，測定難度大于血液樣品。

2.5.5 方法的回收率與精密度 本實(shí)驗(yàn)以空白飼料為樣品，設(shè)計(jì)了0.5，1，5，10 mg/kg 4個添加水平，每個添加水平重復(fù)測定6 個樣品，分別處理兩批，測定AZM的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，育肥豬配合飼料樣品的加標(biāo)回收率為90.7%～106.6%，批內(nèi)和批間精密度分別為0.58%～5.4%和3.1%～5.4%，其回收率和精密度滿足歐盟2002/657/EC規(guī)定的回收率應(yīng)為85%～115%、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)小于15%的要求。因此，本方法能準(zhǔn)確測定飼料中的AZM。

表3 飼料中AZM批內(nèi)、批間的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recovery and RSD of calibration samples for azithromycin in formula feed for fattening pig

2.6 方法的應(yīng)用

應(yīng)用本文建立的方法，分析了四川省育肥豬配合飼料中的AZM。按照NY/T1897-2010標(biāo)準(zhǔn)采集四川省1個省會城市，14個地級市，地域涵蓋了四川省東、西、南、北部共54個育肥豬養(yǎng)殖場的飼料樣品，其中成都市6份，內(nèi)江市9份，南充市1份，綿陽市10份，廣元市1份，達(dá)州市3份，樂山市5份，資陽市2份，德陽市2份，宜賓市2份，眉山市9份，瀘州市3份，廣安市1份，每個養(yǎng)殖場取商品飼料(槽料)樣品1份(約500g)。分析結(jié)果表明54份配合飼料樣品中均未檢出AZM。其原因可能為采集到的飼料中未添加AZM，但不排除養(yǎng)殖戶通過其他方式違規(guī)使用AZM，例如肌肉注射[24]和飲水或飼喂時小范圍拌料。因此，可通過增加樣本數(shù)及覆蓋面，擴(kuò)大采樣途徑，從而更全面地評價飼料中AZM的安全性。

3 結(jié) 論

本文通過對提取溶劑、凈化方法以及色譜-質(zhì)譜檢測條件的優(yōu)化，建立了飼料中AZM的HPLC-MS/MS檢測方法。該方法靈敏度高，選擇性強(qiáng)、基質(zhì)干擾小，使用同位素內(nèi)標(biāo)定量，進(jìn)一步提高了方法的準(zhǔn)確性，可用于配合飼料中AZM的測定。

[1] Fouda H G，Schneider R P.Ther.DrugMonitor.，1995,17(2)：179-183.

[2] Dunn C J，Barradell L B.Drugs，1996，51(3):483-505.

[3] Foulds G，Shepard R M，Johnson R B.J.Antimicrob.Chemother.，1990，25(Suppl A):73-82.

[4] Ministry of Agriculture.No.560 Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People's Republic of China(農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第560號).[2005-11-01].http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/200511/t20051117_496523.htm.

[5] Breier A R，Garcia C V，Oppe T P，Steppe M，Schapoval E E S.J.Pharm.Biomed.Anal.，2002，29(5):957-961.[6] Salgado H R N，Roncari A F F.ActaPharm.Sin.，2005，40(6):544-549.

[7] Gandhi R，Kaul C L，Panchagnula R.J.Pharm.Biomed.Anal.，2000，23(6):1073-1078.

[9] Zeng A G，Liu X，Zheng X R,Zheng Y，Huang P，Du k L，F(xiàn)u Q.AsianJ.Pharm.Sci.，2014，9(2):107-116.

[10] Zubata P，Ceresole R，Rosasco M A，Pizzorno M T.Pharm.Biomed.Anal.，2002，27(5):833-836.

[11] Yang Z Y，Wang L，Tang X.J.Pharm.Biomed.Anal.，2009，49(3):811-815.

[12] Bahrami G，Mohammadi B，Mirzaeei S，Kiani A.J.Chromatogr.B，2005，826(1/2):41-45.

[13] Wilms E，Trumpie H，Veenendaal W，Touw D.J.Chromatogr.B，2005，814(1):37-42.

[14] Bahrami G，Mohammadi B.J.Chromatogr.B，2006，830(2):355-358.

[16] Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 Implementing Council Directive 96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and Interpretation of Results.Off.J.Eur.Comm.L221:8-36.

[17] Chen B M，Liang Y Z，Chen X，Liu S G，Deng F L，Zhou P.J.Pharm.Biomed.Anal.，2006，42(4)：480-487.

[18] ShenY，Yin C，Su M X，Tu J S.J.Pharm.Biomed.Anal.，2010.52(1)：99-104.

[19] Wu X H，Zhou X H，Hou X，Dong X C，Yang G Y.J.YunnanUniv.Nationalities(吳獻(xiàn)花，周小華，侯霞，董學(xué)暢，楊光宇.云南民族大學(xué)學(xué)報(bào))，2006，1:42-44.

[20] Zhang H，Xia C H，Dai Q，Min S Y，Xiong Y Q.Chin.J.Pharm.Anal.(張紅，夏春華，戴群，閔盛云，熊玉卿.藥物分析雜志)，2007，2：174-176.

[21] Sun L，Zhang L，Wang X.J.Instrum.Anal.(孫雷，張?bào)P，汪霞.分析測試學(xué)報(bào))，2009，28(5)：576-580.

[22] Tan Y Y，Li B，Yang X.Chin.Pharm.(譚亞亞，李博，楊欣.中國藥業(yè))，2012，19：11-12.

[23] Su Y Z，Liu X B，Qi X.Chin.J.Anal.Lab.(粟有志，劉緒斌，齊鑫.分析試驗(yàn)室)，2014，12：1425-1429.

[24] Li J S，Han C H，Yu Y.Chin.J.Veter.Med.(李敬雙，韓春華，于洋.中國獸醫(yī)雜志)，2006，6：30-31.

Determination of Azithromycin in Formula Feed for Fattening Pigs by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

TANG Xiang1，ZHAO Li-jun2,3，LUO Cheng1,WU Cai-mei1*，YAN Shan-shan1，LIU Guang-mang1，LIN Yan1，WU De1

( 1.Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition and Feedstuffs of China Ministry of Agriculture，Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition of Sichuan Province，Institute of Animal Nutrition，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；2.Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Livestock and Poultry Products (Chengdu) 610041，China；3.College of Chemical Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065,China)

A method was developed for the determination of azithromycin in formula feed for fattening pigs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The sample was extracted with acetonitrile under ultrasonic assistance.Oasis MCX solid-phase extraction column was used for purification，and the chromatographic separation was performed on a Hypersil BDS C18column(2.4 μm，100 mm×2.1 mm) with gradient elution using 0.05 mol/L ammonium acetate-methanol(1∶9) as mobile phase.The detection of azithromycin was performed with positive ion under multiple reaction monitoring(MRM) mode.The internal standard isotope dilution method was used for quantification.A good linearity(r2=0.999 1) was obtained for azithromycin in the range of 1-250 μg/L.The limit of detection(LOD，S/N≥3) and the limit of quantitation(LOQ，S/N≥10) of azithromycin in the formula feed were 2.8 μg/kg and 8.4 μg/kg，respectively.Average recoveries ranged from 87.0% to 106.6% for the formula feed at spike levels of 0.5，1，5，10 mg/kg.The intra-RSDs for azithromycin were 0.58%-5.4% and the inter-RSDs were 3.1%-5.4%.The method is accurate and sensitive，and the matrix interference is small.The method could be applied in the determination of azithromycin in formula feed.

liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)；azithromycin；fattening pig；formula feed

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.011

2016-09-20；

2016-10-19

四川科創(chuàng)飼料產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院(2013NZ0054)；四川飼料產(chǎn)業(yè)分析檢測公共服務(wù)平臺(009Z0811)資助項(xiàng)目

O657.63；O629.5

A

1004-4957(2017)03-0361-06

*通訊作者：吳彩梅，碩士，高級實(shí)驗(yàn)師，研究方向：飼料安全檢測技術(shù)及飼料資源開發(fā)利用，Tel:028-86291592，E-mail：zhuomuniao278@163.com