食物中食源性病原菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

周威，胡梁斌，李紅波，張浩，莫海珍

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

食物中食源性病原菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

周威，胡梁斌，李紅波，張浩，莫海珍

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

食源性病原菌的檢測(cè)技術(shù)對(duì)維持我國(guó)的食品安全至關(guān)重要，目前所使用的檢測(cè)技術(shù)主要包括傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法和以免疫學(xué)和分子生物學(xué)為主的快速檢測(cè)方法。對(duì)以上方法的技術(shù)特點(diǎn)和應(yīng)用情況進(jìn)行綜述，同時(shí)對(duì)食源性病原菌檢測(cè)技術(shù)發(fā)展面臨的困難和研究方法進(jìn)行分析。

食源性病原菌；檢測(cè)技術(shù)；免疫學(xué)；分子生物學(xué)

隨著食品產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和消費(fèi)者的消費(fèi)習(xí)慣的改變，對(duì)于食品衛(wèi)生和食品安全的要求越來越高。而受到環(huán)境、氣候等影響，食源性病原菌污染食品造成疾病的幾率越來越高。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）指出食源性病原菌是主要的食品安全風(fēng)險(xiǎn)隱患，可造成食源性疾病和食物中毒爆發(fā)[1]。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，全世界每年發(fā)生的食源性腹瀉病例超過2億次，其中65%以上的病例食用過被食源性病原菌污染的食品[2]。國(guó)內(nèi)的研究資料顯示，在發(fā)生的食源性疾病中，由于污染病原菌導(dǎo)致疾病發(fā)生的比例達(dá)到71.28%[3]。由此可知，食源性病原菌污染導(dǎo)致的疾病，廣泛存在于發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家。從概念上講，食源性疾病是指生物性病原體等有毒有害物質(zhì)通過食用方式進(jìn)入人體并引起的疾病，包括中毒性和感染性發(fā)作，包括最為常見的化學(xué)性有毒有害物質(zhì)中毒、人畜共患傳染病和腸道傳染病等[4]。目前，最常見的食源性病原微生物主要包括黃曲霉菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌、肉毒梭菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌等[5]。本文對(duì)食品中食源性病原菌的檢測(cè)技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，為我國(guó)食品中病原菌的檢測(cè)、監(jiān)督和控制提供借鑒。

1 食源性病原菌傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用情況

病原菌的傳統(tǒng)鑒定方法主要是指先培養(yǎng)后觀察的方法，具有較高的鑒定效率，但存在培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)的缺點(diǎn)。目前主要的傳統(tǒng)鑒定方法，主要包括以下幾類。

1.1 培養(yǎng)鑒定法

培養(yǎng)鑒定方法基于生物化學(xué)的原理，對(duì)不同病原菌在生長(zhǎng)代謝過程中產(chǎn)生的酶類進(jìn)行特異性鑒定，檢測(cè)的酶類包括磷酸酶、蛋白酶、DNA酶、脂酶、酯酶和糖苷酶。具體的操作方法是：在特定培養(yǎng)基中加入指示劑和反應(yīng)底物，保證細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生一定顏色或發(fā)出熒光，實(shí)驗(yàn)人員通過觀察菌落顏色、數(shù)量和形態(tài)進(jìn)行鑒定。這種方法具有直觀性的特點(diǎn)，要求檢查條件不高，非常適合基層地區(qū)開展，也是當(dāng)前微生物檢測(cè)技術(shù)的主要方法[6]。

1.2 載體培養(yǎng)法

在培養(yǎng)鑒定法的基礎(chǔ)上，發(fā)展處載體培養(yǎng)法鑒定方法。載體培養(yǎng)費(fèi)又稱干片法，其原理是采用安全無毒的高分子材料為載體，分別將顯色物質(zhì)和培養(yǎng)基附著其上，之后通過培養(yǎng)，對(duì)病原菌的顯色反應(yīng)和生長(zhǎng)特征進(jìn)行鑒定。這種方法操作簡(jiǎn)單并且直觀準(zhǔn)確，可以將食物采樣和細(xì)菌接種同時(shí)進(jìn)行，并保留培養(yǎng)鑒定法的優(yōu)點(diǎn)，基本符合定量檢測(cè)的需求。特別是在乳品檢測(cè)中，載體培養(yǎng)法的升級(jí)版本-濾膜法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于奶油、巴氏殺菌乳和生乳的食品生產(chǎn)中[6]。

2 快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用情況

快速檢測(cè)技術(shù)是在傳統(tǒng)的鑒定方法基礎(chǔ)上開發(fā)出來的，具有節(jié)省時(shí)間、操作簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確率較高的優(yōu)點(diǎn)，主要包括以下幾種。

2.1 自動(dòng)化微生物快速培養(yǎng)與鑒定系統(tǒng)

自動(dòng)化微生物快速培養(yǎng)與鑒定系統(tǒng)是在傳統(tǒng)的鑒定培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上，使用計(jì)算機(jī)和儀器組合完成病原菌檢測(cè)的自動(dòng)化和集成化，在專業(yè)分析軟件的幫助下，達(dá)到靈敏、準(zhǔn)確、快速和簡(jiǎn)便的目的。該系統(tǒng)主要由病原菌培養(yǎng)系統(tǒng)和病原菌鑒定系統(tǒng)組成，培養(yǎng)系統(tǒng)可以在較短的時(shí)間內(nèi)，完成增菌實(shí)驗(yàn)；鑒定系統(tǒng)通過計(jì)算機(jī)形態(tài)學(xué)和生化分析軟件對(duì)病原菌的形態(tài)和代謝特征進(jìn)行分析，最終達(dá)到鑒定的目的。目前，自動(dòng)化微生物快速培養(yǎng)與鑒定系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種食品安全檢測(cè)機(jī)構(gòu)，檢測(cè)結(jié)果認(rèn)可較高[7]。

2.2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

免疫學(xué)檢測(cè)方法主要根據(jù)抗原抗體的特異性反應(yīng)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，這類方法的發(fā)展前提是獲得特異性的病原菌抗體，根據(jù)檢測(cè)手段的不同，目前主要包括：酶聯(lián)免疫分析法、免疫磁珠分離技術(shù)、雙功能抗體檢測(cè)技術(shù)和膠體金檢測(cè)技術(shù)。

2.2.1 酶聯(lián)免疫分析法

酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)（ELISA）是目前發(fā)展較為成熟的免疫學(xué)檢測(cè)方法，只需要獲得特異性的抗原抗體就可以設(shè)計(jì)研發(fā)。對(duì)于食源性病原菌的檢測(cè)通過采用雙抗夾心ELISA的方法，可以提高檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性。國(guó)內(nèi)外多個(gè)公司開發(fā)出大量的ELISA檢測(cè)試劑盒，可以檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、阪崎腸桿菌、志賀氏菌、乙型溶血鏈球菌、空腸彎曲桿菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7等多種食源性病原菌[6]。

2.2.2 免疫磁珠分離技術(shù)

免疫磁珠分離技術(shù)是一種基于免疫學(xué)原理的以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的分離鑒定技術(shù)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原菌的富集與分離。其基本原理是將病原菌特異性抗體制備成超順反子磁性顆粒，將這種顆?；旌显谑称窐颖局?，可以與病原菌發(fā)生特異性結(jié)合，然后通過磁場(chǎng)作用實(shí)現(xiàn)病原菌的分離與富集。免疫磁珠分離技術(shù)由于具有富集和分離雙重屬性，因此其兼容性非常好，可以與流式細(xì)胞儀、電化學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)和形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)有限結(jié)合，真正實(shí)現(xiàn)食源性病原菌的的快速檢測(cè)。以此為基礎(chǔ)開展的快速檢測(cè)已經(jīng)應(yīng)用到實(shí)際監(jiān)管中，如免疫磁珠分離技術(shù)和PCR技術(shù)聯(lián)用組建的食源性病原菌快速檢測(cè)設(shè)備已經(jīng)應(yīng)用于實(shí)際監(jiān)管中[8]。但是由于食品樣本成分復(fù)雜，基質(zhì)組成較多，導(dǎo)致免疫磁珠分離技術(shù)在應(yīng)用上受到限制，因此在未來的發(fā)展中，制備免疫磁珠富集體系環(huán)境、選擇適合的增菌培養(yǎng)基和制備高性能的免疫磁珠是將來主要的發(fā)展方向。

2.2.3 雙功能抗體檢測(cè)技術(shù)

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要依靠于抗體的特異性，開發(fā)一種新型抗體同時(shí)識(shí)別兩個(gè)不同的抗原，必然可以提高檢測(cè)的效率。在這種設(shè)想下，雙功能抗體檢測(cè)技術(shù)在2014年被應(yīng)用于單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)，該方法不需要進(jìn)行培養(yǎng)，并且檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到102cfu/mL～103cfu/mL[9]。以可以檢測(cè)李斯特菌的雙功能抗體為例，簡(jiǎn)單介紹其設(shè)計(jì)原理，研究者首先需要分別制備識(shí)別單核增生李斯特菌和紅細(xì)胞的特異性抗體，之后進(jìn)行均勻混合，利用氧化作用，是兩種抗體間形成可連接的二硫鍵，然后再通過還原反應(yīng)提高混合抗體的二硫鍵組合效率，最終得到一種同時(shí)可以識(shí)別單核細(xì)胞增生李斯特菌和紅細(xì)胞的雙功能抗體。這種雙功能抗體在應(yīng)用過程中與普通抗體一樣，可以直接加入待測(cè)樣本中，20 min～30 min后既可以引起血紅細(xì)胞發(fā)生聚集，形成經(jīng)典的血凝現(xiàn)象，可直接食用肉眼觀察[9]。然而這種方法在使用上仍然存在諸多限制，而且在制備上效率仍然過低，但是由于這種方法不需要特定的檢測(cè)儀器，使用上具有靈活準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，仍有值得我們期待。

2.2.4 膠體金檢測(cè)技術(shù)

膠體金檢測(cè)技術(shù)是在ELISA檢測(cè)技術(shù)之后，已經(jīng)成型的一種免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)，這種技術(shù)根據(jù)抗原抗體翻譯，采用層析膜為反應(yīng)載體、膠體金為顯示信號(hào)，以檢測(cè)卡或檢測(cè)試紙條的形式保存。由于膠體金試紙條可以10 min獲得檢測(cè)結(jié)果，因此已經(jīng)成為主要的食品安全現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法。目前商品化的膠體金試紙條可以檢測(cè)結(jié)腸彎曲桿菌、李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7、蠟樣芽孢桿菌、軍團(tuán)菌等多種食源性病原菌[10]。

2.3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

分子生物學(xué)檢測(cè)方法是目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域檢測(cè)病原體主要的快速檢測(cè)手段，目前應(yīng)用于食源性病原菌的檢測(cè)方法包括：PCR檢測(cè)技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)，基因探針技術(shù)和生物芯片技術(shù)。

2.3.1 PCR檢測(cè)方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)稱為PCR，是最常用的分子生物學(xué)檢測(cè)手段，其與免疫學(xué)方法的特異性不同，PCR檢測(cè)的是食源性病原的特定基因片段。在實(shí)際工作中，PCR技術(shù)可以在2 h內(nèi)完成食源性病原菌的檢測(cè)，并且不需要進(jìn)行前期的增菌培養(yǎng)。但是在反應(yīng)體系中存在腐殖質(zhì)、金屬離子、高脂肪或高蛋白是，將會(huì)抑制PCR檢測(cè)的效率，因此常規(guī)檢測(cè)中，仍然需要通過增菌實(shí)驗(yàn)（小于3 h），提供檢測(cè)的靈敏性。

2.3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)（LAMP）是由日本榮研株式會(huì)社研發(fā)的一種基因擴(kuò)增技術(shù)。它依賴于一種特殊的DNA聚合酶，可以識(shí)別靶基因上的6個(gè)特定區(qū)域并進(jìn)行擴(kuò)增，因此LAMP技術(shù)具有恒溫?cái)U(kuò)增和特異性高的特點(diǎn)。通過加熱熒光染料（Eva Green、GelRed、溴化乙錠和SYBER Green），僅需在紫外燈下就能進(jìn)行結(jié)果觀察，不需要任何儀器。從2008年開始，研究者開始使用LAMP方法對(duì)食源性病原菌進(jìn)行檢測(cè)，建立了高于PCR方法20倍靈敏度的檢測(cè)方法。在2013年，我國(guó)研究者通過大規(guī)模的篩選工作，建立一種多重LAMP檢測(cè)技術(shù)，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的同時(shí)檢測(cè)。LAMP檢測(cè)技術(shù)要求設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單，非常適合我國(guó)國(guó)情，可以廣泛應(yīng)用在基層研究中，出于這一目的我國(guó)已經(jīng)建立多項(xiàng)LAMP技術(shù)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[9]。根據(jù)國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)，目前已經(jīng)有基于LAMP檢測(cè)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備上市，可以對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等多種病原菌進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.3 基因探針技術(shù)

基因探針是一段被特殊標(biāo)記的小段核酸，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，基因探針可以與目的基因發(fā)展特異性雜交，由于其被特殊標(biāo)記過，因此可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的基因的目的。對(duì)于基因探針的標(biāo)記方式發(fā)展快速，經(jīng)標(biāo)記過的探針表現(xiàn)出安全、準(zhǔn)確和直觀的特點(diǎn)。在實(shí)際工作中，基因探針對(duì)于食源性病原菌的rRNA序列特異性識(shí)別，并進(jìn)行高復(fù)制量擴(kuò)增，因此可以保持較高的靈敏度。

2.3.4 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)是基于基因探針技術(shù)發(fā)展而來的快速檢測(cè)方法，其原理是將特異性的基因探針固定在芯片上，對(duì)原始或富集后的樣本進(jìn)行雜交，最后通過信號(hào)接收的方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷。從原理上講，生物芯片技術(shù)具有基因探針和PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，但是在操作性和高通量上又優(yōu)于這兩種方法，因此一直是我國(guó)食品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)研究的熱點(diǎn)，如肉及肉制品中常見致病微生物檢測(cè)方法-生物芯片法（SN/T 2651-2010《肉及肉制品中常見致病菌檢測(cè)方法基因芯片法》）、食源性致病菌基因芯片鑒定方法（SN/T 1543-2005《食源性致病菌基因芯片鑒定方法》）很早被引入行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中[10]。目前適用于檢測(cè)的生物芯片共包括兩類，一種是基因芯片，另一種是基于熒光微球懸浮液相芯片。液相芯片通常被稱為懸浮芯片，是由于其所有反應(yīng)都是在懸浮液相中的微球表面進(jìn)行的。與基因芯片不同，懸浮芯片可以結(jié)合蛋白質(zhì)等多種生物分子，再通過生物親和反應(yīng)進(jìn)行吸附，克服傳統(tǒng)基因芯片的固相雜交缺點(diǎn)，顯著提高檢測(cè)效率。在食源性病原菌的檢測(cè)領(lǐng)域，已經(jīng)有針對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)試劑盒上市銷售，利用懸浮芯片進(jìn)行檢測(cè)已經(jīng)受到重視并開始研究。

3 食源性病原菌檢測(cè)面臨的挑戰(zhàn)與發(fā)展方向

3.1 食源性病原菌檢測(cè)面臨的困難

應(yīng)用于食品安全監(jiān)督領(lǐng)域的食源性病原菌檢測(cè)均屬于快速檢測(cè)，因此所面臨的困難遠(yuǎn)高于臨床病原菌檢測(cè)，具體是由于食品組成復(fù)雜，部分病原菌增菌技術(shù)費(fèi)時(shí)和檢測(cè)方法的局限性造成的。

3.1.1 食品組成復(fù)雜

食品的種類多樣，其組成基質(zhì)復(fù)雜，包括碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)等多種化學(xué)物質(zhì)，并以不同的物理形態(tài)存在，因此其中污染的細(xì)菌分布情況不規(guī)則。而且部分發(fā)酵食品，如酸奶等，自身含有正常微生物，雖然不影響健康，但是會(huì)干擾病原菌的檢測(cè)工作。

3.1.2 部分病原菌增菌技術(shù)費(fèi)時(shí)

雖然檢測(cè)方法多樣，可以顯著的縮短檢測(cè)時(shí)間，但是大部分方法仍然需要進(jìn)行增菌培養(yǎng)，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率。但是目前的局面是，采用的增菌技術(shù)通常不“快”，具有較高的依賴性。因此將來的研究將重點(diǎn)集中在增菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)上，一方面增加待檢測(cè)菌量，一方面去除食品中的干擾物質(zhì)。

3.1.3 檢測(cè)方法的局限性

快速檢測(cè)方法雖然較傳統(tǒng)檢測(cè)方法，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，并提高了檢測(cè)效率，但是仍然存在一定的局限性。首先，一些死亡的病原菌在食品中不可繁殖，但是通過免疫學(xué)或者分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)仍然可以檢測(cè)到；其次，一部分病原菌通過分泌毒素發(fā)揮毒力，而通過檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量的方法無法判斷污染這種細(xì)菌對(duì)食品安全的影響；最后，如果病原菌出現(xiàn)基因突變或基因缺失現(xiàn)象，導(dǎo)致檢測(cè)抗原或基因無法識(shí)別，最終導(dǎo)致檢測(cè)失敗。

3.2 食源性病原菌檢測(cè)技術(shù)發(fā)展方向

雖然食源性病原菌檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展困難較多，但是為保障人類的食品安全，將來仍然需要加大食源性病原菌的研發(fā)力度，開發(fā)出更快速、準(zhǔn)確和高效的檢測(cè)方法。

3.2.1 細(xì)菌的分離與富集方向

要克服檢測(cè)過程中發(fā)生的干擾顯著，提高病原菌的分離和富集效率是迫切需要的。如免疫磁珠技術(shù)的發(fā)展，可以對(duì)食品中分布的少量病原菌進(jìn)行聚集，不同增菌實(shí)驗(yàn)，就可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。最近提出的膜過濾法，較免疫磁珠法更為經(jīng)濟(jì)，也可以到達(dá)富集待測(cè)病原菌和去除干擾物質(zhì)的作用，并且操作更為簡(jiǎn)單，部分檢測(cè)已經(jīng)可以直接在膜上進(jìn)行。

3.2.2 多重檢測(cè)技術(shù)方向

食品可以被多種病原菌同時(shí)污染，而目前可進(jìn)行多重檢測(cè)的技術(shù)在實(shí)際工作中效果仍然難以令人滿意。對(duì)于大多數(shù)的食源性病原菌檢測(cè)方法來說，一次檢測(cè)只能針對(duì)一種病原菌，如果檢測(cè)對(duì)象較多，將會(huì)形成大量的重復(fù)工作。目前僅懸浮芯片可以實(shí)現(xiàn)這一目的，相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)，懸浮芯片檢測(cè)方式更靈活，但在實(shí)際應(yīng)用中仍然有較多問題需要完善。

3.2.3 定量檢測(cè)和快速檢測(cè)的認(rèn)證與評(píng)估

目前對(duì)于快速檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)仍然有一定難度，僅能保證檢測(cè)結(jié)果為半定量或相對(duì)定量。然而實(shí)現(xiàn)食源性病原菌快速定量檢測(cè)對(duì)食品中病原菌的限量標(biāo)準(zhǔn)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義，因此將來的工作需要提高快速定量檢測(cè)的研發(fā)。

4 總結(jié)

對(duì)于食源性病原菌的研究，應(yīng)重點(diǎn)建設(shè)完善的病原菌類型以及毒力因子監(jiān)督和溯源機(jī)制，并根據(jù)食源性病原菌的發(fā)展、流行和傳播模式，努力尋找更高效的食源性病原菌控制技術(shù)，為我國(guó)食品安全監(jiān)督事業(yè)提供準(zhǔn)確的理論和技術(shù)支持。

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Advances in Detection of Foodborne Pathogens in Food

ZHOU Wei，HU Liang-bin，LI Hong-bo，ZHANG Hao，MO Hai-zhen
（Food College，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，Henan，China）

The detection technology of foodborne pathogens was very important to maintain the food safety of our country.The current detection technology mainly included traditional culture and identification methods and rapid detection methods was based on immunology and molecular biology.In this paper，the technical characteristics and application of the above methods were reviewed，and the difficulties and research methods of foodborne pathogen detection technology were analyzed.

foodborne pathogens；detection technology；immunology；molecular biology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.048

2017-02-17

河南科技學(xué)院教育教學(xué)改革研究項(xiàng)目（2016ZD15）；河南科技學(xué)院研究生教育教學(xué)改革研究項(xiàng)目（YJG2014YB03）

周威（1981—），男（漢），講師，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向：食源性病原微生物的控制。