不同茶類中揮發(fā)性萜類化合物的對映異構(gòu)體

邵晨陽，呂海鵬，朱蔭，張悅，林智

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗室，杭州 310008；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

不同茶類中揮發(fā)性萜類化合物的對映異構(gòu)體

邵晨陽1,2，呂海鵬1，朱蔭1，張悅1，林智1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗室，杭州 310008；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

【目的】揮發(fā)性萜類化合物是茶葉香氣的重要成分，大多數(shù)具有手性結(jié)構(gòu)，存在香氣特性完全不同的對映異構(gòu)體。查明不同茶類中揮發(fā)性萜類化合物的立體構(gòu)型分布特征，為深入研究茶葉香氣的形成機(jī)理及提高茶葉的香氣品質(zhì)提供科學(xué)的理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎庙斂展滔辔⑤腿》ńY(jié)合手性氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，以Supelco β-DEX110為手性氣相色譜柱，以萜類化合物的不同手性異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品為定性和定量分析的依據(jù)，建立茶葉中揮發(fā)性萜類化合物的對映異構(gòu)體分析方法，并對代表性綠茶、紅茶、烏龍茶、白茶及黑茶樣品中萜類化合物的對映異構(gòu)體組成及含量進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】建立了9種萜類化合物的對映異構(gòu)體的檢測方法，發(fā)現(xiàn)所有茶樣中均能檢測到芳樟醇、芳樟醇氧化物B的對映異構(gòu)體：大部分茶樣中芳樟醇的主導(dǎo)構(gòu)型為S型，但英德紅茶、云南滇紅和印尼白茶中以罕見的R-(-)-芳樟醇為主；芳樟醇氧化物B在綠茶、紅茶、白茶及黑茶中的構(gòu)型完全一致，而部分烏龍茶（嶺頭單樅、文山包種）中該物質(zhì)的主導(dǎo)構(gòu)型與之相反。芳樟醇氧化物A在綠茶及黑茶中主導(dǎo)構(gòu)型一致，而在祁門紅茶、印度大吉嶺紅茶、水仙烏崠單樅及鐵觀音中構(gòu)型相反；芳樟醇氧化物C和D在所有茶樣中的構(gòu)型均保持一致，且大部分僅檢測到單一構(gòu)型。其他重要萜類化合物在茶樣中分布情況各異：α-蒎烯僅在正山小種紅茶中以高比例的S-(-)-α-蒎烯被檢測出；α-松油醇的主導(dǎo)構(gòu)型及對映異構(gòu)體過量值在不同種類的茶葉中各不相同；4-萜品醇在所有可測得的茶樣中均以R構(gòu)型為主導(dǎo)，且除六堡茶（黑茶）外，其他茶樣中均未檢測到S-(+)-4-萜品醇；α-紫羅蘭酮在除了綠茶以外的茶樣中均能被檢測到，且均以單一的R構(gòu)型存在。定量分析結(jié)果表明，芳樟醇在大部分茶樣中都具有最高的含量，平均含量白茶>紅茶>烏龍茶>綠茶>黑茶；芳樟醇氧化物B的含量在茶葉中往往僅次于芳樟醇，呈現(xiàn)紅茶>白茶>烏龍茶>黑茶>綠茶的規(guī)律性；而其他萜類化合物在茶樣中的含量普遍低于100 ng·g-1，且在不同茶類中含量分布迥異。【結(jié)論】明確了不同種類茶葉中 9種重要揮發(fā)性萜類化合物對映異構(gòu)體的變化情況，有助于從更深層次上了解茶葉香氣品質(zhì)的化學(xué)實(shí)質(zhì)，為今后茶葉香氣品質(zhì)調(diào)控、茶葉品種、產(chǎn)地判別以及質(zhì)量認(rèn)證等提供了新思路。

茶葉；揮發(fā)性萜類化合物；對映異構(gòu)體；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；對映異構(gòu)體過量值

0 引言

【研究意義】茶葉香氣是多種揮發(fā)性成分的混合物，其基本組成可以分為脂肪族、芳香族及揮發(fā)性萜類化合物3大類[1]。其中，揮發(fā)性萜類化合物常具有怡人的香氣，并具有較低的香氣閾值，故而對茶葉香氣品質(zhì)有著重要影響[2]。目前已鑒定出的茶葉中的揮發(fā)性萜類化合物已有上百種之多，其中含量較高的有芳樟醇（Linalool）、芳樟醇氧化物（Linalool oxide A、B、C、D）、橙花叔醇（Nerolidol）、α-紫羅蘭酮（α-Ionone）、α-松油醇（α-Terpineol）、α-蒎烯（α-Pinene）、檸檬烯（Limonene）、4-萜品醇（4-Terpineol）等。揮發(fā)性萜類化合物往往含有1個甚至多個手性碳原子，存在1對或多對對映異構(gòu)體（如呋喃型、吡喃型芳樟醇氧化物各有 2個手性中心，分別存在 2對對映異構(gòu)體），且同一萜類化合物對映異構(gòu)體的香氣特征、閾值甚至生物活性差異極大，以致活性可能明顯不同。如S-(+)-芳樟醇具有甜香、橙花香，香氣閾值為7.4 μg·L-1[3]，R-(-)-芳樟醇具有木香和類似薰衣草的香氣特征，香氣閾值為 0.8 μg·L-1[4]，且R-(-)-芳樟醇具有S-(+)-芳樟醇所不具備的鎮(zhèn)靜效果[5]；S-α-紫羅蘭酮具有類似木材的香氣，閾值為 20—40 μg·L-1，R-α-紫羅蘭酮具有紫羅蘭芬芳，閾值為 0.5—5 μg·L-1，它們的消旋體（即等量的對映異構(gòu)體構(gòu)成的不具備光學(xué)活性的混合物）則呈現(xiàn)強(qiáng)烈的甜花香氣味[6]；S-(-)-檸檬烯有似鮮花的清淡香氣，而R-(+)-檸檬烯則具有愉快的新鮮橙子香氣[7]。由此可見，揮發(fā)性萜類化合物的立體構(gòu)型對其香氣品質(zhì)的影響很大，其不同組成比例引發(fā)的致香效果也有所差異，而且這種差異極可能對茶葉香氣的形成產(chǎn)生重要影響。因此，研究茶葉中萜類化合物的對映異構(gòu)體具有重要的理論意義及顯著的應(yīng)用價值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】揮發(fā)性萜類化合物的對映異構(gòu)體分析在草莓[8]、咖啡[9]、葡萄[10]、蜂蜜[11]、覆盆子[12]及百香果萃取物[13]等食品中已被廣泛研究。大量研究結(jié)果表明揮發(fā)性萜類化合物對映異構(gòu)體間的比例值與植物品種、食品類別有著重要的聯(lián)系，目前手性分析技術(shù)已被應(yīng)用于植物的產(chǎn)地判別、風(fēng)味食品的真?zhèn)伪嫖龅阮I(lǐng)域[14-15]。此外，在極端的理化條件下（如強(qiáng)酸性介質(zhì)、高溫環(huán)境等），部分萜類化合物的對映異構(gòu)體會發(fā)生消旋化，如 R-(-)-芳樟醇在 pH＜4時光學(xué)純度明顯降低[16]，葡萄酒釀造過程中呋喃型芳樟醇氧化物會發(fā)生消旋化[10]等，所以食品原料的加工過程也可能對萜類化合物的立體構(gòu)型分布產(chǎn)生一定影響。雖然揮發(fā)性萜類化合物的對映異構(gòu)體研究在食品化學(xué)領(lǐng)域已取得重要進(jìn)展，但是在茶學(xué)領(lǐng)域卻至今未被系統(tǒng)研究，僅有少數(shù)芳樟醇及芳樟醇氧化物的對映異構(gòu)體研究報道[17-19]。筆者研究團(tuán)隊的前期工作表明[18-19]，芳樟醇的2種對映異構(gòu)體均存在于茶鮮葉及成品茶茶葉中，且不同種類茶葉中芳樟醇對映異構(gòu)體的組成有較大差異，甚至主導(dǎo)的立體構(gòu)型也不盡相同?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鑒于前期的研究結(jié)果，不同種類茶葉中存在的其他揮發(fā)性萜類化合物對映異構(gòu)體的種類、組成及含量等也可能存在較大差異，具有重要的研究價值。然而，由于茶葉香氣成分復(fù)雜繁多、化學(xué)性質(zhì)各異，導(dǎo)致萜類化合物與不同手性固定相間的作用力強(qiáng)弱不一，往往難以在一個手性氣相色譜體系中同時分離出多種揮發(fā)性萜類化合物的對映異構(gòu)體，因此，有必要開展相關(guān)研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用頂空固相微萃取法（Headspace Solid Phase Microextraction，HS-SPME）-手性氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）建立茶葉香氣中多種揮發(fā)性萜類化合物的對映異構(gòu)體分析方法，并查明不同種類茶葉中主要萜類化合物對映異構(gòu)體的含量分布情況，旨在從立體化學(xué)層面了解不同種類茶葉關(guān)鍵香氣成分的化學(xué)實(shí)質(zhì)，為今后茶葉香氣品質(zhì)調(diào)控、茶葉產(chǎn)地判別以及質(zhì)量認(rèn)證等提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點(diǎn)

試驗于 2015—2016年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所進(jìn)行。

1.2 試驗材料與儀器

茶葉樣品為各地市場采集，并通過《GB/T 23776—2009茶葉感官審評方法》篩選出 22個具有代表性香氣品質(zhì)的各類別茶樣，分別為：4個綠茶樣品：西湖龍井、安吉白茶、信陽毛尖、日照綠茶；6個紅茶樣品：正山小種、祁門紅茶、英德紅茶、云南滇紅、印度大吉嶺紅茶、錫蘭烏瓦紅茶；4個烏龍茶樣品：鐵觀音、嶺頭單樅、水仙烏崠單樅、文山包種；4個白茶樣品：壽眉、白牡丹、白毫銀針、印尼白茶；4個黑茶樣品：普洱餅茶、普洱散茶、六堡茶、茯磚茶。

揮發(fā)性萜類化合物標(biāo)準(zhǔn)品：(±)-芳樟醇、R-(-)-芳樟醇；芳樟醇氧化物（呋喃型，A、B混合體）、芳樟醇氧化物（吡喃型，C、D混合體）；(±)-4-萜品醇、R-(-)-4-萜品醇、S-(+)-4-萜品醇；(±)-α-松油醇、R-(+)-α-松油醇；(±)-α-蒎烯、R-(+)-α-蒎烯、S-(-)-α-蒎烯；(±)-α-紫羅蘭酮；以上試劑購自 J&K 百靈威公司（北京）或Sigima-Aldrich公司（上海）。

化學(xué)試劑：無水乙醚（色譜級，美國Tedia公司）；正己烷（色譜級，德國Meker公司），純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)）。

儀器：頂空固相微萃取收集裝置為自制密封萃取瓶（250 mL）；萃取裝置為手動 SPME手柄（美國Supelco公司）；萃取頭為50/30 μm聚二甲基硅烷-二乙烯基苯涂層纖維（DVB/CAR/PDMS）萃取頭（美國Supelco公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司）；PL202-L-電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，型號：Agilent 7890A-5975C（美國Agilent公司）；手性毛細(xì)管色譜柱 β-DEX110（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Supelco公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取樣品1.00 g至自制的250 mL頂空萃取瓶中，加入6.0 mL沸水沖泡，放入60℃水浴鍋平衡 5.0 min，然后插入裝有 DVB/CAR/ PDMS萃取頭（試驗前先將此萃取頭在GC-MS進(jìn)樣口250℃老化30 min）的手動SPME手柄在60℃水浴條件下頂空萃取，萃取時間為60 min，取出后立即插入GC-MS進(jìn)樣口中解吸附3.0 min，同時啟動儀器收集數(shù)據(jù)。每個茶樣均重復(fù)測試3次。

1.3.2 色譜分析條件 色譜柱選用β-DEX110；進(jìn)樣口溫度為250℃；分流進(jìn)樣，分流比為10﹕1，載氣為高純度氦氣，純度≥99.99%；柱箱溫度采用程序升溫：50℃保持2 min，然后以2℃·min-1升到150℃保持10 min，再以4℃·min-1升到200℃保持5 min，流速為1.2 mL·min-1，進(jìn)樣量為1.0 μL（僅指標(biāo)準(zhǔn)品，茶樣全部為手動進(jìn)樣），總分析時間為79.5 min。

1.3.3 質(zhì)譜分析條件 電子轟擊離子源；電子能量-70 eV；傳輸線溫度 250℃；離子源溫度220℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 33—600 u[20]。

1.3.4 茶葉中揮發(fā)性萜類化合物對映異構(gòu)體的定性分析 首先根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間選定茶樣中揮發(fā)性萜類化合物大致的出峰時間范圍，再提取出在保留時間范圍內(nèi)與標(biāo)準(zhǔn)品具有相同特征離子的色譜峰，比對其與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜譜圖的相似度，相似度大于95%以上則最終鑒定為相應(yīng)萜類化合物對映異構(gòu)體在茶樣中的色譜峰。

1.3.5 茶葉中揮發(fā)性萜類化合物對映異構(gòu)體的定量分析 配置一系列濃度范圍的萜類化合物消旋體的乙醚溶液，根據(jù)氣相譜圖上相應(yīng)峰面積的比例關(guān)系（僅含一個手性碳原子的萜類化合物的 2個對映異構(gòu)體的峰面積基本均等；呋喃型或吡喃型芳樟醇氧化物因具有 2個手性碳原子，存在非對映異構(gòu)體，需計算 4個峰之間的比例）計算出各對映異構(gòu)體的相應(yīng)濃度，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得各萜類化合物對映異構(gòu)體濃度與峰面積的線性方程；茶樣中各萜類化合物對映異構(gòu)體的含量為色譜圖中相應(yīng)峰面積帶入線性方程計算后所得的數(shù)值。萜類化合物對映異構(gòu)體的比例組成采用有機(jī)立體化學(xué)中通用的對映異構(gòu)體過量值（enantiomeric excess，ee）來表達(dá)[21]，計算公式如下：ee (%) = [(A1-A2)/(A1+A2)]×100；式中：A1為萜類化合物某一種特定的對映異構(gòu)體的色譜峰面積，A2為另一對映異構(gòu)體的色譜峰面積；正負(fù)ee值代表了相反立體構(gòu)型的萜類化合物，ee值（絕對值）越高，代表A1對應(yīng)的該立體構(gòu)型的萜類化合物在茶樣中的比例也越高；當(dāng)ee=0時，代表兩種異構(gòu)體在茶樣中的比例相同，為消旋體；反之，當(dāng) ee= ±100%時，代表在茶樣中僅存在單一立體構(gòu)型的萜類化合物。

1.3.6 萜類化合物對映異構(gòu)體的回收率測定 選取在濃度線性范圍內(nèi)的兩個不同等級濃度的萜類化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別添加到代表性茶樣（若無特殊說明則為英德紅茶）中，對萜類化合物對映異構(gòu)體進(jìn)行回收率測定。回收率測定公式如下：Recovery(%)=[(加料茶樣中目標(biāo)物質(zhì)的濃度-茶葉中目標(biāo)物質(zhì)的濃度)/添加的萜類化合物標(biāo)準(zhǔn)品濃度]×100。重復(fù)測量3次，取平均值并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用Excel 2010（美國微軟公司）進(jìn)行RSD計算。用Excel 2010（美國微軟公司）或OriginPro 9.0（美國OriginLab公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，繪制相關(guān)譜圖及柱狀圖?；瘜W(xué)方程式采用ChemBio Ultra 14.0（美國CambridgeSoft公司）繪制。

2 結(jié)果

2.1 茶葉中揮發(fā)性萜類化合物對映異構(gòu)體分析方法

2.1.1 茶葉中 9種揮發(fā)性萜類化合物對映異構(gòu)體的分離 收集文獻(xiàn)中已報道的茶葉中常見的 10余種揮發(fā)性萜類化合物的各構(gòu)型及混合構(gòu)型標(biāo)準(zhǔn)品，分別將10.0 μL (±)-萜類化合物加至10 mL容量瓶中，并用無水乙醚稀釋至10 mL，振蕩混勻后存放于-20℃冰箱靜置待用。取1.0 μL的(±)-萜類化合物的乙醚稀釋液分別進(jìn)行手性GC-MS分析，試驗結(jié)果表明芳樟醇、芳樟醇氧化物（A—D）、α-蒎烯、α-松油醇、4-萜品醇及α-紫羅蘭酮等9對手性異構(gòu)體可被β-DEX110成功分離，且分離效果理想。將可分離的9種(±)-萜類化合物的乙醚稀釋液等量混合并進(jìn)行手性 GC-MS分析，發(fā)現(xiàn)18個色譜峰之間均呈現(xiàn)較好的分離度，無峰重疊現(xiàn)象（圖1），說明該手性分析方法具有較強(qiáng)的可行性。

選取英德紅茶為代表性茶樣，采用HS-SPME提取茶葉香氣成分，并在相同的GC-MS分析條件下對香氣成分進(jìn)行分析，獲得的總離子流圖如圖2-A所示。通過1.3.4的鑒定手段，在英德紅茶樣品中共可檢測到芳樟醇（linalool，提取的特征峰離子：71、93、121、55、136，圖2-B）、芳樟醇氧化物A、B（linalool oxides A、B，提取的特征峰離子：59、68、94、111，圖2-C）、4-萜品醇（4-Terpineol，提取的特征峰離子：71、93、111、136、154，圖2-D）、芳樟醇氧化物C、D（linalool oxides C、D，提取的特征峰離子：68、59、94、81、109，圖2-E）及α-紫羅蘭酮（α-ionone，提取的特征峰離子：121、93、136、192，圖2-F）等萜類化合物的1—2個對映異構(gòu)體（具體分布情況見圖2-A），其中芳樟醇的含量遠(yuǎn)高于其他萜類化合物，而α-蒎烯及α-松油醇對映異構(gòu)體未被檢測出，猜測可能是由于上述化合物在英德紅茶香氣成分中含量過低、未達(dá)到其檢測限所致。

2.1.2 9種揮發(fā)性萜類化合物對映異構(gòu)體的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制、最低檢測限、定量限及回收率測定 為了精確定量，對一系列濃度梯度的(±)-萜類化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行手性GC-MS分析，并繪制了色譜峰面積與萜類化合物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表1所示，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線在極廣的濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（correlation coefficient，R2）基本高于 0.9990，很好地驗證了分析方法的精確性和操作的準(zhǔn)確性。此外，為了確保定量結(jié)果在可靠的檢測濃度之內(nèi)，考察了各萜類化合物對映異構(gòu)體的最低檢測限（limit of determination，LOD）及最低定量限（limit of quantitation，LOQ）。結(jié)果表明，各萜類化合物對映異構(gòu)體的LOD及LOQ在數(shù)量級上無明顯差異，均可低至ng·g-1級別，其中LOD介于1.27—4.86 ng·g-1，LOQ介于4.24—15.35 ng·g-1，充分說明該儀器的靈敏度較為理想。

圖1 混合萜類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖Fig. 1 The total ion chromatorgraphy of the mixture of terpenoid standards

圖2 A) 英德紅茶香氣成分的總離子流圖; B-F) 各萜類化合物（B：芳樟醇，C：芳樟醇氧化物A、B，D：4-萜品醇，E：芳樟醇氧化物C、D，F(xiàn)：α-紫羅蘭酮）的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜結(jié)構(gòu)圖（左）及在茶樣中的特征峰離子提取圖（右）Fig. 2 A) The total ion chromatography of aroma components in Yingde black tea; B-F) mass spectra of the authentic standards (the corresponding figure in the left) and the corresponding ion chromatography after extracting the ion characteristic peaks (the corresponding figure in the right) of each terpenoid enantiomer (B: linalool; C: linalool oxides A and B; D: 4-terpineol; E: linalool oxides C and D; F: α-ionone)

為了進(jìn)一步驗證該分析方法的可靠性，對各萜類化合物的回收率進(jìn)行測定（參考1.3.6方法）。如表2所示，在茶樣中添加了較高濃度的萜類化合物對映異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品后，所計算出的加標(biāo)回收率介于83.91%—99.20%，RSD值介于8.81%—14.31%；添加了較低濃度的萜類化合物標(biāo)準(zhǔn)品后，加標(biāo)回收率介于 79.85%—99.78%，RSD值介于 8.53%—15.28%。以上結(jié)果充分表明了分析方法具有較強(qiáng)可靠性。

表1 萜類化合物的線性濃度范圍、檢測限與定量限Table 1 Linear ranges of concentration and limits of detection and quantitation of terpenoids

2.2 不同種類茶葉中揮發(fā)性萜類化合物對映異構(gòu)體的定性定量分析

為查明揮發(fā)性萜類化合物的立體構(gòu)型及含量的分布特征與茶葉種類、產(chǎn)地等因素之間的聯(lián)系，對不同種類的代表性名優(yōu)茶的香氣成分進(jìn)行分析，分析結(jié)果如表3、4所示。試驗結(jié)果表明，所有可分離的萜類化合物對映異構(gòu)體均可在不同茶葉樣品中被檢測出，且主導(dǎo)立體構(gòu)型與含量在茶樣之間差異較大。每次樣品分析均重復(fù)3次以上，獲得的試驗結(jié)果RSD介于1%—25%，較好地驗證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2.1 代表性綠茶樣品中揮發(fā)性萜類化合物對映異構(gòu)體的定性定量分析 選定4個代表性的中國名優(yōu)綠茶作為研究對象，其代表性茶樣總離子流圖（西湖龍井）及可測得萜類化合物對映異構(gòu)體如圖3所示。所有綠茶樣品中均可以檢測到芳樟醇、芳樟醇氧化物B及芳樟醇氧化物D對映異構(gòu)體：芳樟醇在所有樣品中均以S構(gòu)型為主，ee值介于4.4%—85.7%：其中安吉白茶中R-(-)-芳樟醇的比例最高（4.4% ee），幾乎與S-(+)-芳樟醇比例相當(dāng)；而信陽毛尖（85.7% ee）和日照綠茶（84.3% ee）中S-(+)-芳樟醇比例較高且ee值十分接近（表3）。芳樟醇氧化物B和芳樟醇氧化物D在茶樣中均以同樣的單一構(gòu)型存在，但芳樟醇氧化物D的含量均較低，僅能檢測到色譜峰，而無法定量。在西湖龍井中可檢測出單一構(gòu)型的芳樟醇氧化物A及芳樟醇氧化物C，但由于含量過低，未達(dá)到檢測限；安吉白茶中可檢測到單一構(gòu)型的芳樟醇氧化物A，其構(gòu)型與西湖龍井中的一致，含量同樣未達(dá)到檢測限（表4）。南方綠茶和北方綠茶在萜類化合物的含量上具有較明顯的區(qū)別，南方綠茶中芳樟醇和芳樟醇氧化物B的含量均遠(yuǎn)高于北方綠茶，推測南、北方茶樹不同的生長環(huán)境、栽培品種與加工工藝等[2,22]可能是導(dǎo)致南、北方綠茶品質(zhì)特征差異形成的重要因素，后續(xù)工作將擴(kuò)大樣本量并深入研究。

表2 萜類化合物對映異構(gòu)體的回收率及RSD值（%）測定Table 2 Recoveries and RSDs (%) of terpenoid enantiomers

圖3 西湖龍井茶香氣成分的總離子流圖Fig. 3 The total ion chromatorgraphy of aroma components in Xihu Longjing tea

表3 茶葉中萜類物質(zhì)的含量及其對映異構(gòu)體組成Table 3 The contents of terpenoids and the compositions of their enantiomers in tea aroma

表4 茶葉中芳樟醇氧化物A—D的含量及其對映異構(gòu)體組成Table 4 The contents of linalool oxides A-D and the compositions of their enantiomers in tea aroma

2.2.2 代表性紅茶樣品中揮發(fā)性萜類化合物對映異構(gòu)體的定性定量分析 選定世界3大紅茶及中國名優(yōu)紅茶為研究對象，檢測結(jié)果如表3、4所示。所有紅茶樣品均可以檢測到芳樟醇、芳樟醇氧化物B及α-紫羅蘭酮：英德紅茶及滇紅中的芳樟醇以罕見的R構(gòu)型為主，且ee值相近（-54.5%，-51.3%），其他紅茶樣品中以S-(+)-芳樟醇為主（4.2%—82.3% ee），其中祁門紅茶 S-(+)-芳樟醇比例最高，錫蘭烏瓦紅茶中 S-(+)-芳樟醇與 R-(-)-芳樟醇的含量接近；芳樟醇氧化物 B（26.5%—79.8% ee）及α-紫羅蘭酮（100% ee）在所有茶樣中的主導(dǎo)構(gòu)型均一致。其他可分離的萜類化合物對映異構(gòu)體均可在不同紅茶樣品中被檢測到：正山小種是唯一能檢測到α-蒎烯兩種對映異構(gòu)體的紅茶樣品，且以S構(gòu)型為主；芳樟醇氧化物A在除錫蘭烏瓦紅茶以外的紅茶樣品中均以較高含量被檢測出，但主導(dǎo)立體構(gòu)型各不相同，祁門紅茶及印度大吉嶺紅茶中的主導(dǎo)構(gòu)型與正山小種、英德紅茶及滇紅中的構(gòu)型相反；芳樟醇氧化物C可在祁門紅茶及英德紅茶中被檢測出，且以同樣的單一立體構(gòu)型存在；芳樟醇氧化物D可在大部分紅茶樣品中以一致的單一或主要構(gòu)型被檢測出；祁門紅茶、印度大吉嶺紅茶及滇紅中可檢測到 α-松油醇的兩種對映異構(gòu)體，其中祁門紅茶中 α-松油醇以S構(gòu)型為主，而其他兩種紅茶中α-松油醇以R構(gòu)型為主；此外，祁門紅茶、英德紅茶及滇紅樣品中還可檢測到R-(-)-4-萜品醇。

在含量分布上，芳樟醇的含量在所有茶樣中均最高，芳樟醇氧化物B次之，而α-紫羅蘭酮的含量最低，僅在其定性限及定量限范圍內(nèi)浮動。如圖4所示，大葉種的英德紅茶和云南滇紅中芳樟醇的含量均達(dá)到了μg級以上，而小葉種的正山小種及祁門紅茶的芳樟醇含量相近，遠(yuǎn)低于前兩者；芳樟醇氧化物B的含量在印度大吉嶺紅茶及祁門紅茶中最高，英德紅茶次之，而云南滇紅及正山小種中該物質(zhì)含量并不顯著，錫蘭烏瓦紅茶中其含量最低。長期的茶葉審評實(shí)踐表明，大葉種紅茶香氣高、獨(dú)特、香型單一，而小葉種香氣細(xì)幽、香型豐富[23]，結(jié)合本試驗結(jié)果，推測芳樟醇的含量及主導(dǎo)構(gòu)型可能與紅茶的香氣品質(zhì)密切相關(guān)：低閾值（0.8 μg·L-1）、極高含量的木香及薰衣草香型的R-(-)-芳樟醇致使大葉種紅茶的香氣濃烈高長且獨(dú)特[4]；而小葉種紅茶中甜香、花香型的S-(+)-芳樟醇雖含量高，但閾值也相對更高（7.4 μg·L-1）[3]，與其他香氣活性成分的香氣互作效應(yīng)可能更加顯著，致使茶葉的香氣特征細(xì)幽、清爽且香型豐富。此外，其他萜類化合物的立體構(gòu)型及含量組成也可能與紅茶不同香氣特征的形成密切相關(guān)，尚有待進(jìn)一步研究。

圖4 紅茶中芳樟醇及芳樟醇氧化物B的含量變化情況Fig. 4 The content variations of linalool and linalool oxide B in black teas

2.2.3 代表性烏龍茶樣品中揮發(fā)性萜類化合物對映異構(gòu)體的定性定量分析 選取4個不同產(chǎn)地的代表性烏龍茶為研究對象。手性分析結(jié)果表明（表3、4），所有烏龍茶樣中均可檢測到的萜類化合物有芳樟醇、芳樟醇氧化物B及α-紫羅蘭酮：芳樟醇的兩種異構(gòu)體在所有茶樣中均可被檢測到，且主導(dǎo)構(gòu)型均為S構(gòu)型（31.2%—61.3% ee），其中嶺頭單樅中S-(+)-芳樟醇比例最高；芳樟醇氧化物B的兩種異構(gòu)體也可被同時檢測出，但不同茶樣中主導(dǎo)構(gòu)型不一，嶺頭單樅和文山包種的主導(dǎo)構(gòu)型一致，水仙烏崠單樅與鐵觀音構(gòu)型一致；α-紫羅蘭酮以單一構(gòu)型存在于所有茶樣中，且絕對構(gòu)型均一致。芳樟醇氧化物A在水仙烏崠單樅與鐵觀音中構(gòu)型一致，在其余兩個茶樣中未被檢測出。芳樟醇氧化物C和D均只在嶺頭單樅中被檢測出，且以單一構(gòu)型存在。α-松油醇在嶺頭單樅、水仙烏崠單樅和鐵觀音中可被檢測出，但主導(dǎo)構(gòu)型不一：嶺頭單樅中僅存在 S-(+)-α-松油醇；水仙烏崠單樅中以S-(+)-α-松油醇為主導(dǎo)構(gòu)型，但R-(+)-α-松油醇的比例也較高（5.2% ee）；鐵觀音中以R-(+)-α-松油醇為主導(dǎo)構(gòu)型（-11.7% ee）。α-蒎烯及4-萜品醇在所有烏龍茶茶樣中均未被檢測出。

定量分析結(jié)果表明，芳樟醇及芳樟醇氧化物A、B具有較顯著的含量，4-萜品醇及α-紫羅蘭酮的含量僅接近定量限或定性限，而芳樟醇氧化物D的含量最低，未達(dá)到定性限（圖 5）。嶺頭單樅中含有的萜類化合物最多且總含量最高，尤其是芳樟醇的含量遠(yuǎn)高于其他茶類，芳樟醇氧化物B的含量也較為顯著。水仙烏崠單樅中所含的萜類化合物總含量最低，推測其香氣品質(zhì)的形成與其他香氣活性化合物有更緊密的聯(lián)系。鐵觀音中芳樟醇氧化物A具有最高含量，芳樟醇及芳樟醇氧化物B的含量也具有較高的含量，推測以上3種化合物對鐵觀音香氣的形成具有重要影響。文山包種中芳樟醇的含量遠(yuǎn)高于其他萜類化合物，推測S-(+)-芳樟醇對該茶葉清香幽雅似花香的香氣品質(zhì)具有直接的促進(jìn)作用。

圖5 烏龍茶中各萜類化合物的含量變化情況Fig. 5 The content variations of terpenoids in oolong teas

2.2.4 代表性白茶樣品中揮發(fā)性萜類化合物對映異構(gòu)體的定性定量分析 選取代表性中國白茶及香氣品質(zhì)濃烈似甘草香的印尼白茶為研究對象。手性分析結(jié)果表明（表3、4），白毫銀針、白牡丹及壽眉中可測得的萜類化合物的主導(dǎo)構(gòu)型一致，而印尼白茶則在萜類化合物的手性分布上有一定差異。所有茶樣中均可檢測到芳樟醇、芳樟醇氧化物B及α-紫羅蘭酮：白毫銀針、白牡丹及壽眉中芳樟醇中S構(gòu)型的比例極高，ee值介于 89.8%—96.7%；反之，印尼白茶中芳樟醇主要以高比例的R構(gòu)型為主（-87.6% ee），與中國白茶呈現(xiàn)巨大的差異；芳樟醇氧化物B在所有茶樣中的主導(dǎo)構(gòu)型一致，ee值介于39.3%—60.7%；α-紫羅蘭酮在所有茶樣中均以單一構(gòu)型存在。芳樟醇氧化物A僅在印尼白茶中被檢測到，兩種立體構(gòu)型存在的比例差異較小（11.0% ee）。芳樟醇氧化物C在壽眉及白牡丹中以單一構(gòu)型存在，而芳樟醇氧化物D可在壽眉、白牡丹及印尼白茶中以一致的單一或主要構(gòu)型被檢測到。α-松油醇的兩種對映異構(gòu)體均可在白毫銀針及印尼白茶中被檢測出，白毫銀針中以S構(gòu)型為主（49.5% ee），印尼白茶以R構(gòu)型為主（-42.7% ee）。4-萜品醇僅在印尼白茶中以極低的含量被檢測出，且僅存在R-(-)-4-萜品醇。此外，所有白茶樣品中均未檢測到α-蒎烯。分析結(jié)果表明，中國白茶中萜類化合物的手性構(gòu)型分布較為相似，其中白牡丹及壽眉中萜類化合物的主導(dǎo)構(gòu)型不僅完全一致，且對映異構(gòu)體的比例相近，而白毫銀針中可檢測到的萜類化合物相對較少，推測可能與白茶的原料鮮葉采摘標(biāo)準(zhǔn)差異相關(guān)：白毫銀針為單芽茶，化學(xué)成分相對單一，而白牡丹與壽眉為葉茶，所含化學(xué)物質(zhì)更加豐富。印尼白茶與中國白茶中萜類化合物的手性構(gòu)型分布差異主要體現(xiàn)在芳樟醇與α-松油醇的主導(dǎo)構(gòu)型上，低閾值而高含量的 R-(-)-芳樟醇可能是導(dǎo)致印尼白茶香氣濃烈而特殊的主要原因。

在含量分布上，白牡丹、白毫銀針及印尼白茶中芳樟醇的含量可達(dá) μg級以上。在中國白茶中，芳樟醇的含量隨著白茶香氣品質(zhì)的提升而逐漸提升，在白毫銀針達(dá)到最高含量，然而印尼白茶中芳樟醇的含量更甚，是白毫銀針中的兩倍，說明芳樟醇對白茶香氣品質(zhì)的形成具有至關(guān)重要的影響。中國白茶中芳樟醇氧化物B的含量也較高，且含量相近；印尼白茶中芳樟醇氧化物B的含量略低于中國白茶，其含量僅次于芳樟醇。其他萜類化合物在不同白茶中的含量分布如圖 6所示，含量最高的萜類化合物為芳樟醇氧化物 A，在印尼白茶中被檢測到；而芳樟醇氧化物D及α-松油醇在部分白茶中也有較高的含量，前者在壽眉及白牡丹中含量較高，而 α-松油醇含量在白毫銀針及印尼白茶中較高；芳樟醇氧化物C、4-萜品醇及α-紫羅蘭酮的含量差異不大，僅略高于定量限或定性限，但由于萜類化合物往往具有較低的香氣閾值，所以對白茶香氣品質(zhì)的形成也具有一定影響。

圖6 白茶中各萜類化合物的含量變化情況Fig. 6 The content variations of terpenoids in white teas

2.2.5 代表性黑茶樣品中揮發(fā)性萜類化合物對映異構(gòu)體的定性定量分析 黑茶因其在原料選用、加工工藝（發(fā)酵發(fā)花）等方面有別于其他茶，從而導(dǎo)致生化成分的組成和比例與其他茶類有較大差異[24]。手性分析結(jié)果表明（表3、4），所有茶樣中均可以檢測到的手性萜類化合物有：芳樟醇、芳樟醇氧化物B及α-紫羅蘭酮。芳樟醇在所有茶樣中均以S-構(gòu)型為主，但普洱茶（餅茶、散茶）及六堡茶中 R-構(gòu)型占有較大比例（6.7%—12.9% ee），反之茯磚茶中S-(+)-芳樟醇比例較高（67.6% ee）；芳樟醇氧化物B在所有茶樣中的主導(dǎo)構(gòu)型也基本一致，ee值較為相近，介于27.2%—38.9%；與其他茶類類似，α-紫羅蘭酮在所有茶樣中均以單一構(gòu)型存在。芳樟醇氧化物 A在茯磚茶中未被檢測出，在六堡茶里以極微量的單一構(gòu)型存在（100% ee），在兩個普洱茶樣品中 ee值較為接近，且兩種對映異構(gòu)體比例差異不大（10.7%，7.1% ee）。芳樟醇氧化物D在普洱茶及六堡茶中均以單一構(gòu)型被檢測出，且構(gòu)型保持一致。α-松油醇在各茶樣中構(gòu)型比例差異懸殊，在普洱餅茶中以單一S構(gòu)型存在，在普洱散茶及六堡茶中以R構(gòu)型為主導(dǎo)構(gòu)型，其中六堡茶中 S構(gòu)型比例較高（-4.6% ee）；此外，在茯磚茶中未檢測到α-松油醇對映異構(gòu)體。4-萜品醇僅在六堡茶中被檢測到，且以S-構(gòu)型為主。α-蒎烯及芳樟醇氧化物 C中在所有茶樣中均未被檢測到。

在含量分布上，如圖7所示，與其他茶類差異較大的是，黑茶中芳樟醇的含量普遍處于較低的水平，尤其是在普洱茶中，芳樟醇的含量僅介于定性限與定量限之間，而六堡茶和茯磚茶中芳樟醇的含量雖略高于其他萜類化合物，但也不超過30 ng·g-1。芳樟醇氧化物B在所有茶樣中均具有較高含量，其中普洱散茶中芳樟醇氧化物B含量最高。α-松油醇在普洱散茶和六堡茶中具有較高且相近的含量。芳樟醇氧化物A及D在普洱茶中含量相對較高，而其他茶類中幾乎無法被檢測到。此外，相比其他萜類化合物，4-萜品醇及α-紫羅蘭酮在茶樣中的含量普遍較低，均低于 10 ng·g-1。分析結(jié)果表明：不同種類的黑茶中萜類化合物的手性分布及含量上差異較大，甚至普洱散茶與餅茶之間也有極大的差別，這可能與黑茶特有的后發(fā)酵工藝有關(guān)，具體的影響情況有待進(jìn)一步研究。

圖7 黑茶中各萜類化合物的含量變化Fig. 7 The content variations of terpenoids in dark teas

2.2.6 不同茶類間揮發(fā)性萜類物化合物的立體構(gòu)型分布異同性分析 試驗結(jié)果充分表明（表3、4），不同茶類間揮發(fā)性萜類化合物的立體構(gòu)型分布迥異。所有茶樣中均能檢測到芳樟醇、芳樟醇氧化物B的對映異構(gòu)體：大部分茶類中芳樟醇的主導(dǎo)構(gòu)型為S型，但英德紅茶、云南滇紅及印尼白茶以罕見的 R-(-)-芳樟醇為主，推測可能與茶葉的品種、產(chǎn)地有一定關(guān)系，值得深入研究；芳樟醇氧化物B在綠茶、紅茶、白茶及黑茶中的構(gòu)型完全一致，且ee值（平均值）：綠茶（100% ee）>紅茶（56.4% ee）>白茶（51.3% ee）>黑茶（32.6% ee），而非同一產(chǎn)地的烏龍茶（嶺頭單樅、文山包種）中該物質(zhì)的主導(dǎo)構(gòu)型與其他茶樣相反，說明芳樟醇氧化物B的手性分布可能與產(chǎn)地的聯(lián)系不大。α-蒎烯是檢出率最低的萜類化合物，僅在紅茶（正山小種）中被檢測到，其主導(dǎo)構(gòu)型為S。芳樟醇氧化物A在綠茶及黑茶中構(gòu)型一致，而在部分紅茶、烏龍茶中構(gòu)型相反，說明其構(gòu)型比例與茶樣類別有一定關(guān)聯(lián)。芳樟醇氧化物C和D在所有類別的茶樣中的構(gòu)型均保持一致，且大部分僅檢測到單一構(gòu)型，為所有茶類中萜類化合物的手性分布共同點(diǎn)。α-松油醇在茶樣中的主導(dǎo)構(gòu)型及ee值在不同種類、不同產(chǎn)地的茶葉中各不相同，推測其主導(dǎo)構(gòu)型的形成與多方面因素相關(guān)。4-萜品醇在所有可測得的茶樣中均以R構(gòu)型為主導(dǎo)，且除六堡茶之外，其他茶樣中均未檢測到S-(+)-4-萜品醇。α-紫羅蘭酮在除了綠茶以外的茶樣中均能被檢測到，且均以相同的單一構(gòu)型存在，然而，由于無市售的 α-紫羅蘭酮對映異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)品，所以無法通過標(biāo)準(zhǔn)品確定其構(gòu)型，但據(jù)文獻(xiàn)報道，通過與淚杉醇絕對構(gòu)型的比對可在紅茶的香氣成分中鑒定出 R-α-紫羅蘭酮[25]，結(jié)合本試驗結(jié)果，推測茶葉中存在的α-紫羅蘭酮應(yīng)為單一的R構(gòu)型，在本研究的后續(xù)工作中將通過合成標(biāo)準(zhǔn)品的方法對該結(jié)果進(jìn)行驗證。

2.2.7 不同茶類間揮發(fā)性萜類物化合物的含量分布差異性分析 不同茶類中揮發(fā)性萜類化合物的含量分布也有較大差異，芳樟醇在大部分茶樣中都具有最高的含量，其中平均含量白茶（1 677 ng·g-1）>紅茶（823.2 ng·g-1）>烏龍茶（104.4 ng·g-1）>綠茶（33.3 ng·g-1）>黑茶（10.9 ng·g-1），白茶與黑茶中芳樟醇的含量具有巨大的差異，猜測與茶類的加工工藝有密切關(guān)系：白茶萎凋過程是茶葉內(nèi)含物發(fā)生活躍變化的重要過程，有利于芳樟醇等萜烯類化合物的形成[26]；黑茶在后發(fā)酵過程中，有微生物參與，使茶葉內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)大量分解或轉(zhuǎn)化，從而使芳樟醇的含量降低[24]。本試驗中芳樟醇氧化物B的含量在茶葉中僅次于芳樟醇，各茶樣含量平均值紅茶（150.5 ng·g-1）>白茶（106.0 ng·g-1）>烏龍茶（25.4 ng·g-1）>黑茶（15.8 ng·g-1）>綠茶（8.4 ng·g-1），推測茶葉的萎凋和發(fā)酵過程可能對芳樟醇氧化物B的含量影響更為顯著；芳樟醇氧化物A在除綠茶以外的茶類中具有相對較高的含量，分布規(guī)律為：烏龍茶（40.2 ng·g-1）>紅茶（36.9 ng·g-1）>白茶（29.9 ng·g-1）>黑茶（6.0 ng·g-1）；紅茶、白茶及黑茶中芳樟醇氧化物D的含量較高，而烏龍茶中芳樟醇氧化物C的含量遠(yuǎn)高于芳樟醇氧化物D，推測可能與烏龍茶特有的做青過程有一定關(guān)系。其他揮發(fā)性萜類化合物在茶樣中的含量普遍較低，尤其在綠茶樣品中，幾乎無法被檢測出，推測是由于綠茶在高溫炒制過程中低沸點(diǎn)的萜類化合物會大量揮發(fā)而造成，而其他茶類加工過程中發(fā)酵或長時間的萎凋有利于揮發(fā)性萜類化合物的合成或轉(zhuǎn)化；α-松油醇及4-萜品醇在紅茶、白茶及黑茶中的含量差異不顯著，而在烏龍茶中含量偏低；α-紫羅蘭酮在除綠茶以外的茶樣中均可被檢測到，但含量在所有揮發(fā)性萜類化合物中最低，且茶樣間無明顯差異。

3 討論

正如引言所述，部分揮發(fā)性萜類化合物的對映異構(gòu)體在極端的理化條件下會發(fā)生消旋化現(xiàn)象，所以茶葉加工過程對萜類化合物的立體構(gòu)型分布也可能有一定影響。然而，筆者研究團(tuán)隊的前期研究表明，在紅茶的加工過程中，R及S型芳樟醇的含量變化趨勢基本保持一致[19]；且來自食品其他領(lǐng)域的研究也表明在溫和的pH條件及一定的溫度范圍內(nèi)，萜類化合物對映異構(gòu)體較少會發(fā)生相互轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[27-28]。因此，初步推測在茶葉的加工過程中，雖然萜類化合物對映異構(gòu)體的含量會隨著加工進(jìn)程的推進(jìn)而發(fā)生明顯變化，但其立體構(gòu)型發(fā)生相互轉(zhuǎn)化的可能性相對較小。鑒于茶葉加工過程中發(fā)生的生化反應(yīng)繁多且復(fù)雜，環(huán)境因素（如溫度、水分、pH等）多樣化，且萜類化合物的穩(wěn)定性也不盡相同，故具體影響情況還有待深入研究。

在含量分布上，芳樟醇氧化物在大部分茶葉中的含量往往僅次于芳樟醇，它們的形成與茶葉的加工過程有著緊密聯(lián)系。芳樟醇氧化物主要由茶鮮葉中以糖苷形式存在的結(jié)合態(tài)香氣化合物在β-葡萄糖苷酶及β-櫻草糖苷酶等水解酶的催化作用下水解形成（圖 8-A）[29]：殺青過程中溫度的升高、萎調(diào)過程中由于失水和呼吸作用導(dǎo)致的鮮葉細(xì)胞增透性增大，以及做青過程中鮮葉碰撞導(dǎo)致的細(xì)胞組織機(jī)械損傷，均會使水解酶的活性增強(qiáng)，從而使芳樟醇氧化物從糖苷結(jié)合態(tài)逐漸游離出；在茶葉揉捻及發(fā)酵階段，在外力作用的推動下，茶葉組織及細(xì)胞得到充分破碎，使酶和糖苷態(tài)化合物更好地結(jié)合在一起，從而生成了大量游離態(tài)的芳樟醇氧化物[2,30]。此外，也有報道表明，芳樟醇氧化物可能部分來源于芳樟醇的氧化作用（圖 8-B）：芳樟醇在加工過程中首先被氧化為環(huán)氧化物中間體，經(jīng)過重排反應(yīng)（中間體的C3-羥基與C-6或C-7形成醚鍵）形成呋喃型芳樟醇氧化物（A、B）以及吡喃型芳樟醇氧化物（C、D）[31]。由于糖苷態(tài)化合物自身含量差異、轉(zhuǎn)化反應(yīng)的化學(xué)選擇性及位阻效應(yīng)等因素[32]，茶葉中呋喃型芳樟醇氧化物的含量往往高于吡喃型氧化物，這與本試驗的分析結(jié)果較為吻合。其他萜類化合物在茶葉加工過程中亦有類似圖8-A的形成過程，此外，來自鮮葉中的其他化合物也會在加工過程中發(fā)生復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化形成具有宜人香氣的萜類化合物，也正是這些豐富的化學(xué)反應(yīng)對茶葉香氣的形成起著重要的推動作用[2]。

圖8 A)[29]芳樟醇氧化物糖苷前體的水解反應(yīng)；B)[32]芳樟醇的氧化、重排反應(yīng)Fig. 8 A) The hydrolysis reactions of glycoside precursors of linalool oxides; B) The oxidation and rearrangement reactions of linalool

此外，本研究中部分萜類化合物（如芳樟醇氧化物、α-紫羅蘭酮）的絕對構(gòu)型由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)品而無法確定，在后續(xù)工作中也將化學(xué)合成相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品，并結(jié)合各構(gòu)型的萜類化合物的香氣特征及閾值對其進(jìn)行深入分析，進(jìn)而明確揮發(fā)性萜類化合物對茶葉香氣的具體貢獻(xiàn)。

4 結(jié)論

采用HS-SPME技術(shù)結(jié)合手性GC-MS法首次建立了茶葉中9種常見揮發(fā)性萜類化合物對映異構(gòu)體的手性分析及定量分析方法，查明了不同種類的代表性茶樣中揮發(fā)性萜類化合物的對映異構(gòu)體組成及含量值。本研究從立體化學(xué)及精確定量層面上深入分析茶葉香氣的化學(xué)實(shí)質(zhì)，為今后茶葉香氣品質(zhì)調(diào)控、茶葉產(chǎn)地判別以及質(zhì)量認(rèn)證等奠定了科學(xué)理論基礎(chǔ)。然而，由于茶樣來源、類別不同，試驗結(jié)果未有明顯規(guī)律性，后續(xù)研究中將擴(kuò)大樣本量，針對特定的茶葉種類、不同茶樹品種及加工方式的茶葉進(jìn)行系統(tǒng)且深入的研究，以闡明萜類化合物對映異構(gòu)體的分布規(guī)律及形成轉(zhuǎn)化機(jī)理等。

[1] 張正竹, 施兆鵬, 宛曉春. 萜類物質(zhì)與茶葉香氣（綜述）. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2000, 27(1): 51-54.

ZHANG Z Z, SHI Z P, WAN X C. Terpenes and tea aroma (Summary). Journal of AnHui Agricultural University, 2000, 27(1): 51-54. (in Chinese)

[2] 宛曉春. 茶葉生物化學(xué). 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2003. WAN X C. Tea Biochemistry. Beijing: China Agriculture Press, 2003. (in Chinese)

[3] OHLOFF G, KLEIN E. Die absolute konfiguration des linalools durch verknüpfung mit dem pinansystem. Tetrahedron, 1962, 18(1): 37-42.

[4] PADRAYUTTAWAT A, YOSHIZAWA T, TAMURA H, TOKUNAGA T. Optical isomers and odor thresholds of volatile constituents in Citrus sudachi. Food Science and Technology International, 1997, 3(4): 402-408.

[5] KURODA K, INOUE N, ITO Y, KUBOTA K, SUGIMOTO A, KAKUDA T, FUSHIKI T. Sedative effects of the jasmine tea odor and(R)-(?)-linalool, one of its majorodor components, on autonomic nerve activity and mood states. European Journal of Applied Physiology, 2005, 95: 107-114.

[6] QUATTRINI F, BIRESSI, G, JUZA M, MAZZOTTI M, FUGANTIC C, MORBIDELLIA M. Enantiomer separation of α-ionone using gas chromatography with cyclodextrin derivatives as chiral stationary phases. Journal of Chromatography A, 1999, 865: 201-210.

[7] 王秀紅, 賈崇榮, 萬宏, 歐慶瑜. 多維氣相色譜用于手性對映體的分離. 分析化學(xué), 1993, 21(5): 495-499.

WANG X H, JIA C R, WAN H, Ou Q Y. Multidimensional gas chromatography for chiral separation of enantiomers. Analytical chemistry, 1993, 21(5): 495-499. (in Chinese)

[8] SCHIPILLITI L, DUGO P, BONACCORSI I, MONDELLO L. Headspace-solid phasemicroextraction coupled to gas chromatographycombustion-isotope ratio mass spectrometer and to enantioselective gas chromatography for strawberry flavoured food quality control. Journal of Chromatography A, 2011, 1218: 7481-7486.

[9] BONNL?NDER B, CAPPUCCIO R, LIVERANI F S, WINTERHALTER P. Analysis of enantiomeric linalool ratio in green and roasted coffee. Flavour and Fragrance Journal, 2006, 21(4): 637-641.

[10] LUANA F, MOSANDL A, GUBESCH M, WüSTM M. Enantioselective analysis of monoterpenes in different grape varieties during berry ripening using stir bar sorptive extraction- and solid phase extractionenantioselective-multidimensional gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2006, 1112: 369-374.

[11] ?PáNIK I, PA?ITNá A, ?I?KA B, SZOLCSáNYI P. The determination of botanical origin of honeys based on enantiomer distribution of chiral volatile organic compounds. Food Chemistry, 2014, 158: 497-503.

[12] WINTER M, SUNDT E. Recherches sur les arǒmes. 5e communication. Analyse de I'arǒme des framboises. I. Les constituants carbonylés volatils. Helvetica Chimica Acta, 1962, 45(6): 2195-2211.

[13] BICCHI C, D’AMATO A, RUBIOLO P. Cyclodextrin derivatives as chiral selectors for direct gas chromatographic separation of enantiomers in the essential oil, aroma and flavour fields. Journal of Chromatography A, 1999, 843: 99-121.

[14] MOSANDL A. Authenticity assessment: A permanent challenge in food flavor and essential oil analysis. Journal of Chromatographic Science, 2004, 42: 440-449.

[15] CAGLIERO C, BICCHI C, CORDERO C, RUBIOLO P, SGORBINI B, LIBERTO E. Fast headspace-enantioselective GC-mass spectrometricmultivariate statistical method for routine authentication of flavoured fruit foods. Food Chemistry, 2012, 132: 1071-1079.

[16] CASABIANCA H, GRAFF J B, FAUGIER V, FLEIG F, GRENIER C. Enantiomeric distribution studies of linalool and linalyl Acetate: a powerful tool for authenticity control of essential oils. Journal of High Resolution Chromatography, 1998, 21(2): 107-112.

[17] WANG D, ANDO K, MORITA K, KUBOTA K, KOBAYASHI A. Optical isomers of linalool and linalool oxides in tea aroma. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1994, 58(11): 2050-2053.

[18] 楊停, 朱蔭, 呂海鵬, 馬成英, 張悅, 施江, 劉爽, 林智. 茶葉香氣成分中芳樟醇旋光異構(gòu)體的分析. 茶葉科學(xué), 2015, 35(2): 137-144.

YANG T, ZHU Y, LV H P, MA C Y, SHI J, LIU S, LIN Z. Analysis of optical isomers of linalool in tea aromatic components. Tea Science, 2015, 35(2): 137-144. (in Chinese)

[19] YANG T, ZHU Y, SHAO C. Y, ZHANG Y, SHI J, LV H P, LIN Z. Enantiomeric analysis of linalool in teas using headspace solidphasemicroextraction with chiral gas chromatography. Industrial Crops and Products, 2016, 83: 17-23.

[20] 朱蔭, 楊停, 施江, 余方林, 戴偉東, 譚俊峰, 郭麗, 張悅, 彭群華,呂海鵬, 林智. 西湖龍井茶香氣成分的全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(20): 4120-4146.

ZHU Y, YANG T, SHI J, YU F L, DAI W D, TAN J F, GUO L, ZHANG Y, PENG Q H, LV H P, LIN Z. Analysis of aroma components in Xihu Longjing tea by comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(20): 4120-4146. (in Chinese)

[21] 尤田耙. 手性化合物的現(xiàn)代研究方法. 合肥: 中國科技大學(xué)出版社, 1993: 4.

YOU T B. Modern Methods of Chiral Compounds. Hefei: University of Science and Technology of China Press, 1993: 4. (in Chinese)

[22] 龍立梅, 宋沙沙, 李柰, 樊琛, 李小波, 曹學(xué)麗. 3種名優(yōu)綠茶特征香氣成分的比較及種類判別分析. 食品科學(xué), 2015, 36(2): 114-119.

LONG L M, SONG S S, LI N, FAN C, LI X B, CAO X L. Comparisons of characteristic aroma components and cultivar discriminant analysis of three varieties of famous green tea. Food Science, 2015, 36(2): 114-119. (in Chinese)

[23] 方維亞, 陳萍. 不同地區(qū)紅茶特異性香氣成分比較研究. 茶葉, 2014, 40(3): 138-145.

FANG W Y, CHEN P. A comparative study of specific areas of blacktea aroma components. Tea, 2014, 40(3): 138-145. (in Chinese)

[24] 何華鋒, 朱宏凱, 董春旺, 葉陽, 桂安輝, 高明珠. 黑茶香氣化學(xué)進(jìn)展. 茶葉科學(xué), 2015, 35(2): 121-129.

HE H F, ZHU H K, DONG C W, YE Y, GUI A H, GAO M Z. Progress of black tea aroma chemical. Tea Science, 2015, 35(2): 121-129. (in Chinese)

[25] BRICOUT J, VIANI R, MüGGLER-CHAVAN F, MARION J P, REYMOND D, EGLI R H. Sur la composition de l'ar?me de thé noir II. Helvetica Chimica Acta, 1967, 50: 1517-1522.

[26] 俞少娟, 李鑫磊, 王婷婷, 金心怡. 白茶香氣及萎凋工藝對其形成影響的研究進(jìn)展. 茶葉通訊, 2015, 42(4): 14-18.

YU S J, LI X L, WANG T T, JIN X Y. Advances white tea aroma and withering influence their formation process. Tea Communication, 2015, 42(4): 14-18. (in Chinese)

[27] SCHMARR H, ENGEL K. Analysis and stereodifferentiation of linalool in Theobroma cacao and cocoa products using enantioselective multidimensional gas chromatography. European Food Research & Technology, 2012, 235(5): 827-834.

[28] DEMYTTENAERE J C R, VANOVERSCHELDE J, KIMPE N D. Biotransformation of (R)-(+)- and (S)-(-)-citronellol by Aspergillus sp. and Penicillium sp., and the use of solid-phase microextraction for screening. Journal of Chromatography A, 2004, 1027(1/2): 137-146.

[29] HO C T, ZHENG X, LI S M. Tea aroma formation. Food Science and Human Wellness, 2015, 4(1): 9-27.

[30] 王華夫, 竹尾忠一, 伊奈和夫, 李名君. 祁門紅茶的香氣特征. 茶葉科學(xué), 1993, 13(1): 61-68.

WANG H F, ZHU W Z Y, YI N H F, LI M J. The aroma characteristics of Keemun Black Tea. Tea Science, 1993, 13(1): 61-68. (in Chinese)

[31] YANG Z, BALDERMANN S, WATANABE N. Recent studies of the volatile compounds in tea. Food Research International, 2013, 53(2): 585-599.

[32] 谷運(yùn)璀, 錢莉群, 李步詳, 宦月琴. 芳樟醇氧化物的合成. 香料香精化妝品, 2013(S1): 28-31.

GU Y C, QIAN L Q, LI B X, HUAN Y Q. Synthesis of linalool oxide. Flavour Fragrance Cosmetics, 2013(S1): 28-31. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Enantiomeric Analysis of Volatile Terpenoids in Different Teas

SHAO ChenYang1,2, Lü HaiPeng1, ZHU Yin1, ZHANG Yue1, LIN Zhi1
(1Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization of Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008;2Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

【Objective】 Volatile terpenoids are important components of tea aroma, and most of them contain chiral carbon structure which lead to the existence of corresponding enantiomers with different aroma characteristics. Identifying the terpenoid enantiomers among different teas can result in a better understanding of the mechanisms underlying tea aroma formation for tea quality improvement. 【Method】 An analytical approach for enantiomeric analysis of volatile terpenoids in tea was firstlyestablished by headspace solid phase microextraction combined with chiral gas chromatography-mass spectrometry. The chiral capillary column of Supelco β-DEX110 was used for terpenoid enantiomer analyses with corresponding authentic standards. And the compositions of enantiomers of terpenoids in representative green teas, black teas, oolong teas, white teas and dark teas were then investigated. 【Result】 Nine pairs of terpenoids enantiomers were successfully separated. The data of experiment indicated that linalool and linalool oxide B enantiomers were detected in all tea samples with high contents: S-linalool was considered as the major configuration of linalool in most kinds of teas, except for Yingde and Yunnan black teas and Indonesia white tea, which contained R-(-)-linalool as the major configuration of linalool; linalool oxide B presented the same stereo configuration in green tea, black tea, white tea and dark tea, whereas in some oolong teas (Lingtou Dancong and Wenshan Baozhong) a higher proportion of opposite configuration existed. Linalool oxide A was detected in green and dark teas with the same major stereo configuration, while it presented reverse major configuration in some black teas (Keemun and Darjeeling black teas) and oolong teas (Shuixianwudong Dancong and Tieguanyin). The single and consistent configurations of linalool oxides C and D were observed in most tea samples. The other important terpenoids distributed in various situations among different tea samples: α-pinene was only detected in the Lapsang Souchong tea, and the major configuration was S. Different configurations and various enantiomeric excess values of α-terpineol were observed in different teas. R-(-)-4-terpineol was the major configurations of 4-terpineol in all tea samples, and S-(+)-4-terpineol could only be detected in the Liu Pao tea (dark tea), and a single R-configuration of α-ionone could be detected in most teas (except green teas). The quantitative results indicated that the highest contents in tea aroma of most tea samples were contributed by linalool, and the ranking order of mean contents of linalool was white tea>black tea>oolong tea>green tea>dark tea. The contents of linalool oxide B frequently second to those of linalool, and the ranking order of mean contents was black tea>white tea>oolong tea>dark tea>green tea. The contents of other terpenoids were generally lower than 100 ng·g-1, and the content distributions were widely different among various tea samples. 【Conclusion】This study investigated the content variations of the nine pairs of important terpenoid enantiomers in different kinds of tea for the first time. The present research result could contribute to get a deeper understanding of the chemical substances of tea aroma, and provide a new thought for the quality control of tea aroma, the discrimination of tea cultivars and origins and quality certification of tea.

tea; volatile terpenoids; enantiomers; gas chromatography-mass spectrometry; enantiomeric excess

2016-07-22；接受日期：2016-12-08

浙江省自然科學(xué)基金（LQ15C160007，LY14C160002）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-23）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（CAASASTIP-2014-TRICAAS）

聯(lián)系方式：邵晨陽，Tel：0571-86593701；E-mail：shaocy@tricssa.com。通信作者朱蔭，Tel：0571-87967281；E-mail：zhuy_scu@tricaas.com。通信作者林智，Tel：0571-86650617；E-mail：linzhi@caas.cn