一株芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶工程菌的構(gòu)建

韓登蘭，王騰飛，汪俊卿，韓海紅，王瑞明*

（齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院山東省微生物工程重點實驗室，山東濟(jì)南250353）

一株芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶工程菌的構(gòu)建

韓登蘭，王騰飛，汪俊卿，韓海紅，王瑞明*

（齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院山東省微生物工程重點實驗室，山東濟(jì)南250353）

以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)168-Tres基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到同源臂基因sleB1和cwlJ1，重疊PCR連接sleB1與卡那霉素抗性(kmr)基因，電轉(zhuǎn)獲得B.subtilis168-TresΔsleB菌株；連接cwlJ1與博來霉素抗性(zeor)基因，電轉(zhuǎn)獲得B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ菌株。結(jié)果表明，經(jīng)kmr、zeor抗性篩選及PCR鑒定，成功獲得sleB、cwlJ基因雙缺失菌株B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ；發(fā)酵結(jié)果顯示，B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ與出發(fā)菌株的芽孢形成率一致，約為88%；在LB固體培養(yǎng)基和麥芽糖轉(zhuǎn)化生成海藻糖體系中B.subtilis 168-Tres的芽孢萌發(fā)數(shù)為4.8×108CFU/mL，B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ芽孢未萌發(fā)；在麥芽糖轉(zhuǎn)化生成海藻糖體系中，重組菌海藻糖合酶酶活為10.42 U，比原始菌提高了78.7%。敲除sleB、cwlJ基因后，不影響枯草芽孢桿菌生成芽孢的量，但能有效控制芽孢在上述轉(zhuǎn)化體系中的萌發(fā)，使芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶，提高了芽孢的利用率。

枯草芽孢桿菌；sleB和cwlJ基因；基因敲除；芽孢萌發(fā)；海藻糖合酶

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是革蘭氏陽性細(xì)菌的典型代表，是一類好氧型、內(nèi)生抗逆孢子的桿狀細(xì)菌[1]；其細(xì)胞壁組成簡單，在合成過程中沒有內(nèi)毒素生成，已經(jīng)被歐盟、日本、美國和中國認(rèn)定為安全無毒的菌株[2]，可廣泛應(yīng)用于食品[3-4]、飼料[5]等行業(yè)。芽孢（內(nèi)生孢子或稱孢子）是芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞受到營養(yǎng)缺乏，代謝產(chǎn)物積累，或溫度變化等外部環(huán)境因子的觸發(fā)而形成的休眠體[6]，芽孢的形成需要經(jīng)過一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)[7-8]。

近年來以芽孢衣殼蛋白為分子載體，通過芽孢表面展示技術(shù)將外源目的蛋白展示在重組枯草芽孢桿菌芽孢表面，制備具有生物活性的重組芽孢抗體和酶制劑已成為人們研究和關(guān)注的熱點[9-10]。芽孢的結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，中心部位為核芯，含有原生質(zhì)體，被芽孢膜包裹；核芯外面為皮層，成分為肽聚糖，再往外是一層或者數(shù)層蛋白質(zhì)組成的芽孢殼，最表面為芽孢壁[11]。B.subtilis芽孢中約包含25種衣殼蛋白，而本研究前期已利用CotC為載體成功將海藻糖合酶展示在芽孢表面。但是由于芽孢易受萌發(fā)劑刺激而萌發(fā)，當(dāng)芽孢萌發(fā)時首先會釋放2,6-吡啶二羧酸鈣（Ca2+-dipicolinic acid，Ca2+-DPA）和大量離子，然后孢子皮層內(nèi)的肽聚糖被水解，皮層水解會逐漸補(bǔ)充孢子核內(nèi)的水分，最后芽孢恢復(fù)酶活力，導(dǎo)致衣殼蛋白被降解脫落[12-14]，而海藻糖合酶相應(yīng)脫落后也會被一些蛋白酶類降解，因此不僅失去了固定化酶的目的，還降低了海藻糖合酶酶活，加大其回收難度。所以，弱化芽孢萌發(fā)，鈍化芽孢對外界環(huán)境刺激的感知變得尤為重要。本研究選擇枯草芽孢桿菌芽孢萌發(fā)中的兩個關(guān)鍵皮層溶解酶基因cwlJ和sleB基因[15-16]作為敲除對象，實現(xiàn)抑制芽孢萌發(fā)的目的，構(gòu)建芽孢表面穩(wěn)定展示海藻糖合酶的工程菌，提高芽孢的穩(wěn)定性和利用率，更加高效穩(wěn)定的表面展示海藻糖合酶。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

含有海藻糖合酶基因的枯草芽孢桿菌168（以下簡稱B.subtilis168-Tres）：本實驗室保藏；含有卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒pPIC9k和含有博來霉素抗性基因的質(zhì)粒pPICZαA：杭州寶賽生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶：日本TakaRa寶生物公司；卡那霉素、博來霉素、Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：上海生工生物工程有限公司；高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒：艾德萊生物公司；其他試劑均屬于國產(chǎn)分析純。實驗所涉及引物見表1所示。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in the study

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉10g/L，pH 7.0～7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、玉米漿10 g/L、酵母浸粉3 g/L、NaCl 6 g/L、K2HPO43 g/L、MnSO40.3 g/L、MgSO42.4 g/L，pH7.0～7.4。

菌體增殖培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、山梨醇91 g/L。

電轉(zhuǎn)緩沖液：甘露醇91g/L、山梨醇91g/L、甘油100g/L。

菌體復(fù)蘇培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、甘露醇69 g/L、山梨醇91 g/L。

葡萄糖需在高壓蒸汽滅菌鍋中115℃滅菌20 min，其他培養(yǎng)基均121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；WFJ 7200型可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；5804 R型離心機(jī)：德國Eppendorf公司；4380C型電轉(zhuǎn)儀：德國Eppendorf公司；GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；梯度PCR儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；MD2000核酸超微量分光光度計：美國BioFuture公司；ZQYZ-CS型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 重組同源性片段sleB1-kmr、cwlJ1-zeor的制備

圖1 枯草芽孢桿菌168-TresΔsleBΔcwlJ構(gòu)建流程圖Fig.1 Flowchart of construction ofBacillus subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ

用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒提取B.subtilis 168-Tres菌體的脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA），并以此為模板，sleB F1和sleB R1為引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，獲得長度為592 bp用于敲除sleB基因的同源臂sleB1；使用高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒提取pPIC9k質(zhì)粒，以此為模板，sleB F2和sleB R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長度為1 502 bp的卡那霉素抗性基因片段kmr；使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒膠回收所得的sleB1片段與kmr片段為模板，sleB F1和sleB R2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR[17]，PCR擴(kuò)增條件為：（1）95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 sec，57℃退火30 s，72℃延伸3.5 min，5個循環(huán)；72℃延伸2 min；（2）95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸4.5 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存，擴(kuò)增得到長度為2 094 bp的同源重組片段sleB1-kmr，并使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收，保存于-20℃?zhèn)溆?。cwlJ1長度為451 bp，博來霉素抗性基因片段為1 205 bp，cwlJ1-zeor片段制備方法同上。Bacillus subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ工程菌構(gòu)建流程見圖1。

1.3.2 回收產(chǎn)物的酶切及濃縮

用限制性內(nèi)切酶BamH I酶切sleB1-kmr和cwlJ1-zeor基因片段，并向酶切產(chǎn)物中加入1/10體積3 mol/L醋酸鈉和2.5倍體積的無水乙醇，置于-20℃冰箱冷卻20 min，然后12 000 r/min離心5 min得沉淀；加入300 μL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇重懸沉淀，12 000 r/min離心5 min后除去乙醇，37℃風(fēng)干30 min，最后加入15～20 μLddH2O重懸DNA。使用核酸超微量分光光度計測定回收DNA質(zhì)量濃度，并最終獲得質(zhì)量濃度在200～500 ng/μL之間的DNA溶液。

1.3.3 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備

挑取新鮮LB固體培養(yǎng)基表面的B.subtilis168-Tres單菌落，接種于10 mL菌體增殖培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)12h；將上述菌液轉(zhuǎn)接到50 mL菌體增殖培養(yǎng)基中至菌液初始OD600nm=0.2，然后37℃、220 r/min培養(yǎng)菌體至OD600nm= 1.0；將菌液轉(zhuǎn)移到100 mL離心管，冰浴10～15 min后，4℃、8000r/min離心5min，收集菌體；離心后的菌體用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液洗滌2～3次，并使用1mL電轉(zhuǎn)緩沖液重懸菌體，制成枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)[18]；將制備好的感受態(tài)細(xì)胞每管分裝100 μL，-80℃保存?zhèn)溆谩.subtilis168-TresΔsleB感受態(tài)的制備方法同上。

1.3.4 電轉(zhuǎn)化

將回收片段sleB1-kmr與B.subtilis168-Tres感受態(tài)混合均勻，然后加到2 mm電轉(zhuǎn)杯中預(yù)冷5 min，并使用電轉(zhuǎn)儀在2 000 V、5 ms條件下電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)完成后立即加入500 μL菌體復(fù)蘇培養(yǎng)基，37℃、180 r/min復(fù)蘇培養(yǎng)3 h后涂布在含卡那霉素（25 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，篩選出抗卡那霉素的菌株。將cwlJ1-zeor與B.subtilis168-TresΔsleB感受態(tài)電轉(zhuǎn)后，篩選出抗卡那霉素和博來霉素的菌株。

1.3.5 陽性重組菌株的鑒定及傳代培養(yǎng)

挑取陽性轉(zhuǎn)化子接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜后8 000 r/min離心并收集菌體，提取重組菌DNA，并以獲得的基因組為模板，sleB F2和sleB R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物，獲得陽性重組菌株B.subtilis168-TresΔsleB。重組菌B.subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ的獲得方法同上。用LB液體培養(yǎng)基將B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ重組菌在37℃、200 r/min的培養(yǎng)條件下傳代15次，做菌落PCR驗證。

1.3.6 B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ重組菌芽孢形成檢測

將原始菌株B.subtilis168-Tres和重組菌株B.subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ以1%的接種量分別接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于37℃、200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每隔4 h取樣，同時利用芽孢染色法對芽孢染色，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體成紅色。觀察10個視野的營養(yǎng)細(xì)菌與芽孢數(shù)，產(chǎn)芽孢率=芽孢數(shù)/（芽孢數(shù)+營養(yǎng)細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.3.7 B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ重組菌在LB培養(yǎng)基中芽孢萌發(fā)驗證

分別將發(fā)酵48 h后的重組菌與原始菌菌液80℃水浴20 min，立即冰浴，將菌體稀釋后涂布在LB固體培養(yǎng)基中，放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 h，用平板計數(shù)法記錄芽孢萌發(fā)結(jié)果。

1.3.8 B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ重組菌在麥芽糖轉(zhuǎn)化體系中芽孢萌發(fā)驗證

分別取5 mL發(fā)酵48 h后的重組菌與原始菌菌液80℃水浴20 min，立即冰浴，與10 mL pH 7.5的磷酸鹽緩沖液配制的終濃度30%的麥芽糖漿混勻后制備成海藻糖合酶的反應(yīng)體系。將此反應(yīng)體系置于25℃恒溫水浴振蕩搖床中反應(yīng)12 h，每隔4 h取樣涂布在LB培養(yǎng)基中，放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 h，用平板計數(shù)法記錄芽孢萌發(fā)結(jié)果。

1.3.9 B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ重組菌在麥芽糖轉(zhuǎn)化體系中海藻糖合酶酶活檢測

分別將發(fā)酵48h后的重組菌與原始菌發(fā)酵液8000r/min離心20 min，棄上清，用去離子水洗滌沉淀2次后并懸浮，加入溶菌酶使其終質(zhì)量濃度為2 mg/mL后于37℃放置30 min破壞營養(yǎng)細(xì)胞，后經(jīng)8 000 r/min離心10 min，烘干，稱量干菌體質(zhì)量，最后用去離子水懸浮制得芽孢懸浮液，將5 mL芽孢懸浮液與10 mL pH 7.5的磷酸鹽緩沖液配制的終濃度為30%的麥芽糖漿混勻，制備成海藻糖合酶的反應(yīng)體系。將此反應(yīng)體系置于25℃恒溫水浴振蕩搖床中反應(yīng)12 h后，室溫，1 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測轉(zhuǎn)化體系中海藻糖。

HPLC測定色譜條件：Hypersil NH2色譜柱（300 mm× 4.6mm，5μm）；流動相（乙腈∶水=3∶1，V/V）；流速l.0mL/min；示差折光檢測器：波長589.3nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫：40℃。

海藻糖合酶活力定義：在25℃，pH 7.5條件下，每分鐘生成1 μmol海藻糖所需的酶量為一個酶活單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因敲除片段sleB1-kmr的構(gòu)建、電轉(zhuǎn)化及鑒定

以B.subtilis168-Tres菌體的基因組為模板，sleB F1和sleB R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2a。由圖2a可知，在600bp左右出現(xiàn)特異性條帶，與理論長度592 bp相符，表明已成功獲得同源臂sleB1；以質(zhì)粒pPIC9k為模板，sleB F2和sleB R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2b。由圖2b可知，在1500bp左右出現(xiàn)特異性條帶，與理論長度1 502 bp相符，表明成功獲得卡那霉素抗性基因片段kmr；以膠回收制得的sleB1片段與kmr片段為模板，sleB F1和sleB R2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR，得基因敲除片段sleB1-kmr，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果見圖2c。由圖2c可知，在2 000 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，與理論長度2 094 bp相符，表明基因敲除片段sleB1-kmr構(gòu)建成功。

圖2 sleB-kmr片段PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified products ofsleB-kmr

通過乙醇沉淀法濃縮酶切片段后，測得DNA質(zhì)量濃度為395.63 ng/μL。將10 μL回收片段與100 μLB.subtilis 168-Tres感受態(tài)細(xì)胞混合并電轉(zhuǎn)，用引物sleB F2和sleB R2對含卡那霉素平板上生長的菌落基因組進(jìn)行驗證，結(jié)果如圖2d所示，表明sleB1-kmr與sleB發(fā)生同源重組，完成sleB基因的敲除，獲得B.subtilis168-TresΔsleB重組菌。

2.2 基因敲除片段cwlJ1-zeor的構(gòu)建、電轉(zhuǎn)化及鑒定

以B.subtilis168-Tres菌體的基因組為模板，cwlJ F1和cwlJ R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖3a。由圖3a可知，在500 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，與理論長451 bp相符，表明已成功獲得同源臂cwlJ1；以質(zhì)粒pPICZαA為模板，使用引物cwlJ F2和cwlJ R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖3b。由圖3b可知，在1200bp左右出現(xiàn)特異性條帶，與理論長度1 205 bp相符，表明成功獲得博來霉素抗性基因片段zeor；以膠回收制得的cwlJ1片段和zeor片段為模板，cwlJ F1和cwlJ R2為引物進(jìn)行重疊延伸PCR，得基因敲除片段cwlJ1-zeor，1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗結(jié)果見圖3c。由圖3c可知，PCR產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)在1 700 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，與理論長度1 656 bp相符，表明基因敲除片段cwlJ1-zeor構(gòu)建成功。

通過乙醇沉淀法濃縮酶切片段后，測得DNA質(zhì)量濃度為378.26 ng/μL。將10 μL回收片段與100 μLB.subtilis 168-TresΔsleB感受態(tài)細(xì)胞混合并電轉(zhuǎn)，用引物cwlJ F2和cwlJ R2對含kmr和zeor平板上生長的菌落基因組進(jìn)行驗證，結(jié)果如圖3d所示，表明cwlJ1-zeor與cwlJ發(fā)生同源重組，完成cwlJ基因的敲除，獲得B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ重組菌。

圖3 cwlJ-zeor片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplified products ofcwlJ-zeor

2.3 B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ重組菌傳代培養(yǎng)驗證結(jié)果

B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ重組菌第5、10、15次傳代后的菌落PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖4。由圖4可知，第5、10、15次傳代在1 500 bp和1 200 bp都有條帶產(chǎn)生，與kmr和zeor的理論值相符，表明重組菌的遺傳穩(wěn)定性并未發(fā)生變化。

圖4 菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis of colony PCR amplified products

2.4 sleB、cwlJ基因雙敲除后對芽孢形成的影響

通過顯微鏡計數(shù)法計算原始菌株B.subtilis168-Tres與重組菌B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ芽孢率，結(jié)果見圖5。由圖5可知，重組菌株比原始菌株生長遲緩約4 h，但兩株菌在48 h后的芽孢形成率都約為88%，證明敲除sleB和cwlJ基因后會使菌體生長時間延遲，但芽孢形成率未發(fā)生變化。

圖5 枯草芽孢桿菌原始菌株168-Tres及重組菌168-TresΔsleBΔcwlJ芽孢形成率Fig.5 Sporulation rate of originalB.subtilis168-Tresand recombinantB.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ

2.5 B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ重組菌在LB培養(yǎng)基中芽孢萌發(fā)驗證

通過平板計數(shù)法對原始菌株和重組菌株芽孢萌發(fā)情況進(jìn)行比較，結(jié)果見圖6。由圖6可知，B.subtilis168-Tres芽孢萌發(fā)數(shù)為4.9×108CFU/mL，B.subtilis168-TresΔsleB芽孢萌發(fā)數(shù)為5.3×104CFU/mL，B.subtilis168-TresΔcwlJ芽孢萌發(fā)數(shù)為2.1×107CFU/mL，B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ芽孢未見萌發(fā)。

圖6 芽孢在LB培養(yǎng)基中萌發(fā)結(jié)果Fig.6 Spore germination results on LB medium

2.6 B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ重組菌在麥芽糖轉(zhuǎn)化體系中芽孢萌發(fā)驗證

圖7 芽孢在麥芽糖轉(zhuǎn)化體系中的萌發(fā)結(jié)果Fig.7 Spore germination results in maltose conversion system

通過平板計數(shù)法對原始菌株B.subtilis168-Tres和重組菌株B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ在麥芽糖轉(zhuǎn)化體系中的芽孢萌發(fā)情況進(jìn)行比較，結(jié)果見圖7。由圖7可知，原始菌株在麥芽糖轉(zhuǎn)化體系中轉(zhuǎn)化4 h、8 h、12 h、16 h后的芽孢萌發(fā)數(shù)都為4.8×108CFU/mL左右，而重組菌株芽孢在各個時段一直未見萌發(fā)。

2.7 B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ重組菌在麥芽糖轉(zhuǎn)化體系中海藻糖合酶酶活檢測

為了證實B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ重組菌海藻糖合酶酶活是否有所提高，利用HPLC對重組菌芽孢懸浮液進(jìn)行海藻糖合酶檢測，結(jié)果見圖8。由圖8可知，用B.subtilis 168-Tres原始菌芽孢轉(zhuǎn)化測得的海藻糖合酶酶活為5.83 U，用B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ重組菌芽孢轉(zhuǎn)化測得的海藻糖合酶酶活為10.42 U，重組菌比原始菌酶活提高了78.7%，這表明敲除sleB和cwlJ基因后弱化了芽孢萌發(fā)，成功提高了芽孢表面展示海藻糖合酶的穩(wěn)定性。

圖8 重組菌(A)及原始菌(B)芽孢懸浮液轉(zhuǎn)化生成海藻糖高效液相色譜圖Fig.8 HPLC chromatogram of trehalose from recombinant(A)and original(B)strains

3 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建敲除載體sleB-kmr、cwlJ-zeor的方法來實現(xiàn)sleB和cwlJ基因的敲除。通過對構(gòu)建的B.subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ工程菌初步研究，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建菌株與原始菌株相比，sleB和cwlJ基因的缺失對芽孢形成并無較大影響，但其芽孢萌發(fā)數(shù)有顯著降低，在LB培養(yǎng)基和麥芽糖轉(zhuǎn)化生成海藻糖體系中B.subtilis168-Tres菌株芽孢萌發(fā)數(shù)為4.9×108CFU/mL，而B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ菌株芽孢不萌發(fā)；經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)構(gòu)建菌株的海藻糖合酶酶活比原始菌提高了78.7%，表明B.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJ工程菌已經(jīng)構(gòu)建成功。

目前國內(nèi)外還未有對芽孢表面展示海藻糖合酶的研究，與其他生產(chǎn)海藻糖的菌株相比，芽孢表面展示海藻糖合酶具有以下特點：（1）避免誘導(dǎo)劑使用造成的限制[19]；（2）融合酶不需穿過細(xì)胞膜[20]，避免了細(xì)胞破碎、分離等繁瑣步驟，降低生產(chǎn)成本提高海藻糖產(chǎn)率[21]；（3）芽孢比表面積較酶分子大，便于回收，可重復(fù)利用。本研究在其基礎(chǔ)上對菌株進(jìn)行改造，解決了芽孢表面展示海藻糖合酶時芽孢易受轉(zhuǎn)化體系中的麥芽糖刺激而萌發(fā)，導(dǎo)致鉚定在芽孢表面上的海藻糖合酶因芽孢萌發(fā)而失去活性的難題。sleB和cwlJ基因的敲除，成功的抑制了芽孢萌發(fā)，提高了芽孢的穩(wěn)定性和利用率，為芽孢表面展示海藻糖合酶提供了穩(wěn)定的載體，為海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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Construction of engineered bacteria displaying trehalose synthase on spore surface

HAN Denglan,WANG Tengfei,WANG Junqing,HAN Haihong,WANG Ruiming*
(Shandong Key Laboratory of Microbial Engineering,College of Bioengineering,Qilu University of Technology, Jinan 250353,China)

UsingBacillus subtilis168-Tresgenomic DNA as templates,the amplification of two homologous arms was obtained by PCR technique, namelysleB1 andcwlJ1.Then sleB1 was connected with kanamycin resistance(kmr)gene by using overlapping PCR technique,thus,B.subtilis 168-TresΔsleBwas obtained;thencwlJ1 and bleomycin resistance(zeor)gene was connected and transformed it intoB.subtilis168-TresΔsleBcompetent cells,thereby,the target strainB.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJwas obtained.Results showed that afterkmr,zeorand PCR identification,the sleBandcwlJgenes deletion strainB.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJwas successfully constructed.The verification results of fermentation showed that the sporulation rate ofB.subtilis168-TresΔsleBΔcwlJwas consistent with the original strain,and both of them were about 88%.In LB solid medium and converting maltose into trehalose system,the spore germination ofB.subtilis168-Treswas 4.8×108CFU/ml,however,the spore ofB.subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJdid not germinate.In converting maltose into trehalose system,the trehalose synthase enzyme activity of recombinant strain was 10.42 U,compared with original strain;the enzyme activity increased 78.7%.In conclusion,the knockout ofsleBandcwlJgenes had no effect on spore formation ofB.subtilis168-Tres,but it can effectively control spores germination in the above-described transformation system,the spore surface can stably display trehalose synthase,improved the utilization efficiency of spore.

Bacillus subtilis;sleBandcwlJgenes;gene knockout;spore germination;trehalose synthase

Q784

0254-5071（2017）03-0138-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.028

2017-01-04

國家自然科學(xué)基金（31501413）；山東省高校創(chuàng)新項目（J14LE02）；工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業(yè)微生物重點實驗室（天津科技大學(xué)）開放基金（2016IM005）

韓登蘭（1992-），女，碩士研究生，研究方向為微生物酶技術(shù)。

*通訊作者：王瑞明（1962-），男，教授，博士，研究方向為微生物酶技術(shù)。