熱帶假絲酵母ctfat1p基因在吸收脂肪族化合物中的功能研究

石瑩，楊曉慧，馬春玲，王騰飛，肖靜，王瑞明，汪俊卿*

熱帶假絲酵母ctfat1p基因在吸收脂肪族化合物中的功能研究

石瑩，楊曉慧，馬春玲，王騰飛，肖靜，王瑞明，汪俊卿*

（齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250353）

以熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)1798中的ctfat1p基因?yàn)檠芯繉?duì)象，利用重疊PCR將ctfat1p基因內(nèi)約500 bp片段與G418抗性基因(kanr)相連接，經(jīng)末端單酶切后電轉(zhuǎn)化至C.tropicalis1798感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)一次同源單交換，將抗性基因kanr插入至ctfat1p基因內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除，并通過(guò)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)分析Ctfat1p在熱帶假絲酵母脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的功能。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)G418抗性篩選和基因組PCR鑒定，成功獲得ctfat1p基因缺失菌株C.tropicalis1798Δctfat1p；分析發(fā)現(xiàn)ctfat1p基因敲除對(duì)C.tropicalis1798以油脂為底物培養(yǎng)12 h后重組菌OD600nm值僅為野生型菌株的47.9%，表明ctfat1p基因敲除后影響C.tropicalis1798對(duì)油脂吸收利用。通過(guò)基因敲除手段構(gòu)建ctfat1p基因缺失菌株，可以減弱細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸的攝取，驗(yàn)證了ctfat1p基因?yàn)闊釒Ъ俳z酵母油脂吸收和利用的關(guān)鍵基因。

ctfat1p基因；熱帶假絲酵母；基因敲除；同源單交換

熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）能夠利用烷烴和脂肪酸作為唯一碳源，合成長(zhǎng)鏈二元酸[1-2]。長(zhǎng)鏈二元酸是一種重要的化工原料和醫(yī)藥中間體，不能從自然界中直接獲取，微生物發(fā)酵法具有成本低、安全性高以及綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外受到普遍重視。目前，利用熱帶假絲酵母發(fā)酵正構(gòu)烷烴生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸的發(fā)酵工業(yè)放大技術(shù)己成熟[3-4]。隨著石油資源的枯竭，以烷烴為原料生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸面臨日益嚴(yán)重的成本壓力和原料壓力。因此，尋找可再生的、廉價(jià)的烷烴替代品作為原料，成為長(zhǎng)碳鏈二元酸產(chǎn)業(yè)所面臨的重大挑戰(zhàn)。

前期通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以油脂代替烷烴為底物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)二元酸是可行的，但與烷烴相比利用效率較低。RACHINSKI V V等[5-8]研究發(fā)現(xiàn)，熱帶假絲酵母吸收烷烴能夠通過(guò)胞吞途徑直接吸收，與之相比，熱帶假絲酵母在利用油脂作為底物進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，則需要將油脂水解成長(zhǎng)鏈脂肪酸才能進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，而長(zhǎng)鏈脂肪酸的性質(zhì)與烷烴有很大的區(qū)別，因此推測(cè)熱帶假絲酵母對(duì)油脂的吸收利用途徑與烷烴可能存在不同。目前，熱帶假絲酵母中長(zhǎng)鏈脂肪酸攝取、構(gòu)成過(guò)程的詳盡機(jī)制還不明確，長(zhǎng)鏈脂肪酸的吸收可能包括蛋白調(diào)控運(yùn)輸和被動(dòng)擴(kuò)散。由于脂肪酸是疏水性物質(zhì)，不能直接進(jìn)入組織細(xì)胞中被利用。它們必須與細(xì)胞中的特殊蛋白質(zhì)一起組成一個(gè)親水性的分子基團(tuán)，才能進(jìn)入組織細(xì)胞并在細(xì)胞中運(yùn)輸[9]。近年來(lái)，大量研究通過(guò)基因敲除或者基因過(guò)表達(dá)試驗(yàn)證明，除了擴(kuò)散滲透的方式，還存在由多個(gè)蛋白介導(dǎo)的競(jìng)爭(zhēng)性的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系。目前己經(jīng)有眾多的試驗(yàn)肯定了基因fat1p能顯著地促進(jìn)脂肪細(xì)胞吸收脂肪酸[10-11]。

在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系已被充分表征[12]。釀酒酵母中存在特殊的長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)長(zhǎng)鏈脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，被命名為脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Fat1p）。BLACK P N等[13-15]的研究顯示，基因fat1p缺陷的酵母與野生型相比，胞內(nèi)沒(méi)有積累外源添加的長(zhǎng)鏈脂肪酸，并且轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂肪酸的能力也消失，實(shí)驗(yàn)證明Fat1p具有轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂肪酸的功能。而熱帶假絲酵母中類似基因尚未被報(bào)道，以釀酒酵母fat1p基因?yàn)槟０逶诿绹?guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)查詢可知，熱帶假絲酵母基因組中存在相似基因序列，所編碼的蛋白質(zhì)與釀酒酵母中的Fat1p序列一致性為50%，推測(cè)其與長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。本研究利用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)兩步構(gòu)建敲除片段，酶切后轉(zhuǎn)化至熱帶假絲酵母中，通過(guò)一次同源單交換，在目的基因內(nèi)部插入一段含有篩選標(biāo)記基因的序列，實(shí)現(xiàn)熱帶假絲酵母的長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CtFat1p基因的快速敲除。本研究構(gòu)建了ctfat1p基因缺失突變株，為進(jìn)一步研究其在熱帶假絲酵母中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）1798：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；含有G418抗性基因的質(zhì)粒pPIC9k：寶生物工程（大連）有限公司；實(shí)驗(yàn)所涉及引物見(jiàn)表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；G418、Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒：上海生工生物工程有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：（NH4）2SO41 g/L、酵母浸粉2 g/L、維生素B1（vitamin B1，VB1）0.2 g/L、NaCl 2 g/L、KH2PO48 g/L、Na2HPO4·12H2O10.08g/L、尿素3g/L、MgSO4·7H2O6.15g/L、葡萄糖（或十二烷、十六烷、油脂）62 g/L。

菌體增殖培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L。

菌體復(fù)蘇培養(yǎng)基：山梨醇1 mol/L。

以上培養(yǎng)基均需在高壓蒸汽滅菌鍋中115℃滅菌20min，葡萄糖單獨(dú)滅菌；尿素和MgSO4·7H2O 110℃滅菌20 min，分開(kāi)滅菌。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQZY-CS恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；ThermoblockPCR儀：德國(guó)Veriti公司；DYY-12型電泳儀：北京市六一儀器廠；MD2000H核酸超微量系列分光光度計(jì)：英國(guó)BioFuture公司；5804R型離心機(jī)、4308型電轉(zhuǎn)儀：德國(guó)Eppendorf公司；7200可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯上海儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組同源性片段ctfat1p1-kanr的制備

圖1 C.tropicalis1798△ctfat1p構(gòu)建流程圖Fig.1 Flowchart of construction ofC.tropicalis1798△ctfat1p

使用上海生工Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒提取C.tropicalis1798菌體的DNA，并以此為模板，使用引物Fat1p F1和Fat1p R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存，擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為551bp用于ctfat1p基因敲除的同源臂ctfat1p1；使用高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒提取質(zhì)粒pPIC9k，以質(zhì)粒pPIC9k為模板，使用引物Kan F2和Kan R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸3.5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存，30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為1 523 bp G418抗性基因片段kanr；使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工）膠回收制得的ctfat1p1片段與kanr片段為模板，F(xiàn)at1p F1和Kan R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行重疊延伸PCR[16-18]，PCR擴(kuò)增條件為：（1）95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，5個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min；（2）95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存，擴(kuò)增制得長(zhǎng)度為長(zhǎng)度2074bp的同源重組片段ctfat1p1-kanr（見(jiàn)圖1），使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工）進(jìn)行膠回收，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 回收產(chǎn)物的酶切及濃縮

ctfat1p1-kanr基因片段膠回收產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切處理，并向酶切產(chǎn)物中加入1/10體積3 mol/L醋酸鈉和2.5倍體積無(wú)水乙醇，并置于-20℃冰箱冷卻1 h，后經(jīng)12 000 r/min離心5 min得沉淀；加入300 μL體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇重懸清洗，12 000 r/min離心5 min除去乙醇，37℃風(fēng)干30 min，最后加入15 μL ddH2O重懸DNA。使用核酸超微量分光光度計(jì)測(cè)定回收DNA濃度，并最終獲得質(zhì)量濃度在200～1000ng/μL之間的DNA溶液。于-20℃保存，以備后用。

1.3.3 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞制備

將C.tropicalis1798接種到含50 mL菌體增殖培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、200 r/min，搖床過(guò)夜培養(yǎng)；將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液涂布，得到C.tropicalis1798單菌落；用接種環(huán)挑取C.tropicalis1798單菌落到50 mL菌體增殖培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min，12 h后轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)10 h；取1.5 mL菌液到EP管中，3 000 r/min，離心1 min，收集菌體，用1.5 mL預(yù)冷的無(wú)菌水吹打懸浮細(xì)胞；3000r/min，離心1min，棄上清，用1 mL預(yù)冷的無(wú)菌水懸浮細(xì)胞；3 000 r/min，離心1 min，棄上清，用1 mL 1 mol/L預(yù)冷的山梨醇懸浮細(xì)胞；3 000 r/min，離心1 min，棄上清，用80 μL預(yù)冷的山梨醇懸浮細(xì)胞，即制成熱帶假絲酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)；將制備好的感受態(tài)細(xì)胞于-80℃保存，以備后用。

1.3.4 電轉(zhuǎn)化

1.3.5 陽(yáng)性重組菌株的鑒定

挑取上述菌落接種到含G418抗性的液體YEPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過(guò)夜后8 000 r/min離心收集菌體，使用上海生物工程有限公司提供的試劑盒提取重組菌DNA，并以獲得的基因組為模板，F(xiàn)at1p F1和Kan R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，最終獲得陽(yáng)性重組菌株。

1.3.6 原始菌株和重組菌株的發(fā)酵培養(yǎng)與二元酸的測(cè)定

取500μL甘油管保藏的C.tropicalis1798和C.tropicalis 1798△ctfat1p分別接種于50 mL液體YEPD培養(yǎng)基，30℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。取種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基（含葡萄糖）中，接種量為10%、30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，待生長(zhǎng)穩(wěn)定后調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值為7.5，加入10%油脂，進(jìn)入產(chǎn)酸期。在產(chǎn)酸期，每12 h調(diào)節(jié)pH至7.5，產(chǎn)酸期6 d。

將20 mL發(fā)酵液，加入2 mL 4 mol/L的NaOH溶液，沸水浴5 min，混勻，冷卻后置于50 mL離心管中，10 000 r/min離心10min。吸取中間的水相于50mL錐形瓶中，滴加3 mol/L的硫酸溶液至pH值為2～3，使二元酸完全結(jié)晶析出。抽濾，并用去離子水洗滌錐形瓶和濾餅，至濾液和濾紙呈中性為止。將濾餅及濾紙移入150 mL錐形瓶，加入30 mL體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液作溶劑，加熱使二元酸完全溶解，加入2～3滴溴百里香酚藍(lán)作指示劑，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)液滴定至終點(diǎn)。

1.3.7 原始菌株和重組菌株生長(zhǎng)速率分析

以2%的接種量分別接種于以葡萄糖、十二烷、十六烷和油脂為碳源的50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，每2 h取樣檢測(cè)其OD600nm值。繪制生長(zhǎng)曲線進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸序列比對(duì)

父親走后，我已習(xí)慣睡前不再將房門鎖上。母親幾乎每夜都會(huì)來(lái)到我的房里，不同的是，她從不在我的書桌上留下任何字句，也從不扭亮任何一點(diǎn)燈光。我依舊像從前那樣：在母親轉(zhuǎn)動(dòng)門把的時(shí)候翻過(guò)身去面對(duì)墻壁，瞇著雙眼；我依然不敢貿(mào)然起身驚動(dòng)母親，依然沒(méi)有勇氣在那樣的時(shí)刻里與母親的眼神相對(duì)。

目前關(guān)于酵母中fat1p基因功能的研究主要集中在S.cerevisiae和Y.lipolytica中。通過(guò)NCBI分別檢索S.cerevisiae中Ssfat1p（NCBI No.：AJQ08071.1，669 aa）和Y.lipolytica中Ylfat1p（NCBI No.：SEI35013.1，639aa）蛋白的氨基酸序列，并利用Geneious進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，C.tropicalis中Ctfat1p蛋白的氨基酸序列與Ssfat1p和Ylfat1p的一致性均為50%。但Ssfat1p和Ylfat1p的功能并不完全相同[21]，因此C.tropicalis中的Ctfat1p蛋白的具體功能還需要進(jìn)一步探究。

圖2 氨基酸序列相似性分析Fig.2 Analysis of amino acid sequence similarity

2.2 基因敲除片段ctfat1p1-kanr的構(gòu)建、電轉(zhuǎn)化及鑒定

以C.tropicalis1798菌體的基因組DNA為模板，使用引物Fat1p F1和Fat1p R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3（a）。由圖3（a）可知，在500 bp左右出現(xiàn)特異性電泳條帶，與理論長(zhǎng)度551 bp相符，表明以成功獲得用于ctfat1p基因敲除的同源臂ctfat1p1；以質(zhì)粒pPIC9k為模板，使用引物Kan F2和Kan R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3（b）。由圖3（b）可知，在1500bp左右出現(xiàn)特異性電泳條帶，與理論長(zhǎng)度1 523 bp相符，表明已成功獲得G418抗性基因片段kanr；以膠回收制得的ctfat1p1片段與制得的kanr片段為模板，F(xiàn)at1p F1和Kan R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行重疊延伸PCR，制得基因敲除片段ctfat1p1-kanr，1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖3（c）。由圖3（c）可知，在2 000 bp左右出現(xiàn)特異性電泳條帶，與理論長(zhǎng)度2 074 bp相符，表明基因敲除片段ctfat1p1-kanr構(gòu)建成功。

使用EcoRI對(duì)300 μL融合PCR產(chǎn)物進(jìn)行單酶切，并使用乙醇沉淀法濃縮獲得酶切片段，使用核酸超微量分光光度計(jì)測(cè)定回收DNA質(zhì)量濃度，結(jié)果顯示，DNA質(zhì)量濃度為532.18 ng/μL。將20 μL回收片段與80 μLC.tropicalis 1798感受態(tài)細(xì)胞混合并電轉(zhuǎn)化，并使用引物KanF2和KanR2對(duì)含G418平板上生長(zhǎng)菌落的基因組進(jìn)行驗(yàn)證，1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖3（d）。由圖3（d）可知，表明ctfat1p1-kanr已同源重組至C.tropicalis1798基因組中，并完成ctfat1p基因的敲除。

圖3 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR products

2.3 以油脂為底物C.tropicalis1798和C.tropicalis1798△ctfat1p的發(fā)酵驗(yàn)證

菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后加入10%油脂，每12 h調(diào)節(jié)pH到7.5，產(chǎn)酸期6 d。用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，測(cè)得二元酸的質(zhì)量濃度，結(jié)果表明，C.tropicalis1798△ctfat1p比C. tropicalis1798產(chǎn)二元酸的量明顯降低，其產(chǎn)量為1.83 g/L，比C.tropicalis1798產(chǎn)二元酸降低了65.3%。fat1p基因具有轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸的功能，fat1p基因敲除后，菌體轉(zhuǎn)化脂肪酸的效率降低從而影響二元酸的產(chǎn)量。測(cè)定C.tropicalis1798△ctfat1p二元酸的產(chǎn)量可初步推測(cè)ctfat1p基因的功能。

2.4 C.tropicalis1798和C.tropicalis1798△ctfat1p生長(zhǎng)速率分析

產(chǎn)量降低的原因可能為ctfat1p基因敲除后減弱了細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝取，為進(jìn)一步驗(yàn)證ctfat1p基因的功能，分別以葡萄糖、十二烷、十六烷和油脂為唯一碳源對(duì)C.tropicalis 1798和C.tropicalis1798△ctfat1p菌株菌體的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行測(cè)定。

將C.tropicalis1798和C.tropicalis1798△ctfat1p接種于50 mL發(fā)酵液體培養(yǎng)基，接種量為2%，30℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)，每個(gè)菌做3個(gè)平行，每隔2 h取樣并檢測(cè)其OD600nm值繪制生長(zhǎng)曲線。

由圖4可知，以葡萄糖為唯一碳源時(shí)，兩個(gè)菌的生長(zhǎng)速度基本一致，10 h后生長(zhǎng)均進(jìn)入穩(wěn)定期（見(jiàn)圖4a），表明ctfat1p基因的敲除對(duì)葡萄糖的代謝影響不大；以十二烷為唯一碳源時(shí)，兩個(gè)菌的生長(zhǎng)速度基本一致，10 h后生長(zhǎng)均進(jìn)入穩(wěn)定期，14 h后由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏導(dǎo)致菌體自溶，OD600nm值下降，進(jìn)入衰退期（見(jiàn)圖4b），而以十六烷為唯一碳源時(shí)，兩個(gè)菌的生長(zhǎng)速度基本一致，12 h后生長(zhǎng)均進(jìn)入穩(wěn)定期，14 h后由于缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致菌體自溶，OD600nm值下降，進(jìn)入衰退期（見(jiàn)圖4c），表明ctfat1p基因的敲除對(duì)烷烴的代謝影響不大；以油脂為唯一碳源時(shí)，C.tropicalis1798△ctfat1p的生長(zhǎng)速度明顯滯后，生長(zhǎng)緩慢（見(jiàn)圖4d），培養(yǎng)12 h時(shí)重組菌OD600nm僅為野生型菌株的47.9%，由此可知，ctfat1p基因?yàn)闊釒Ъ俳z酵母油脂吸收的關(guān)鍵基因。

圖4 C.tropicalis1798和C.tropicalis1798△ctfat1p生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve ofC.tropicalis1798 andC.tropicalis1798△ctfat1p

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用PCR擴(kuò)增技術(shù)獲取熱帶假絲酵母ctfat1p基因同源臂ctfat1p1、抗性標(biāo)簽G418基因kanr，借助重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建熱帶假絲酵母ctfat1p基因敲除載體（ctfat1p1-kanr），通過(guò)一次同源重組即可實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除；構(gòu)建的敲除片段僅包含兩段序列即同源臂和抗生素抗性標(biāo)簽基因，構(gòu)建流程簡(jiǎn)單，基因敲除周期短、不依賴于敲除載體，并有效降低敲除成本，提高工作效率。

對(duì)ctfat1p基因敲除菌株經(jīng)過(guò)初步發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)：以油脂為底物發(fā)酵生產(chǎn)二元酸時(shí)重組菌株C.tropicalis1798△ctfat1p比原始菌株C.tropicalis1798產(chǎn)二元酸的量明顯降低，其產(chǎn)量為1.83 g/L，比C.tropicalis1798產(chǎn)二元酸降低了65.3%；在以葡萄糖、十二烷、十六烷為唯一碳源時(shí)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)影響很小。在生長(zhǎng)初期，突變株的生長(zhǎng)速度略慢于原始菌株，這與釀酒酵母類似[22-23]，說(shuō)明ctfat1p基因?qū)τ诰S持熱帶假絲酵母正常生長(zhǎng)起到一定的作用，敲除后細(xì)胞的生長(zhǎng)能力減弱。在以油脂為唯一碳源時(shí)突變株的生長(zhǎng)速度明顯滯后，即不能有效利用油脂作碳源，細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂肪酸的能力變?nèi)?。因此，推測(cè)C.tropicalis1798中的ctfat1p基因?yàn)橛椭盏年P(guān)鍵基因。

此外，熱帶假絲酵母雖然具有有性生殖的過(guò)程[24]，但此過(guò)程較難發(fā)生，且其單倍體階段不能長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，最終會(huì)轉(zhuǎn)變成二倍體。優(yōu)良性狀的純合二倍體可以減少變異的發(fā)生，維持穩(wěn)定的發(fā)酵性能。因此，獲取酵母的單倍體對(duì)于熱帶假絲酵母這類二倍體生物的菌種改良工作來(lái)說(shuō)是十分重要的。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)C.tropicalis1798中的ctfat1p基因進(jìn)行了單拷貝敲除，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中需要構(gòu)建雙敲除載體對(duì)ctfat1p基因進(jìn)行雙拷貝敲除和增加ctfat1p基因拷貝數(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證ctfat1p基因的功能。

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Function of genectfat1pinCandida tropicalison the absorption of aliphatic compounds

SHI Ying,YANG Xiaohui,MA Chunling,WANG Tengfei,XIAO Jing,WANG Ruiming,WANG Junqing*
(Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering,School of Bioengineering,Qilu University of Technology, Jinan 250353,China)

Using the genectfat1pinCandida tropicalis1798 as research object,the 500 bp genectfat1pfragment was connected with G418 resistance gene(kanr)by using overlapping PCR.After a single enzyme digestion at the end of the fragment,then the recombinant gene fragment was transformed intoC.tropicalis1798 competent cells.Through a homologous single exchange,the resistance genekanrwas inserted into the genectfat1p,and then the target gene was knocked successfully.The function of Ctfat1p in the process of fatty acid transmembrane-movement ofC.tropicaliswas analyzed by fermentation experiments.The results showed that a genectfat1pdeletion strain(namedC.tropicalis1798Δctfat1p)was obtained successfully by G418 resistance screening and genome PCR identification.The analysis was founded that the OD600nmvalue ofC.tropicalis1798Δctfat1pwith oil as the substrate culturing for 12 h was only 47.9%of the wild type strain,which indicated that deletion of genectfat1paffected absorption and utilization ofC.tropicalis1798 on oil.The establishment of gene ctfat1pdeletion strain by the gene knockout method could weaken intake of cell on long chain fatty acid,which verified that the genectfat1pwas a key gene of the absorption and utilization ofC.tropicalison oil.

genectfat1p;Candida tropicalis;gene knockout;homologous single exchange

Q815

0254-5071（2017）03-0132-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.027

2016-12-14

山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)（No.201422CX02602）

石瑩（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锩讣夹g(shù)。

*通訊作者：汪俊卿（1988-），男，講師，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程和微生物酶技術(shù)。