重組開菲爾菌粒發(fā)酵性能及菌相組成研究

高潔，孫靜，黃建，何國慶，龔凌霄，霍軍生*

（1.中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與健康所，北京100050；2.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江杭州310058；3.北京工商大學食品學院，北京100048）

重組開菲爾菌粒發(fā)酵性能及菌相組成研究

高潔1，孫靜1，黃建1，何國慶2，龔凌霄3，霍軍生1*

（1.中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與健康所，北京100050；2.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江杭州310058；3.北京工商大學食品學院，北京100048）

為了簡化開菲爾混菌發(fā)酵體系的菌種復雜程度，并保留開菲爾特有的發(fā)酵風味，對來源于拉薩、成都、烏魯木齊、西寧4個地區(qū)的開菲爾菌粒進行了重組培養(yǎng)，得到重組菌粒TK-ZJUJ06。高通量測序分析檢測到其細菌菌相組成為8個屬，分別為乳桿菌屬(39.46%)、明串珠菌屬(0.62%)、乳球菌屬(43.28%)、鏈球菌屬(0.54%)、醋酸菌屬(11.53%)、希瓦氏菌屬(0.67%)、不動桿菌屬(0.05%)以及假單胞菌屬(0.14%)；生理生化培養(yǎng)方法及26S rDNA序列分析測得其酵母菌相為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。發(fā)酵性能及揮發(fā)性成分分析結果表明，該重組菌粒發(fā)酵性能優(yōu)良，酸度117°T，揮發(fā)性脂肪酸含量65%。與對照相比，菌相組成簡單，并能夠保留開菲爾特有的發(fā)酵風味。

開菲爾；重組菌粒；微生物組成；發(fā)酵性能；揮發(fā)性成分

開菲爾（kefir）是高加索山脈及我國西藏、新疆等地傳統(tǒng)的發(fā)酵乳制品，是由天然形成的開菲爾菌粒對牛、羊乳等發(fā)酵而成。開菲爾菌粒為乳白色，有彈性的膠裝顆粒，該顆粒由多種乳酸菌、醋酸菌、酵母菌等混菌附著在其分泌的胞外多糖等代謝產物上而形成[1]。在自然環(huán)境下，開菲爾菌粒的形成條件十分特殊，據傳最初是在牧民的馬奶酒囊中發(fā)現(xiàn)。目前已有研究對其形成機制進行了探索和推斷，微生物產生的胞外多糖被認為是最初的“粘合劑”[2]，使不同的菌相得以互相附著，它們又分泌各自的代謝產物，如蛋白質、脂肪等物質，構成顆粒的基質成分[3]，菌體與代謝產物不斷堆積，逐漸形成相對獨立的微生態(tài)系統(tǒng)[4]。發(fā)酵過程同時具有乳酸發(fā)酵[5]、醋酸發(fā)酵和酵母菌進行的酒精發(fā)酵[6]，不僅形成了獨特的風味，更具有對健康有益的特性。然而，由于天然混菌體系的復雜性，人們在用各種手段進行菌相分析時，也發(fā)現(xiàn)了一些風險菌甚至未知菌，如假單胞菌屬，希瓦氏菌屬等[1]。它們在發(fā)酵體系中的作用尚不明確，又難以從體系中去除，導致無法控制其發(fā)酵過程，也就無法進行工業(yè)化生產，極大阻礙了開菲爾飲品的發(fā)展。

在現(xiàn)代的醫(yī)藥化工領域，發(fā)酵過程一般采用純種發(fā)酵[7]，而傳統(tǒng)發(fā)酵食品，純種發(fā)酵難以達到生產需求[8]，其復雜的成分和特有的風味往往是多個菌相共同發(fā)酵的產物[9]。開菲爾菌粒形成環(huán)境特殊，人工純菌復配形成的混菌體系很難形成相似的顆粒。本研究將不同地區(qū)來源的開菲爾菌粒進行混合重組，通過酸度及凝乳測定觀察發(fā)酵性能和菌粒形成情況，采用高通量測序及傳統(tǒng)分離純化培養(yǎng)相結合的方法觀察菌相變化，以評價重組開菲爾菌粒的特性，為其菌相的簡化提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

開菲爾菌粒（TK-ZJUJ01、TK-ZJUJ02、TK-ZJUJ03、TK-ZJUJ01-04）：分別來源于拉薩、成都、烏魯木齊、西寧。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DG115 CGMCC NO.3262：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

脫脂乳培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基、生理生化試驗培養(yǎng)管：杭州微生物試劑有限公司。

核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）A、苯酚、氯仿、異丙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；Taq酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）Marker、MgCl2、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）Buffer、溶菌酶、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、瓊脂糖：美國Sigma試劑公司。

1.2 儀器與設備

Kjeltec 2300型全自動凱氏定氮儀：丹麥FOSS公司；6890-5973型色譜質譜聯(lián)用儀：美國惠普公司；菲羅門ZB-5 MS色譜柱（25 mm×30 m×0.5 μm）：美國Phenomenex公司；Nanodrop-1000微量紫外分光光度計：美國賽默飛（THERMO）公司；Illumina HiSeq 2000 DNA測序儀：美國Illumina公司；ALS-1296 PCR儀：伯樂（BioRad）生命醫(yī)學產品有限公司。1.3方法

1.3.1 開菲爾菌粒復配培養(yǎng)

將不同來源的開菲爾菌粒無菌研磨至絮狀后進行不同組合的等量重組培養(yǎng)（見表1），按照5%接種量加入滅菌脫脂乳中，28℃恒溫培養(yǎng)，每24 h傳代一次，連續(xù)培養(yǎng)7 d。

表1 開菲爾菌粒復配組合比例Table 1 Compound composite ratio of kefir grains

1.3.2 發(fā)酵性能測定

根據國家標準GB19302—2010《發(fā)酵乳》和GB5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測定》[10-11]，測定重組菌粒11～15，考察5個重組樣品的發(fā)酵能力：包括是否凝乳、是否產氣、乳清析出情況、酸度、蛋白含量等。以原始開菲爾菌粒TK-ZJUJ03為對照（CK）。

酸度數(shù)值以采用吉爾涅爾度（°T）表示，其計算公式如下：

式中：X為酸度，°T；c為NaOH標準液物質的量濃度，mol/L；V為消耗NaOH標準液體積，mL；m為試樣質量，g；0.1為酸度理論定義NaOH物質的量濃度，mol/L。

蛋白含量采用凱氏定氮法測定，其計算公式如下：

式中：X為蛋白質含量，g/100 g；V1為消耗H2SO4或HCl標準液的體積，mL；V2為空白消耗H2SO4或HCl標準液的體積，mL；V3為吸取消化液的體積，mL；c為H2SO4或HCl標準液濃度，mol/L；0.014 0為1.0 mL H2SO4標準液相當?shù)牡馁|量，g；m為試樣質量，g；F為氮換算為蛋白質的系數(shù)，純乳與純乳制品為6.38。

1.3.3 菌種組成分析

選擇發(fā)酵性能優(yōu)良的復配菌粒，按照5%接種量加入脫脂乳培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)，每24 h傳代一次，連續(xù)培養(yǎng)30 d后，進行菌種組成分析。對于細菌，參照高潔等[12]的方法提取樣品中總DNA，PCR擴增16S rDNA V6區(qū)，并進行高通量測序鑒定。

細菌16SrDNAV6區(qū)通用引物：上游-967F（5′-CAACG CGAAGAACCTTACC-3′）；下游-1046R（5′-CGACAGCC ATGCANCACCT-3′）。

對于酵母菌，采用平板涂布法進行傳統(tǒng)分離純化培養(yǎng)[13]，將菌粒進行無菌研磨，生理鹽水稀釋后涂布于YPD瓊脂培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)，對分離到的單菌落進行生理生化鑒定和26S rDNA序列分析。

酵母菌26S rDNA通用引物：上游-NL1（5′-GCCATAT CAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）；下游-LS2（5′-ATTCC CAAACAACTCGACTC-3′）。

1.3.4 揮發(fā)性成分測定

選擇發(fā)酵性能優(yōu)良、能夠形成顆粒且菌相組成相對簡化的重組菌粒，在28℃恒溫條件下對脫脂乳發(fā)酵24 h后，發(fā)酵好的開菲爾于4℃條件下后熟24 h，二氯甲烷法[14]提取揮發(fā)性成分。以原始開菲爾菌粒TK-ZJUJ03為對照（CK），采用氣質聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法分析[15]。

氣相色譜條件：菲羅門ZB-5 MS色譜柱（25 mm×30 m× 0.5 μm），載氣氮氣（He），流速0.80 mL/min；多階程序升溫：初始溫度35℃，保持時間10 min；然后3℃/min升溫至210℃，保持時間10 min；最后6℃/min升溫至230℃，保持時間5 min；進樣溫度為250℃；不分流進樣。

質譜條件：電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，檢測電壓350 V，傳輸線溫度280℃，離子源溫度230℃，離子掃描模式，29～300 m/z。

定性定量方法：GC-MS分析得到總離子流色譜圖（total ion chromatogram，TIC）后，通過計算機檢索與美國國家標準技術研究所（nationalinstituteofstandardsandtechnology，NIST）數(shù)據庫比對解譜對揮發(fā)性成分進行定性分析，根據色譜圖的出峰面積對其進行定量分析。

1.3.5 結果統(tǒng)計

利用統(tǒng)計分析軟件SPSS 16.0處理得到的數(shù)據，采用ANOVA進行方差分析，比較P值，P≥0.05為無顯著差異，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 重組開菲爾菌粒的發(fā)酵性能

不同復配組合菌粒的發(fā)酵性能如表2所示。由表2可知，在全部重組菌粒中都觀察到了不同程度的凝乳、產氣以及乳清析出的現(xiàn)象[16]，其中13和15有菌粒形成現(xiàn)象，其余各組未見菌粒形成或只觀察到絮狀物。

表2 不同重組開菲爾菌粒的發(fā)酵性能Table 2 Fermentation performance of recombination kefir grains

微生物產生代謝產物的種類和數(shù)量與環(huán)境密切相關，特別是有些物質是多種微生物共同代謝的結果，因此，不同環(huán)境下的開菲爾菌粒的菌相和基質成分不盡相同。此外，至今尚有某些未知菌相和基質成分，使得這一問題更加復雜化，推測也是人工純菌復配培養(yǎng)未見形成顆粒的原因。

選擇有顆粒形成的重組菌粒13和15，以及對照菌粒CK進一步測定其酸度和蛋白含量結果見圖1。由圖1可知，其酸度分別為128°T、117°T和79°T，蛋白含量分別為2.6%、2.1%和2.4%。國標GB19302—2010中對酸牛乳酸度的規(guī)定為≥70°T，重組開菲爾菌粒發(fā)酵完成后的酸度值結果表明，其產酸能力能夠達到國家標準對發(fā)酵乳的要求。將菌粒13命名為TK-ZJUJ05，菌粒15命名為TK-ZJUJ06，做進一步研究。

圖1 不同開菲爾菌粒發(fā)酵乳的酸度及蛋白質含量Fig.1 Acidity and protein contents of fermented milk by different kefir grains

2.2 重組開菲爾菌粒的菌相變化

2.2.1 細菌菌相組成

原始開菲爾菌粒TK-ZJUJ03、重組菌粒TK-ZJUJ05的細菌菌相分析結果已經在本作者前期文獻中發(fā)表[11-12]。菌粒TK-ZJUJ06的高通量測序結果見表3。

表3 高通量測序結果Table 3 Results of high throughput sequencing

對下機數(shù)據進行拼接和分析得到與物種對應的片段tags進行物種注釋。在確定分類水平時，基本原則是能注釋到的分類等級盡量低，并且能注釋到的tags數(shù)量盡量多。而實際情況是可以比對的tags數(shù)量會隨著注釋等級的降低而減少。計算結果發(fā)現(xiàn)，能注釋到“屬”水平的tags有95%，而能注釋到“種”水平的tags少于1%，因此，綜合注釋原則和實際情況考慮，選擇注釋到“屬”。使用BLASTN軟件包[17]對tags進行序列比對和物種分析，物種注釋結果見圖2。由圖2可知，目標菌粒中比對得到8個屬，各屬及其比例分別為：乳桿菌屬（Lactobacillus）（39.46%），明串珠菌屬（Leuconostoc）（0.62%），乳球菌屬（Lactococcus）（43.28%），鏈球菌屬（Streptococcus）（0.54%），醋酸菌屬（Acetobacter）（11.53%），希瓦氏菌屬（Shewanella）（0.67%），不動桿菌屬（Acinetobacter）（0.05%）以及假單胞菌（Pseudomonas）（0.14%）。其中，乳桿菌屬（Lactobacillus），乳球菌屬（Lactococcus）和醋酸菌屬（Acetobacter）為該重組菌粒中的優(yōu)勢菌屬，也是食品中常見的菌屬，而其余各屬（Streptococcus中只有Streptococcus thermophilus被認可）不在《可用于食品的菌種名單》（衛(wèi)辦監(jiān)督發(fā)〔2010〕65號）中，暫定其為風險菌。

圖2 細菌菌相組成Fig.2 Composition of bacterial flora

經過多次傳代培養(yǎng)后，重組開菲爾菌粒逐漸形成一個新的微生態(tài)系統(tǒng)，與CK比較可知，原有優(yōu)勢菌相在新體系中組成穩(wěn)定（圖2）：TK-ZJUJ03中有乳桿菌屬（Lactobacillus）47.89%，乳球菌屬（Lactococcus）40.93%，醋酸菌屬（Acetobacter）4.50%，合計93.32%；TK-ZJUJ05中有乳桿菌屬（Lactobacillus）5.01%，乳球菌屬（Lactococcus）74.13%，醋酸菌屬（Acetobacter）9.86%，合計89%；TK-ZJUJ06中有乳桿菌屬（Lactobacillus）39.46%，乳球菌屬（Lactococcus）43.28%，醋酸菌屬（Acetobacter）11.53%，合計94.27%。非優(yōu)勢菌相在新微生態(tài)系統(tǒng)形成過程中有所損失：原始菌粒中的Dysgonomonas、Pelomonas和Weissella三個屬在重組后的新菌粒中未見出現(xiàn)。

重組kefir菌粒與CK風險菌比例見表4。由表4可知，重組菌粒TK-ZJUJ06，風險菌比例顯著下降。Dysgonomonas、Pelomonas和Weissella三個屬在原始菌粒TK-ZJUJ03中沒有檢測到，但在其它原始菌粒中有不同比例的出現(xiàn)，相關數(shù)據發(fā)表在作者前期的研究中[11-12]，表面在重組的過程中形成了新的微生態(tài)系統(tǒng)。對照組的風險菌所占比例為4.34%，重組菌粒TK-ZJUJ05的風險菌所占比例為7.04%，而重組菌粒TK-ZJUJ06的風險菌所占比例為2.02%，該比例顯著低于原始菌粒，符合本實驗中重組篩選的方向。

表4 重組開菲爾菌粒與對照組風險菌比例Table 4 Proportion of risky bacteria in recombined kefir grains and the contrast

2.2.2 酵母菌分離鑒定

TK-ZJUJ05和TK-ZJUJ06在YPD培養(yǎng)基上共分離得到純培養(yǎng)57株，分別進行生理生化鑒定，并與標準菌株對比，結果見表5。根據酵母菌的鏡檢結果、是否產孢子、發(fā)酵試驗[18]以及標準菌株試驗結果，YPD培養(yǎng)基上得到的純培養(yǎng)物共分為6組：TK-ZJUJ05 Y1～TK-ZJUJ05 Y3，TK-ZJUJ06 Y1～TK-ZJUJ06 Y3。初步鑒定結果表明，6組菌株生理生化特性相似，均為酵母菌屬（Saccharomyces）。

表5 TK-ZJUJ05和TK-ZJUJ06中酵母菌屬生理生化試驗結果Table 5 Results of physiological and biochemical experiments of yeasts from TK-ZJUJ05 and TK-ZJUJ06

在生理生化鑒定結果的基礎上，進行26S rDNA序列分析。提取純培養(yǎng)物DNA，使用1.3.3中的酵母序列引物擴增目的片段，對PCR產物測序并與美國國家生物技術信息中心NCBI數(shù)據庫信息比對，利用BioEdit 7.0.9和MEGA 4.1序列分析軟件處理數(shù)據，鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建進化樹（見圖3）。結合生理生化鑒定結果發(fā)現(xiàn)，兩個重組菌粒中只分離得到一種酵母菌，為釀酒酵母菌（Saccharomyce cerevisiae）。與細菌組成多樣性程度降低相類似，在不同菌粒重新組合培養(yǎng)過程中，來源不同的多種酵母菌之間也存在競爭排斥，導致某些酵母菌被淘汰。釀酒酵母（S.cerevisiae）在菌粒微生態(tài)系統(tǒng)的形成與維持中有重要作用，也是開菲爾起泡性和獨特風味的重要來源。在已有的對開菲爾進行純菌發(fā)酵的嘗試中，釀酒酵母是不可缺少的重要菌相[19]。

圖3 TK-ZJUJ05(A)及TK-ZJUJ06(B)中酵母菌進化樹圖譜Fig.3 Cladogram of yeasts from TK-ZJUJ05(A)and TK-ZJUJ06(B)

菌種組成研究表明，在復配培養(yǎng)的過程中，與原有天然菌粒相比，重組菌粒TK-ZJUJ06細菌組成多樣性程度下降，優(yōu)勢菌相組成保持穩(wěn)定，風險菌組成比例降低；酵母菌組成被簡化，只分離得到單一菌種釀酒酵母（S.cerevisiae）。同時，該菌粒保持了開菲爾菌特有的顆粒狀態(tài)、發(fā)酵乳的凝乳性和特有的起泡性。這正符合篩選標準：在菌相組成盡可能簡單的情況下，保持開菲爾發(fā)酵乳的組織狀態(tài)和特性，以便更好的控制其發(fā)酵過程和代謝產物的穩(wěn)定性。在此基礎上，對TK-ZJUJ06的發(fā)酵風味做進一步研究。

2.3 TK-ZJUJ06發(fā)酵乳揮發(fā)性成分分析

采用氣質聯(lián)用法（GC-MS）進行揮發(fā)性成分測定，分析比較TK-ZJUJ06和CK發(fā)酵乳的揮發(fā)性成分組成。其中揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖見圖4，經數(shù)據庫比對解譜得到二者的揮發(fā)性成分組成見表6。

表6 TK-ZJUJ06和對照組開菲爾揮發(fā)性組分相對含量Table 6 Relative contents of volatile components of kefir from TK-ZJUJ06 and the contrast

風味是影響食品質量的重要指標。對于發(fā)酵乳而言，其中主要呈味物質是乳酸，形成了酸奶共有的風味，而不同品種的發(fā)酵乳獨特的風味則是由多種復雜的物質復合而成，其中揮發(fā)性物質所起到的作用尤為重要。對TK-ZJUJ06發(fā)酵乳揮發(fā)性成分解譜，共鑒定到13種揮發(fā)性化合物，分別是烷烴類7種，脂肪酸類5種以及其他物質1種，其中烷烴類物質（如十九烷、二十烷等），以及脂肪酸類物質在乳酸菌發(fā)酵產物中已有報道或較為常見[20-21]；酚類物質在普通發(fā)酵乳中出現(xiàn)較少，但在酵母進行的乙醇發(fā)酵過程中產生較多，而開菲爾的發(fā)酵特性正是存在酵母進行的乙醇發(fā)酵；酸類物質在發(fā)酵乳中普遍存在。

圖5 不同開菲爾中揮發(fā)性組分相對含量比較Fig.5 Comparison of relative contents of volatile components from different kefir

由圖5可知，與CK相比，TK-ZJUJ06發(fā)酵乳中烷烴類物質所占比例下降，脂肪酸類物質相對含量較高，酚、酸類物質組成差異不大。除CK中的（Z,Z）-9,12-十八烷二烯酸外，重組菌粒開菲爾中所含有的脂肪酸種類與對照組相同。上述結果表明，重組菌粒能夠較好的保留開菲爾特有的發(fā)酵風味，其揮發(fā)性脂肪酸含量較CK有所升高，能帶來更好的口感。

3 結論

來自于拉薩、成都、烏魯木齊和西寧四個地區(qū)的開菲爾菌粒等量復配培養(yǎng)，得到了最優(yōu)重組菌粒TK-ZJUJ06。與原始菌粒相比，該菌粒菌種組成簡化：細菌組成中乳桿菌屬（Lactobacillus），乳球菌屬（Lactococcus）及醋酸菌屬（Acetobacter）等優(yōu)勢菌相組成穩(wěn)定，占細菌總數(shù)的94.27%，風險菌比例顯著下降，占細菌總數(shù)的2.02%，酵母菌組成為單一的釀酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）；發(fā)酵性能穩(wěn)定并較好的保留了開菲爾特有的發(fā)酵特性和風味。在發(fā)酵風味保留較好的情況下，簡化的菌相組成更有利于代謝產物的穩(wěn)定性和發(fā)酵過程的控制，因此可以作為進一步工業(yè)馴化的菌種深入研究。

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Fermentation performance and microbial composition of recombination kefir grain

GAO Jie1,SUN Jing1,HUANG Jian1,HE Guoqing2,GONG Lingxiao3,HUO Junsheng1*
(1.National Institute for Nutrition and Health,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 100050,China; 2.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China; 3.School of Food and Chemical Engineering,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

In order to simplify the microbial complexity in kefir fermentation system and keep the unique flavor of kefir,a recombination kefir grain TK-ZJUJ06 was got by restructuring cultivation of kefir grains from Lhasa,Chengdu,Urumchi and Xining.By high throughput sequencing analysis, there are 8 genera in the bacteria composition,Lactobacillus(39.46%),Leuconostoc(0.62%),Lactococcus(43.28%),Streptococcus(0.54%),Acetobacter(11.53%),Shewanella(0.67%),Acinetobacter(0.05%),andPseudomonas(0.14%),respectively.The yeasts were detected asSaccharomyces cerevisiaeby physiology and biochemistry experiments and 26S rDNA sequential analysis.The results of fermentation performance and volatile components analysis showed that the fermentation performances of recombinant strains were good with acidity 117°T and volatile fatty acids content 65%.Compared with the contrast,recombination grain TK-ZJUJ06 had a simple composition of microorganism,and kept the unique flavor of kefir.

kefir;recombination kefir grain;microbial composition;fermentation performance;volatile components

TS252.54

0254-5071（2017）03-0126-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.026

2016-12-09

高潔（1983-），女，助理研究員，博士，研究方向為益生菌，腸道微生態(tài)。

*通訊作者：霍軍生（1962-），男，研究員，博士，研究方向為食品生物技術，強化食品。