黑曲霉胺氧化酶的粗酶液酶學(xué)特性及降解生物胺的研究

黃瑤，朱霞，彭銘燁，付彩霞，周夢(mèng)舟，高冰，李冬生，徐寧*

黑曲霉胺氧化酶的粗酶液酶學(xué)特性及降解生物胺的研究

黃瑤1，朱霞1，彭銘燁1，付彩霞2，周夢(mèng)舟1，高冰1，李冬生1，徐寧1*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430068；2.湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司，湖北宜昌443000）

選取黑曲霉SPFJ05為實(shí)驗(yàn)菌種，誘導(dǎo)其產(chǎn)生胺氧化酶。對(duì)誘導(dǎo)的黑曲霉菌體破碎后得到含有胺氧化酶的粗酶液，研究粗酶的部分酶學(xué)性質(zhì)并用粗酶液對(duì)自制醬油和市售醬油進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，粗酶的最適溫度為35℃；最適pH值為7.0；1.0 mmol/L的Cu2+對(duì)酶活有激活作用；常見(jiàn)的抑制劑乙二胺四乙酸（EDTA）和巰基乙醇對(duì)酶活有明顯抑制效果；底物特異性方面，該酶對(duì)正己胺的降解率最大為116%，對(duì)尸胺的降解率最差為16%。粗酶液對(duì)自制醬油中總生物胺的降解率達(dá)到78.29%，對(duì)市售醬油中總生物胺的降解率達(dá)到69.50%。該實(shí)驗(yàn)為發(fā)酵醬制品中生物胺的去除提供了新的途徑。

黑曲霉；生物胺；胺氧化酶；醬油

生物胺存在于各類(lèi)食品中，如水果、蔬菜、肉類(lèi)、牛奶和魚(yú)等本身就含有低濃度的生物胺，但生物胺的形成主要是由氨基酸經(jīng)過(guò)脫羧作用形成的，所以在蛋白質(zhì)、氨基酸含量豐富的尤其是發(fā)酵食品（如葡萄酒、奶酪）中生物胺含量較高。當(dāng)人體攝入過(guò)量的生物胺（尤其是同時(shí)攝入多種生物胺）時(shí)，會(huì)引起諸如頭痛、心悸、呼吸紊亂等過(guò)敏反應(yīng)，嚴(yán)重的還會(huì)危及生命[1-5]。發(fā)酵豆制品（醬油、豆豉）和發(fā)酵肉制品（香腸、火腿）的發(fā)酵過(guò)程中有可能產(chǎn)生高含量的生物胺，這些發(fā)酵食品由于原料蛋白質(zhì)豐富，成品氨基酸含量高，因此產(chǎn)生的生物胺種類(lèi)較多，含量較高[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自不同生產(chǎn)廠家的40種醬油中都含有不同程度的生物胺，其中主要是酪胺、組胺、精胺、亞精胺、尸胺等五種生物胺含量較高[8]。由于生物胺的過(guò)量攝取對(duì)人體健康有影響，再加上現(xiàn)在社會(huì)各界食品安全問(wèn)題的尤為關(guān)注，因此如何控制發(fā)酵食品中生物胺的含量也就成了一個(gè)亟需解決的問(wèn)題。

目前對(duì)于發(fā)酵肉制品中生物胺的防治研究較多，如魚(yú)露、發(fā)酵香腸生產(chǎn)中通過(guò)冷凍、輻射從而減少食品中生物胺的累積[9-10]，此外多種微生物含有降解生物胺的胺氧化酶，該酶可催化生物胺分解為乙醛、氨和過(guò)氧化氫，如沙克乳桿菌（Lactobacillus sakei）可減少組胺的積累[11]，干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）可去除酪胺[12]，微球菌屬的某些種可降解酪胺，亞麻短桿菌（Brevibacterium linens）可減少組胺與酪胺的含量[13]，木糖葡萄糖球菌（Staphylococcus xylosus）也可以降解組胺與酪胺[14]。

黑曲霉（Aspergillus niger）是生產(chǎn)豆醬、白酒、食醋等發(fā)酵食品常用的安全菌種，也是發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶）和有機(jī)酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）的主要菌種。有研究報(bào)道指出黑曲霉中含有產(chǎn)胺氧化酶的基因，只需要給予合適的誘導(dǎo)環(huán)境就可以誘導(dǎo)出胺氧化酶[15]。已有研究從A.nigerAKU3302中提取出胺氧化酶，并對(duì)其酶學(xué)特性等進(jìn)行了初步研究，但其應(yīng)用于發(fā)酵食品中生物胺的制的研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)的目的是研究一株從中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離篩選出的降解生物胺能力較強(qiáng)的黑曲霉SPFJ05菌株所產(chǎn)胺氧化酶粗酶的酶學(xué)性質(zhì)、對(duì)不同種類(lèi)生物胺的降解特性力，以及對(duì)醬油樣品中生物胺降解能力的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）SPFJ05：湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心保藏。愈創(chuàng)木酚、正丁胺、正己胺、芐胺、正戊胺：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；辣根過(guò)氧化物酶、尸胺、腐胺、精胺、亞精胺、酪胺、組胺、苯乙胺、色胺：美國(guó)Sigma Aldrich公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HUP系列超聲細(xì)胞破碎儀：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；WFJ2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司；LS-100HJ滅菌鍋：河南兄弟儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 粗酶的酶學(xué)性質(zhì)

黑曲霉培養(yǎng)、胺氧化酶誘導(dǎo)及粗酶提?。簭暮谇剐泵娼臃N1～2環(huán)孢子到種子培養(yǎng)基（裝液量50 mL/250 mL），30℃、180 r/min培養(yǎng)36 h進(jìn)行活化。菌體生長(zhǎng)培養(yǎng)條件：取體積分?jǐn)?shù)1%種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，180 r/min培養(yǎng)36 h。誘導(dǎo)培養(yǎng)方法參照周小虎等[16]研究，誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)條件：取體積分?jǐn)?shù)1%發(fā)酵液接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基，30℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。

取1 g的菌絲加入10 mL離心管中，加入5 mL磷酸鉀緩沖液，進(jìn)行冷凍超聲破碎，超聲功率為60%，間隔為2 s，時(shí)間5 min。得到的粗酶液10 000 r/min離心1 min，取上清液即得粗酶液，再用pH 7.0的磷酸鉀定容，4℃保存待用。

胺氧化酶先作用于胺類(lèi)生成相應(yīng)的醛類(lèi)、H2O2和氨，然后使用辣根過(guò)氧化物酶催化釋放的H2O2產(chǎn)生氧氣，使無(wú)色的愈創(chuàng)木酚氧化成紅棕色的四鄰甲氧基連酚。該產(chǎn)物在波長(zhǎng)470 nm處有最大的光吸收，可通過(guò)測(cè)定ΔA470nm間接表示胺氧化酶的活力[17-18]。3 mL反應(yīng)體系包括0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.0），0.2 mmol/L正丁胺，0.2 mg/mL辣根過(guò)氧化物酶，0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚，100 μL稀釋酶液。25℃條件下檢測(cè)波長(zhǎng)470 nm處的吸光度值變化（ΔA470nm）。以每分鐘內(nèi)A470nm變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U）。相對(duì)酶活力以每組實(shí)驗(yàn)中所產(chǎn)酶活力最高為100%。

胺氧化酶粗酶最適溫度：分別取5支試管加入等體積粗酶液，分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃℃水浴鍋的條件下反應(yīng)10 min，分別測(cè)定其酶活。

胺氧化酶粗酶最適pH：配制pH值為5.5、6、6.5、7、7.5、8的磷酸鉀緩沖液，分別加入等體積的粗酶液，反應(yīng)10 min，分別測(cè)定其酶活。

胺氧化酶粗酶溫度穩(wěn)定性：取等體積處理好的粗酶液置于5支試管，分別放置在25℃、35℃、45℃、55℃、65℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)，每隔30 min測(cè)定殘留酶活（以最高酶活為100%），共測(cè)定2 h。

胺氧化酶粗酶pH穩(wěn)定性：等體積酶液分別與一定量的磷酸鉀緩沖液（pH5.8～9.0范圍內(nèi)）混合，置于4℃條件下反應(yīng)24 h，取出后在35℃條件下測(cè)定其殘余酶活。

金屬離子對(duì)胺氧化酶粗酶酶活的影響：用測(cè)定體系緩沖液配制10 mmol/L不同金屬離子（NaCl、KCl、CaCl2、FeSO4、CuSO4）溶液，與酶液混合，形成1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L濃度的金屬離子，在30℃條件下反應(yīng)30min，測(cè)定殘余酶活。以不添加金屬離子時(shí)的粗酶酶活為100%酶活。

酶抑制劑對(duì)胺氧化酶粗酶酶活的影響：用測(cè)定體系緩沖液配制不同濃度（0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、1.0 mmol/L）的酶抑制劑（十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT））溶液，與等體積酶液混合，形成0.1 mol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L的酶抑制劑溶液，測(cè)定殘余酶活，以不添加酶抑制劑時(shí)的粗酶酶活為100%酶活。

1.3.2 酶底物特異性

胺類(lèi)溶液：用0.1 mol/L的HCl溶液分別配制正丁胺、正己胺、尸胺、腐胺、酪胺、組胺、苯乙胺、色胺、精胺、亞精胺、芐胺和正戊胺等12種胺類(lèi)成100 μg/mL的溶液，4℃冷藏待用。

降解率計(jì)算公式如下：

1.3.3 對(duì)醬油樣品中生物胺的檢測(cè)

取2mL實(shí)驗(yàn)室自制醬油和市售醬油樣品分別加入1mL粗酶液在35℃條件下反應(yīng)30min，分別檢測(cè)處理前（對(duì)照組）后（實(shí)驗(yàn)組）醬油中的生物胺含量，檢測(cè)方法參考鄒陽(yáng)等[19]的方法并稍加修改，采用C18色譜柱（4.6mm×250mm×5μm），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量20 μL。流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為水，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 胺氧化酶粗酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.1.1 胺氧化酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性

圖1 胺氧化酶的最適溫度（a）和溫度的穩(wěn)定性（b）Fig.1 The optimal temperature(a)and temperature stability(b)of amine oxidases

凡圖1（a）可知，胺氧化酶的最適酶溫度為35℃。在20～40℃時(shí)都保持較高活力（相對(duì)酶活81.6%以上），與肉中葡萄球菌、枯草芽孢桿菌胺氧化酶最適溫度37℃相似[20]。

由圖1（b）可知，該酶在20℃和30℃條件下有良好的穩(wěn)定性，保溫120 min后分別還有93%和88%的殘余酶活。在40℃條件下，酶活受到影響，120 min后有65%的殘余酶活；50℃和60℃溫度條件下對(duì)酶活的影響較大，120 min后分別僅有51%和38%酶活。說(shuō)明該酶在40℃下，熱穩(wěn)定性較好，50℃以上，熱穩(wěn)定較差。與報(bào)道的從A.niger中提取的胺氧化酶的溫度穩(wěn)定性基本一致[21]。

2.1.2 胺氧化酶的最適pH和pH穩(wěn)定性

由圖2（a）可知，胺氧化酶的最適pH值為7.0，過(guò)酸性或者過(guò)堿性都會(huì)導(dǎo)致胺氧化酶的酶活下降。這與報(bào)道[22-23]的從A.nigerAKU3302中提取的胺氧化酶最適pH值為7.5和從Micrococcus varians分離出的胺氧化酶最適pH在7～8是比較一致的，但是這兩類(lèi)胺氧化酶在pH值為6時(shí)都有強(qiáng)抑制作用，而本實(shí)驗(yàn)在pH值為6并沒(méi)有表現(xiàn)強(qiáng)抑制性，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異。

由圖2（b）可知，該酶在pH 6.3～7.8范圍內(nèi)具有良好的pH穩(wěn)定性（殘余酶活在83%以上）。這與YAMADA B H等[24]從黑曲霉A.niger中提取的胺氧化酶在pH 6.0～7.0保持穩(wěn)定結(jié)果較為一致。

圖2 胺氧化酶的最適pH（a）和pH穩(wěn)定性（b）Fig.2 The optimal pH(a)and pH stability(b)of amine oxidases

2.1.3 金屬離子和酶抑制劑對(duì)胺氧化酶酶活的影響

圖3 金屬離子（a）和酶抑制劑（b）對(duì)胺氧化酶酶活的影響Fig.3 Effect of different metal ions(a)and enzyme inhibitors(b)on amine oxidases activity

由圖3（a）可知，鈉鹽和鉀鹽對(duì)胺氧化酶酶活基本無(wú)影響，1 mmol/L的Cu2+對(duì)酶活有激活作用，但是當(dāng)銅鹽濃度升高，對(duì)酶活反而又有抑制作用。而鐵鹽和鈣鹽對(duì)其抑制作用比較明顯。有文獻(xiàn)報(bào)道[25]少量的Cu2+會(huì)使從葡萄球菌等提取出來(lái)的胺氧化酶酶活上升，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

由圖3（b）可知，0.5 mmol/L EDTA、巰基乙醇已經(jīng)能完全抑制胺氧化酶酶活，而EDTA在0.1 mmol/L時(shí)，抑制效果不明顯，但當(dāng)濃度越高抑制效果越明顯，到0.5 mmol/L時(shí)，相對(duì)酶活只剩下34%。

2.2 底物特異性

圖4 胺氧化酶對(duì)不同的胺類(lèi)相對(duì)降解率的影響Fig.4 Effect of different amine oxidase on degradation rates of various amines

由圖4所示，在實(shí)驗(yàn)的12種胺類(lèi)中，添加的胺氧化酶粗酶液對(duì)正己胺的降解率是最好的（116%），對(duì)尸胺的降解率是最差的（16%）。而在發(fā)酵食品常見(jiàn)的八種生物胺中（尸胺，腐胺，酪胺，苯乙胺，組胺，色胺，精胺，亞精胺），酶學(xué)底物特異性與IVO F等[22，24]的研究中提到從黑曲霉中提取出的胺氧化酶底物特異性有較大差異，特別是腐胺，兩篇文獻(xiàn)中報(bào)道的胺氧化酶酶對(duì)腐胺的降解率都在＜10%，而實(shí)驗(yàn)酶對(duì)腐胺的降解率達(dá)到了89%；文獻(xiàn)中提取得到的酶對(duì)精胺與亞精胺無(wú)降解能力，實(shí)驗(yàn)酶降解能力分別達(dá)到了38%和45%；酪胺降解率（75%）較弱于文獻(xiàn)報(bào)道（109%）；芐胺的降解率相對(duì)較弱58%，文獻(xiàn)中高達(dá)100%；其余幾種生物胺降解能力與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

2.3 對(duì)醬油樣品中生物胺的處理應(yīng)用

由表1可知，實(shí)驗(yàn)室自制醬油含有色胺、酪胺、苯乙胺、腐胺等4種生物胺，其他都未檢出。其中含量最多的為酪胺，為542.5 μg/kg，總生物胺為853.0 μg/mL。經(jīng)過(guò)粗酶液處理后，腐胺和色胺未檢出，而酪胺的降解率也到了80.78%，苯乙胺達(dá)到63.37%，總生物胺含量降低到185.1 μg/kg，總生物胺的降解率達(dá)到了78.29%。

國(guó)內(nèi)某品牌醬油樣品中測(cè)出了常見(jiàn)的8種生物胺，其種類(lèi)與MOWER H F等[26-27]的報(bào)道一致，含量略有差別。其生物胺的種類(lèi)和含量都高于實(shí)驗(yàn)室自制醬油?？赡苁窃卺u油工業(yè)化生產(chǎn)中，由于其生產(chǎn)工藝和開(kāi)放式發(fā)酵體系等原因，容易污染產(chǎn)氨基酸脫羧酶的微生物，使其生物胺的含量增加。發(fā)現(xiàn)該市售醬油樣品中腐胺、酪胺、組胺、苯乙胺是最主要的生物胺，總生物胺的含量達(dá)到了2 064 μg/kg。LU Y等[27]研究了40種醬油中的生物胺含量，發(fā)現(xiàn)的特征性生物胺有5種，其中97%的醬油中都有酪胺，其次是亞精胺、組胺、尸胺和精胺，這40種醬油中總生物胺含量在41.7～1357mg/L，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果略有差別。可能由于醬油生產(chǎn)工藝和產(chǎn)地等差異，導(dǎo)致醬油中生物胺總類(lèi)和含量都有較大差異。而B(niǎo)OVER-CID S等[28]研究報(bào)道酪胺主要是在發(fā)酵前期由腸球菌（Enterococcusfaecum）形成的。經(jīng)過(guò)含有胺氧化酶粗酶液處理后，腐胺和色胺的降解率都達(dá)到了84%以上，酪胺和精胺的降解率都達(dá)到了73%以上，總生物胺的降解率達(dá)到了66.61%。

表1 自制醬油和市售醬油中的生物胺含量以及相對(duì)降解率Table 1 Biogenic amine contents and relative degradation rates of homemade soy sauce and commercial soy sauce

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)得到黑曲霉SPFJ05胺氧化酶粗酶液的一些基本酶學(xué)特性：其粗酶最適反應(yīng)溫度為35℃；最適反應(yīng)pH值為7.0并且1.0 mmol/L Cu2+對(duì)其酶活有激活作用，最佳底物為正己胺，常見(jiàn)的酶活抑制劑如EDTA都能抑制其酶活。在生物胺降解應(yīng)用方面，本實(shí)驗(yàn)得到的粗酶液能夠有效減少醬油中的生物胺含量，在自制醬油油中總生物胺的降解率達(dá)到78.29%，在市售醬油中，總生物胺的降解率達(dá)到69.50%，這說(shuō)明用此方法降解醬油類(lèi)等調(diào)味品中的生物胺的方案切實(shí)可行，能夠有效降解醬油中的生物胺含量。

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Characterization of crude enzyme fromAspergillus nigeramine oxidase and study on its degradation of biogenic amines

Aspergillus nigerSPFJ05 as experimental strain was induced to produce amine oxidase.The cell of inducedA.nigerwas crushed and then the amine oxidase crude enzyme solution was obtained.The properties of crude enzyme were studied and the crude enzyme solution was used for the treatment of homemade soy sauce and commercial soy sauce.The experimental results showed that the optimum temperature of the crude enzyme solution was 35℃,the optimal pH was 7,and 1.0 mmol/L Cu2+had a stimulatory effect on enzyme activity.Ethylene diamine tetraacetie acid (EDTA)and mercapto ethanol had obvious inhibitory effect on enzyme activity;in the aspect of substrate specificity,the maximum degradation rate of n-hexylamine was 116%,the minimum degradation rate of cadaverine was 16%.The degradation rate of crude enzyme solution on total biogenic amines in homemade soy sauce reached 78.29%,and the degradation rate on total biogenic amines in commercial soy sauce reached 69.50%.A new method for the removal of biogenic amines in fermented soy sauce products was provided.

Aspergillus niger;biogenic amines;amine oxidase;soy sauce

Q55

0254-5071（2017）03-0121-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.025

2016-09-19

湖北省自然基金（2015CFB679）；湖北省科技廳項(xiàng)目（2015BCE028）

黃瑤（1994-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵。

*通訊作者：徐寧（1979-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

HUANG Yao1,ZHU Xia1,PENG Mingye1,FU Caixia2,ZHOU Mengzhou1,GAO Bing1,LI Dongsheng1,XU Ning1*

(1.Hubei Cooperative Innovation Center for Industrial Fermentation,Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hubei,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China;2.Hubei Tulaohan Flavouring and Food Co.,Ltd.,Yichang 443000,China)