突變酶Y93S對嗜熱地衣芽孢桿菌SR01葡聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響

韋陽道，易弋*，黎婭，石征宇，伍時華，梁建榮

突變酶Y93S對嗜熱地衣芽孢桿菌SR01葡聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響

韋陽道1，2，3，易弋1，2，3*，黎婭1，2，3，石征宇1，2，3，伍時華1，2，3，梁建榮4

（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州545006；3.廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西柳州545006；4.柳州市魚家樂飼料有限公司，廣西柳州545002）

為提高嗜熱地衣芽孢桿菌SR01葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性，對其相關(guān)的氨基酸殘基進行定點突變改造。通過對其結(jié)構(gòu)的分析，構(gòu)建了Y93S突變體，利用分子動力學模擬分析評估后，發(fā)現(xiàn)Y93S突變體可能具有較高的耐熱能力，利用定點突變技術(shù)構(gòu)建Y93S表達載體并分析溫度對表達產(chǎn)物酶活的影響。試驗結(jié)果表明，突變酶Y93S的最適溫度由野生型酶的55℃提高至70℃；在90℃條件下，突變酶Y93S較野生型酶的半衰期由60 min提高到120 min以上；pH及pH穩(wěn)定性較野生型變化不明顯。突變酶Y93S極大的提高了野生型酶的熱穩(wěn)定性，具有潛在的工業(yè)應用價值，同時為葡聚糖酶的耐熱機理提供有力依據(jù)。

分子動力學；嗜熱地衣芽孢桿菌；葡聚糖酶；熱穩(wěn)定性

嗜熱酶以其獨特的特性，成為目前研究的熱點，然而大多數(shù)的酶不具有耐高溫的特性，因此其發(fā)展受到阻礙。決定嗜熱酶熱穩(wěn)定性的主要機制是蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[1]。蛋白質(zhì)在氨基酸順序排列成一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過疏水作用、氫鍵、鹽鍵和靜電作用等次級鍵再折疊成對活力發(fā)揮關(guān)鍵作用的二、三級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)空間構(gòu)象上的微妙差異和外界微環(huán)境的影響，使得嗜熱酶表現(xiàn)出比常溫酶更強的熱穩(wěn)定性，更有利于其在高溫條件下發(fā)揮催化功能。在蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)研究中，通過嗜熱菌和常溫菌蛋白質(zhì)氨基酸組成的比較，發(fā)現(xiàn)嗜熱菌蛋白質(zhì)中Ala、Pro、Arg、Glu的含量均高于常溫菌，而Asn、Gln、Trp、Val、Ile的含量顯著低于常溫菌[2]?？赡苁且驗锳la氨基酸易于形成螺旋結(jié)構(gòu)，可以增強蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的剛性[3]；Arg氨基酸殘基具有較大的側(cè)鏈易于提供疏水作用及離子間相互作用[4]；Asn與Glu氨基酸殘基在高溫下會發(fā)生脫氨基作用，造成酶分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定進而不能發(fā)揮其生物活性等[5]。有研究表明，通過定點突變有助提高酶的熱穩(wěn)定性，如STEWART R J等[6]通過對大麥葡聚糖酶定點突變構(gòu)造K23R、M298K/T17D突變體，其突變體和親本酶H300P相比，熱穩(wěn)定性有著顯著的提高；KIM S A等[7]通過對葡聚糖酶分子結(jié)構(gòu)中的第70位的Asp氨基酸突變?yōu)閂al氨基酸獲得突變體2011D，其半衰期從52℃、10 min提高至66℃、10 min；PONS J等[8]通過構(gòu)建突變體N57A，發(fā)現(xiàn)其耐熱性要高于野生酶。由于試驗篩選工作量較大，隨著分子模擬技術(shù)的發(fā)展，可以極大的解決這一問題。分子模擬是指利用理論方法與計算技術(shù)，模擬或仿真分子運動的微觀行為，被廣泛的應用到計算化學、計算生物學和材料科學等領(lǐng)域。特別對于復雜的生物體系的研究是當前研究的熱點。由于其具有較高的準確性，因此被作為真實試驗的輔助工具。如詹冬玲等[9]為提高嗜熱蛋白酶PhpI的活力，通過分子對接與分子動力學模擬，最終獲得突變體K43C可能有利于提高酶活力，通過分子生物學的試驗得到驗證，其水解丙氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-7-氨基-香豆素（AAF-AMC）的活力是野生酶的5.8倍。

本實驗在前期研究獲得葡聚糖酶的基因序列的基礎(chǔ)上，通過理性設計的方法，即利用分子動力學模擬獲得可能具有耐熱性好的突變體，并通過重疊聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)獲得突變體進行驗證。本研究可以極大的提高試驗的效率，同時為葡聚糖酶結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定機制的進一步的研究提供了有利的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表達載體pGEX-4T-3、大腸桿菌（Escherichia coli）BL21：由廣西科技大學發(fā)酵工程研究實驗室提供；載體pMD18-T、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI、DL5000DNA Marker：大連寶生物工程有限公司；引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成；葡聚糖：北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠DNA回收試劑盒：北京天根生化科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1100紫外/可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；ZFD-5250全自動新型鼓風干燥箱、HWY-2112全溫度恒溫調(diào)速搖床柜：上海智城分析儀器制造有限公司；Micro 220R臺式冷凍離心機：德國HETTICH公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 獲得3維結(jié)構(gòu)

通過利用網(wǎng)絡服務器I-TASSER（http：//zhanglab.ccmb. med.umich.edu/I-TASSER/）對嗜熱地衣芽孢桿菌葡聚糖酶（登錄號：YP_006712752.1）進行同源建模，通過GROMACS 4.6.5軟件對其進行能量優(yōu)化，獲得合理的結(jié)構(gòu)。同時利用Deepview軟件對目標位點進行突變，通過能量優(yōu)化，獲得突變體3維結(jié)構(gòu)。

1.3.2 分子動力學模擬

本研究采用GROMACS4.6.5軟件進行分子動力學模擬[10]，水分子采用統(tǒng)計過程控制（statistical process control，SPC）模型[11]，力場選擇OPLS-AA/L全原子力場[12]，范德華作用利用Lenard-Jones函數(shù)計算，非鍵截斷距離為1.4nm[13]，非鍵作用原子列表每2個步長更新一次，長程靜電相互作用利用PME方法進行計算[14]，在計算過程中采用周期性邊界條件，消除邊界條件。將蛋白質(zhì)置于距離立方體邊緣1.0 nm的盒子中，并中和電荷，使其處于中性的環(huán)境中，在能量優(yōu)化后，使用約束動力學的方法，進行800 ps的等溫等壓體系的平衡，溫度應分別達到為323 K、343 K和363 K，通過V-rescale方法控制溫度，采用Berendsen方法控制壓力，壓力為1個大氣壓，溫度和壓力耦合時間常數(shù)均為0.1 ps[15]。平衡后進行20 ns自由動力學模擬，每2 ps采集一次構(gòu)象。模擬完成后通過對均方根偏差、均方根漲落和回旋半徑等參數(shù)的分析來研究突變體熱穩(wěn)定性的變化。

1.3.3 構(gòu)建表達載體，獲得重組蛋白

（1）原核表達載體構(gòu)建

根據(jù)重疊PCR的原理，設計出四條引物，分別為LG1s：GGATCCGCCTTGGTCTGCCTCTATG，LG1a：GAATTC TACATCATCGCTATTACGC，S1：ATTTCAGCCCTGTGC GGGAGCCTGG，A1：CCAGGCTCCCGCACAGGGCTGA AAT，均有上海英俊有限公司合成。以野生型葡聚糖酶DNA為模板，分別以LG1s和A1、LG1a和S1為引物進行PCR，純化所得DNA，合并作為下一步模板，用LG1s和LG1a為引物進行PCR，純化PCR產(chǎn)物，通過T-A克隆連接到pMD-18T中，轉(zhuǎn)化BL21鑒定測序。將測序正確的TA克隆重組菌于37℃條件下培養(yǎng)16 h后提取質(zhì)粒，后將限制性內(nèi)切酶EcoiI、BamHI進行雙酶切，膠回收后的目的基因片段通過T4DNA連接酶與表達載體pGEX-4T-3相連接，構(gòu)建出重組表達載體，根據(jù)雙酶切與PCR驗證后，選擇可能的重組菌測序，最終由測序結(jié)果判斷是否符合本實驗的要求。

（2）獲得重組蛋白

取經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導后的菌液500 mL，4 000 r/min離心15 min，去上清，并用pH7.4的磷酸鉀緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌1次，然后置于25mL的PBS溶液中，利用超聲波細胞破碎儀（100 W工作2 s，間歇2 s）破碎菌體30 min。將破碎后的液體經(jīng)4 000 r/min離心15 min，收集上清液，即為粗酶液。

1.3.4 酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

采用二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法[16]檢測葡聚糖酶的活力，將重組的突變體分別置于30～90℃條件下進行酶促反應，以最適溫度條件下的酶活為100%，使用相對酶活比較各溫度條件下的酶活力大小。將酶液置于50℃、70℃和90℃條件下分別處理30 min、60 min、90 min和120 min，并于最適溫度下測定剩余酶活，以未處理的酶活為100%。

1.3.5 酶最適pH及pH穩(wěn)定性

分別以pH3～10的緩沖液配制3 mg/mL的葡聚糖底物，于最適溫度條件下測定其相對酶活，以最高酶活為100%。將pH3～10的不同緩沖液與酶液按1∶1混合，4℃分別放置1、2 h，并于最適溫度條件下測定剩余酶活，以未處理的原酶液的酶活作為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 均方根偏差分析

均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）是指蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)在模擬過程中的動態(tài)變化，其值越小，說明蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性就越高[17]。野生型與突變體Y93S蛋白的分子動力學模擬結(jié)果如圖1所示。

圖1 野生型蛋白與突變體Y93S蛋白在323 K(A)、343 K(B)、363 K(C)條件下的RMSD值Fig.1 RMSD values of wild-type protein and mutant Y93S at 323 K (A),343 K(B)and 363 K(C)conditions

由圖1可知，在相同的溫度條件下，野生型蛋白的RMSD值要高于突變體Y93S，同時可以看出，野生型與Y93S蛋白體系隨著時間的延長，也都逐漸趨于平衡；在不同的溫度條件下，野生型蛋白和Y93S蛋白的RMSD值隨著溫度的升高而增加，但Y93S蛋白的RMSD值較野生型增加的幅度較小，這說明，突變體Y93S蛋白結(jié)構(gòu)較野生型更加穩(wěn)定。

2.2 回旋半徑分析

回旋半徑（radius of gyration，Rg）可以用作形容蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的緊密度，如圖2所示。由圖2可知，在相同的溫度條件下，野生型的Rg值要略高于突變體Y93S，其中在323K溫度下，野生型蛋白的Rg值主要分布在1.69～1.73 nm范圍內(nèi)，并且集中在1.71 nm，而Y93S蛋白的Rg值主要分布在1.68～1.72nm范圍內(nèi)，集中于1.71nm；在343K溫度下，野生型的Rg值主要分布在1.70～1.73nm范圍內(nèi)，集中于1.72 nm左右，而Y93S的Rg值主要分布在1.69～1.72 nm范圍內(nèi)，集中于1.71 nm；在363 K溫度下，野生型的Rg值分布在1.70～1.74 nm范圍內(nèi)，集中于1.72 nm附近，而Y93S蛋白的Rg值主要分布在1.69～1.72 nm范圍，集中于1.71 nm。并且在不同的溫度條件下，可以看出隨著溫度的升高，Rg值呈上升趨勢，然而突變體Y93S蛋白較野生型蛋白的Rg值在隨溫度的升高，變化不明顯，這說明在高溫條件下，Y93S蛋白整體結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，可以更好的適應高溫環(huán)境。

圖2 野生型蛋白與突變體Y93S蛋白在323 K(A)、343 K(B)、363 K(C)條件下的Rg值Fig.2 Rg values of wild type-protein and mutant Y93S at 323 K(A), 343 K(B)and 363 K(C)conditions

2.3 其他因素分析

影響酶的熱穩(wěn)定性的因素有很多，如鹽鍵的數(shù)目、氫鍵和靜電相互作用等，本研究通過分別計算溶劑可及表面、鹽橋、氫鍵、庫侖力等方面的平均值來考察突變體Y93S與野生型蛋白在不同溫度下的熱穩(wěn)定性的影響，試驗結(jié)果如表1所示。

表1 突變體Y93S與野生型在不同溫度下各參數(shù)比較Table 1 Comparison of the parameters of the mutant Y93S and the wild-type at different temperatures

由表1可知，在323 K和343 K溫度條件下，突變體Y93S蛋白與野生型蛋白的總?cè)軇┛杉氨砻娣e相差較小，在363 K的溫度條件下，兩者相差略大，差值為1.23 nm2。在不同的溫度下，隨著溫度的增加，野生型蛋白的總?cè)軇┛杉氨砻嬗兄饾u增加的趨勢，而突變體Y93S蛋白沒有變化，這說明在高溫下，突變體整體結(jié)構(gòu)較野生型穩(wěn)定；鹽橋的數(shù)目隨著溫度的增加有上升的趨勢，這可能是由于溫度的升高破壞了蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)之間的作用力，使得其自身通過形成更多的鹽橋來維持自身在高溫環(huán)境下的穩(wěn)定。野生型蛋白質(zhì)分子間的氫鍵與蛋白質(zhì)與水分子之間的氫鍵隨著溫度增加而降低，而蛋白質(zhì)分子間的氫鍵數(shù)目變化沒有規(guī)律。從庫侖力、勢能和總能量可以看出，野生型相比Y93S的數(shù)值相差較大，這可能是與突變后的氨基酸殘基有關(guān)，增加了分子間作用力，使得結(jié)構(gòu)變的更穩(wěn)定。

針對原州區(qū)水利建設的實際情況，應該堅持統(tǒng)籌兼顧、因地制宜的原則，實現(xiàn)對本地區(qū)的全面統(tǒng)籌規(guī)劃。標準化、制度化是對農(nóng)田水利建設工作人員的要求，也是對農(nóng)田水利工程建設結(jié)果的保障。從工程建設到工程運營和維護，都要嚴格規(guī)范管理，以提高原州區(qū)農(nóng)田水利現(xiàn)代化建設水平。

2.4 酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

2.4.1 酶的最適溫度

圖3 野生型蛋白與突變體Y93S的最適溫度Fig.3 Optimum temperature of the wild-type protein and the mutant Y93S

由圖3可知，野生型蛋白與突變體Y93S蛋白的酶活力隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中野生型蛋白的最適溫度為55℃，而Y93S蛋白的最適溫度為70℃，較

野生型蛋白提高了15℃。

2.4.2 酶的溫度穩(wěn)定性

圖4 野生型蛋白與突變體Y93S蛋白在50℃（A）、70℃（B）、90℃（C）條件下的溫度穩(wěn)定性Fig.4 Temperature stability of wild-type protein and mutant Y93S at the condition of 50℃(A),70℃(B)and 90℃(C)

將野生型與突變體Y93S蛋白分別放于50℃、70℃和90℃條件下處理一段時間后，置于最適溫度條件下進行酶促反應，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在相同的溫度下，突變體Y93S蛋白較野生型蛋白具有更高的酶活力。在50℃下，Y93S處理120min仍有95%的酶活力，而野生型蛋白處理120 min，其酶活力下降至85%左右；在70℃下，Y93S蛋白處理90 min仍有95%的酶活力，野生型蛋白處理90min后，剩余酶活約為80%；在90℃下，Y93S與野生型蛋白隨著時間的增加，其剩余酶活也逐漸下降，在處理120 min時，Y93S的剩余酶活仍有60%，而野生型蛋白的剩余酶活在40%左右。在不同的溫度下，Y93S與野生型蛋白的剩余酶活隨著溫度的升高而下降，而突變體Y93S蛋白的下降幅度較野生型較小。同時也可以看出，將野生型蛋白在90℃條件下的半衰期從60min提高至120 min以上，因此可以得出，突變體Y93S蛋白的耐熱性較野生型蛋白提高。

2.5 酶的最適pH及pH穩(wěn)定性

2.5.1 酶的最適pH

圖5 野生型蛋白與突變體Y93S蛋白的最適pHFig.5 Optimum pH of wild-type protein and mutant Y93S

由圖5可知，突變體Y93S與野生型蛋白的酶活隨著pH值的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，最適pH值都為6，這可能是突變后的S93氨基酸殘基與Y93的酸堿性相似，因而不會引起酶的最適pH值得變化。

2.5.2 酶的pH穩(wěn)定性

將野生型與突變體分別在pH 3～10的緩沖液中進行酶促反應1 h、2 h，測定酶活力，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，突變體Y93S與野生型蛋白在處理1h與2h，兩者的變化不大，在pH5～8范圍內(nèi)，兩者的剩余酶活都達到80%以上，而在pH≤5時，兩者的剩余酶活都在75%左右，在pH＞8以后，突變體Y93S蛋白呈下降的趨勢，而野生型蛋白下降不明顯，趨于平衡。因此兩者的pH穩(wěn)定性相似，區(qū)別較小。

圖6 野生型蛋白與突變體Y93S在反應1 h（A）、2 h（B）條件下的pH穩(wěn)定性Fig.6 pH stability of wild-type protein and mutant Y93S at the reaction time of 1 h(A)and 2 h(B)

3 討論

本文采用計算機模擬與試驗相結(jié)合的方法對葡聚糖酶進行定點突變，以期獲得具有更高熱穩(wěn)定性的蛋白。本實驗通過對葡聚糖酶分子結(jié)構(gòu)分析，構(gòu)造了突變體Y93S，優(yōu)化后，其有96.86%的氨基酸殘基的3D-ID的值≥0.2（蛋白質(zhì)的氨基酸總數(shù)至少有80%≥0.2），葡聚糖酶主鏈二面角的99.4%Φ-Ψ角落在Ramachandran圖的核心區(qū)和允許區(qū)，同時有研究表明葡聚糖酶的C-末端與其熱穩(wěn)定性無關(guān)，而其N-端和催化域與其耐熱性有關(guān)[18]，因此優(yōu)化后的分子結(jié)構(gòu)可以用于分子動力學的研究。本試驗結(jié)合均方根偏差、回旋半徑和均方根漲落等參數(shù)分析，得出突變體Y93S蛋白的熱穩(wěn)定可能要高于野生型蛋白。其中，Y93S的RMSD值要低于野生型，這說明Y93S可能比野生型更加耐熱；進一步分析Rg值，表明Y93S的Rg值較野生型蛋白的小，這說明其整體結(jié)構(gòu)較為緊密，有利于適應高溫環(huán)境。在363 K溫度下，野生型的總?cè)軇┛杉氨砻姹萗93S高出1.23 nm2，這可能是在高溫環(huán)境下，野生型蛋白發(fā)生了去折疊，使得其總的溶劑可及表面增大造成的，隨著溫度的增加，野生型的總?cè)軇┛杉氨砻娉试黾拥内厔荩鳼93S變化不明顯，這可以說明Y93S的耐熱性較好[19]。鹽鍵數(shù)目有隨著溫度的增加而增加，這與THOMASAS等[20]研究的鹽鍵在25～100℃范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，其數(shù)目與作用力增加一致。野生型與Y93S蛋白分子間和蛋白質(zhì)分子與水分子之間的數(shù)目隨著溫度的升高呈下降的趨勢，其中Y93S較野生型在相同溫度下，其與水分子間形成的氫鍵數(shù)目要高于野生型，這可能是與突變后的氨基酸殘基的種類有關(guān)，Y93為疏水氨基酸，其帶有苯環(huán)，具有一定的剛性使得酪氨酸分子的主鏈彎曲或羧基旋轉(zhuǎn)更為困難，羧基與水分子間的距離較大，不利于與水分子形成氫鍵。絲氨酸為親水氨基酸，其隨著周圍水分子的數(shù)目增加，其與水分子之間的氫鍵建長變短，鍵能增強，易于水分子形成氫鍵[21]。Y93S的靜電相互作用，勢能和總能量較野生型的低，這說明Y93S整體分子結(jié)構(gòu)較野生型穩(wěn)定，耐熱性好。利用分子生物學試驗構(gòu)建Y93S突變體，通過對野生型與突變體的酶學性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，Y93S較野生型蛋白的最適溫度提高了15℃，突變體的在90℃的半衰期較野生型從60 min提高到120 min以上，最適pH和pH穩(wěn)定性與野生型相差無幾，但在pH 8～10范圍內(nèi)，突變體較野生型的剩余酶活低。這可能與突變前后的氨基酸的種類有關(guān)，由于酪氨酸的R基較大，其解離常數(shù)偏堿性，而絲氨酸的R基解離常數(shù)偏中性，因此造成突變體Y93S在堿性環(huán)境下處理一定時間后，剩余酶活較野生型低。

4 結(jié)論

本研究通過計算機模擬篩選出突變體Y93S蛋白較野生型蛋白可能具有更高的耐熱性，并用重疊PCR定點突變進行試驗驗證，試驗結(jié)果為突變體Y93S的最適溫度為70℃，較野生型提高了15℃，在90℃下的半衰期由60 min提高至120min以上，pH及pH穩(wěn)定性變化不明顯。通過理性設計對葡聚糖酶分子進行改造，減少了不必要的消耗，提高試驗的效率，同時為其耐熱機理提供有力依據(jù)。

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Effect of mutant enzyme Y93S on the thermal stability of glucanase from thermophilic Bacillus licheniformisSR01

WEI Yangdao1,2,3,YI Yi1,2,3*,LI Ya1,2,3,SHI Zhengyu1,2,3,WU Shihua1,2,3,LIANG Jianrong4
(1.College of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006,China; 2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources,Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006,China; 3.Key Laboratory for Processing of Sugar Resources of Guangxi Higher Education Institutes,Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou 545006,China;4.Liuzhou City Jiale Fish Feed Limited Company,Liuzhou 545002,China)

In order to improve the thermal stability of glucanse from thermophilicBacillus licheniformisSR01,the related amino acid residues were site-specific mutated.Through the analysis of its structure,the Y93S mutants were constructed.By using molecular dynamics simulation analysis,the Y93S mutants may have higher heat resistance ability.The Y93S expression vector was constructed by site directed mutagenesis technique and the effect of temperature on the activity of the expressed product was analyzed.Results showed that the optimum temperature of the mutant enzyme Y93S increased from 55℃to 70℃.At 90℃,the half-life period of the mutant enzyme Y93S increased from 60 min to 120 min;pH and pH stability did not change obviously than the wild type.The mutant enzyme Y93S greatly improved the thermal stability of the wild-type enzyme,it had potential application value in industry,and it provided a strong basis for the heat resistance mechanism of the glucanase.

molecular dynamics;thermophilicBacillus licheniformis;glucanase;thermal stability

Q93-33

0254-5071（2017）03-0109-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.023

2016-08-16

廣西科學基金（2015GXNSFBA139068）；廣西柳州市中小企業(yè)創(chuàng)新基金（2014F030618）

韋陽道（1989-），男，碩士研究生，研究方向為微生物分子生物學。

*通訊作者：易弋（1979-），男，教授，博士，研究方向為微生物學。