嗜熱鏈球菌M5-5凍干保護(hù)劑配方的優(yōu)化

焦琳，鄭曉衛(wèi)，屈曉宇，申彤，楊潔*

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院生物技術(shù)中心，北京102209）

嗜熱鏈球菌M5-5凍干保護(hù)劑配方的優(yōu)化

焦琳1，鄭曉衛(wèi)2，屈曉宇1，申彤1，楊潔1*

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院生物技術(shù)中心，北京102209）

為了研究不同凍干保護(hù)劑在真空冷凍干燥過(guò)程中對(duì)嗜熱鏈球菌M5-5菌體細(xì)胞的保護(hù)效果，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，以凍干后的菌體存活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察9種凍干保護(hù)劑在冷凍干燥過(guò)程中對(duì)M5-5菌體的保護(hù)效果，以期獲得最優(yōu)保護(hù)劑配方。結(jié)果表明，海藻糖、甘油和脫脂乳作為單一凍干保護(hù)劑時(shí)，菌體細(xì)胞存活率分別為43.85%、47.51%和40.86%，顯著高于其他6種保護(hù)劑（P＜0.05）；通過(guò)正交試驗(yàn)確定凍干保護(hù)劑的最優(yōu)配方為海藻糖60 g/L、谷氨酸鈉20 g/L、甘油20 g/L、脫脂乳150 g/L，此時(shí)嗜熱鏈球菌M5-5的凍干存活率可達(dá)88.41%。掃描電鏡結(jié)果顯示，添加保護(hù)劑配方組菌體細(xì)胞完整，表面光滑，說(shuō)明該保護(hù)劑配方能有效減少冷凍干燥過(guò)程對(duì)菌體細(xì)胞的損傷。

嗜酸鏈球菌；凍干保護(hù)劑；掃描電鏡

目前，糖類和脫脂乳是使用較廣泛且保護(hù)效果明顯的保護(hù)劑，但其作用機(jī)理尚不明確[14]。就效果而言，單一的保護(hù)劑不足以保護(hù)菌體抵抗不良的凍干環(huán)境[15]，且同種保護(hù)劑對(duì)不同菌株的保護(hù)效果不盡相同，不同濃度的保護(hù)劑保護(hù)效果也存在差異。因此，只有復(fù)配保護(hù)劑中各組分比例和濃度達(dá)到協(xié)調(diào)時(shí)，才能達(dá)到理想的保護(hù)效果。本研究以從新疆民豐縣采集的酸乳中篩選分離的嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）M5-5為試驗(yàn)菌株，采用單因素法篩選出保護(hù)效果顯著的保護(hù)劑，采用正交試驗(yàn)法確定最優(yōu)的保護(hù)劑的濃度和比例，并經(jīng)掃描電鏡驗(yàn)證該保護(hù)劑配方對(duì)菌體細(xì)胞的保護(hù)效果，以期最大限度地發(fā)揮保護(hù)作用，減少菌體細(xì)胞在凍干過(guò)程中的死亡和損傷，為高效凍干發(fā)酵劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)菌株：本試驗(yàn)室從新疆民豐縣收集的酸奶中分離得到的一株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌M5-5，經(jīng)16S rDNA鑒定，菌株M5-5為嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）。

脫脂乳粉：新西蘭恒天然集團(tuán)；海藻糖、甘露醇、谷氨酸鈉：美國(guó)Sigma公司；抗壞血酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甘油、麥芽糊精、谷氨酸：北京化工廠；以上試劑均為分析純。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.00 g，酵母浸粉5.00 g，牛肉膏10.00 g，葡萄糖20.00 g，磷酸氫二鉀2.00 g，檸檬酸氫二銨2.00 g，無(wú)水乙酸鈉5.00 g，硫酸錳0.25 g，硫酸鎂0.58 g，Tween-801.00g，蒸餾水1L，pH值為6.8，121℃滅菌15min。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha1-2LDplus型真空冷凍干燥機(jī)：德國(guó)CHRIST公司；BHC-1300IIA2型超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；Neofuge 23R型力康高速低溫離心機(jī)：香港力康有限公司；YX280B型手提式不銹鋼蒸汽消毒器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；AL104型分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）公司；GXZ型恒溫培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠；HH-S型水浴鍋：鞏義市英峪予華儀器廠；Spectrumlab24型紫外分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司。HITACHI S-3400型掃描電鏡：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

菌種活化→擴(kuò)大培養(yǎng)→離心→收集菌泥→加入保護(hù)劑溶液→懸浮液的制備→預(yù)凍→真空冷凍干燥→復(fù)水→計(jì)數(shù)活菌數(shù)（CFU/mL）→計(jì)算菌體細(xì)胞存活率

1.3.2 菌株M5-5生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將菌株M5-5在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3次，使菌株活力達(dá)到最佳狀態(tài)。

按接種量3%接種于若干個(gè)MRS液體培養(yǎng)基。將其放入37℃培養(yǎng)。取出0 h的培養(yǎng)液測(cè)OD600nm值，并記錄。此后，每隔1 h測(cè)一次OD600nm值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm為縱坐標(biāo)繪制菌株M5-5的生長(zhǎng)曲線，以確定菌株M5-5的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期和穩(wěn)定生長(zhǎng)前期。

1.3.3 菌懸液的制備和冷凍干燥

將處于對(duì)數(shù)期末期的菌株M5-5加入離心管中，4000r/min離心20 min后在無(wú)菌操作臺(tái)中迅速傾去上清液，得到細(xì)胞糊狀物（即菌泥）備用。按菌泥∶保護(hù)劑=1∶3的體積比加入滅菌保護(hù)劑，制成菌懸液備用。

各取2 mL菌懸液分裝至無(wú)菌的小西林瓶中，在-80℃預(yù)凍12 h使其完全凍結(jié)，然后轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行真空凍干12～15 h。利用凍干后的菌體細(xì)胞存活率來(lái)比較保護(hù)劑的效果。

1.3.4 細(xì)胞存活率計(jì)算

采用梯度稀釋傾注平板計(jì)數(shù)法，分別計(jì)算凍干前和凍干后菌體活細(xì)胞數(shù)，對(duì)于凍干后活菌數(shù)的計(jì)算，先將凍干后的菌粉加入與凍干前等體積的無(wú)菌生理鹽水復(fù)水，以MRS培養(yǎng)基為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h后計(jì)活菌數(shù)。菌體細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

1.3.5 單因素試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，選擇9種凍干保護(hù)劑，分別為海藻糖、麥芽糊精、谷氨酸、甘油、甘露醇、谷氨酸鈉、脫脂乳、抗壞血酸、MRS培養(yǎng)基，按菌泥∶保護(hù)劑=1∶3體積比添加凍干保護(hù)劑，以凍干后菌體細(xì)胞存活率為指標(biāo)篩選出效果較好的凍干保護(hù)劑，進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

1.3.6 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素篩選出合適的保護(hù)劑，最終選擇海藻糖、谷氨酸鈉、甘油、脫脂乳為試驗(yàn)因素，以細(xì)胞存活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，每個(gè)因素取3個(gè)濃度水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34），正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 凍干保護(hù)劑配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for cryoprotectants formula optimization

1.3.7 掃描電鏡觀察

利用掃描電鏡觀察嗜熱鏈球菌M5-5凍干前細(xì)胞形態(tài)，及添加最優(yōu)保護(hù)劑配方和未添加保護(hù)劑條件下凍干后的細(xì)胞形態(tài)，驗(yàn)證最優(yōu)保護(hù)劑配方對(duì)菌體細(xì)胞的保護(hù)效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株M5-5生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

由于菌種收獲時(shí)期會(huì)影響細(xì)胞的復(fù)蘇能力和代謝活性[16]。乳酸菌在停滯期時(shí)，不具有強(qiáng)的繁殖能力，且耐受力和活力較差；處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳酸菌繁殖能力較強(qiáng)，細(xì)胞代謝活性強(qiáng)，適合用于擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)接種，但對(duì)溫度比較敏感，不宜進(jìn)行低溫處理；在處于對(duì)數(shù)末期和穩(wěn)定前期的細(xì)胞，生理結(jié)構(gòu)和代謝功能都處于穩(wěn)定期，菌體抗逆性強(qiáng)，因此收獲此時(shí)的細(xì)胞作為冷凍干燥的細(xì)胞進(jìn)行研究更具有代表性。

圖1 菌株S.thermophilusM5-5的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve ofS.thermophilusM5-5

由圖1可知，在0～3 h時(shí)，OD600nm值基本沒(méi)有變化，說(shuō)明在此期間，菌種處于停滯期；從4 h開始OD600nm值增長(zhǎng)速率加快，菌種生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期。到8 h后OD600nm值雖仍有上升趨勢(shì)，但非常緩慢，說(shuō)明菌種已經(jīng)逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期。故選擇培養(yǎng)8～13 h的菌體作為凍干保護(hù)劑篩選的研究對(duì)象。

2.2 單因素試驗(yàn)

保護(hù)劑效果可能與保護(hù)劑類型有關(guān)，滲透型的保護(hù)劑被認(rèn)為是最理想的保護(hù)劑，如甘油既能透過(guò)細(xì)胞壁也能透過(guò)細(xì)胞膜，對(duì)菌體的保護(hù)效果明顯。而僅能通過(guò)細(xì)胞壁不能穿過(guò)細(xì)胞膜（如多糖等）效果次之[17]。本試驗(yàn)選用9種保護(hù)劑，不同凍干保護(hù)劑下菌體細(xì)胞存活率計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同凍干保護(hù)劑下存活率（n=4）Table 2 Cell survival rate under different cryoprotectants（n=4）

由表2可知，海藻糖、甘油和脫脂乳對(duì)菌體保護(hù)效果最佳，菌體細(xì)胞存活率分別為43.85%、47.51%和40.86%。3種保護(hù)劑對(duì)菌體保護(hù)效果之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。而其他6種保護(hù)劑對(duì)菌體保護(hù)效果次之（P＜0.05）。

2.3 正交試驗(yàn)

為了使菌體細(xì)胞在冷凍干燥過(guò)程中達(dá)到最大存活率，僅使用單一的保護(hù)劑難以達(dá)到預(yù)期的保護(hù)效果，采用復(fù)配保護(hù)劑可以在冷凍過(guò)程中各自發(fā)揮作用，又能發(fā)揮協(xié)同作用，對(duì)菌體的保護(hù)效果較理想，為確定最優(yōu)的保護(hù)劑配方，對(duì)海藻糖、甘油、脫脂乳和谷氨酸鈉進(jìn)行用量正交試驗(yàn)，得到用量正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 凍干保護(hù)劑配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for cryoprotectants formula optimization

由表3可知，海藻糖、谷氨酸鈉、甘油和脫脂乳4種凍干保護(hù)劑的極差分別為10.23、22.18、17.91、12.47，說(shuō)明4種保護(hù)劑對(duì)細(xì)菌凍干前后存活率的影響大小依次為谷氨酸鈉＞甘油＞海藻糖＞脫脂乳。根據(jù)凍干后的菌體細(xì)胞存活率可得，最佳保護(hù)劑配方為海藻糖60 g/L、谷氨酸鈉20 g/L、甘油20 g/L、脫脂乳150 g/L。在此最佳條件下，菌體細(xì)胞存活率可達(dá)88.41%。

海藻糖由于具有多個(gè)羥基，能與菌體表面的自由基結(jié)合，避免菌體暴露在介質(zhì)中，同時(shí)可與蛋白質(zhì)形成氫鍵取代水，維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[18]；脫脂奶粉主要是在菌體表面形成保護(hù)層[19]；甘油和谷氨酸鈉能滲透到細(xì)胞內(nèi)部，使結(jié)合水的能力更強(qiáng)，抑制過(guò)度失水，防止細(xì)胞在冷凍過(guò)程中冰晶的形成[19]。而不同菌種最適的保護(hù)劑是不同的，復(fù)合保護(hù)劑體系中每種成分在冷凍干燥過(guò)程中都發(fā)揮各自的作用，所以，相比于單一的保護(hù)劑，以一定比例復(fù)配的保護(hù)劑效果更好。

2.4 掃描電鏡驗(yàn)證最優(yōu)保護(hù)劑配方

為確定最優(yōu)保護(hù)劑配方的保護(hù)效果，嗜熱鏈球菌M5-5添加保護(hù)劑凍干前后菌體的形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 凍干保護(hù)劑對(duì)細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 Effect of cryoprotectants on bacterial cell morphology

由圖2可知，未加保護(hù)劑組的菌體細(xì)胞相互黏連，細(xì)胞不完整，可能是由于細(xì)胞膜破壞造成的，加入復(fù)配保護(hù)劑后，菌體細(xì)胞完整性較好，表面光滑，結(jié)果表明，添加保護(hù)劑能有效地保證在凍干過(guò)程中細(xì)胞膜仍保持滲透系統(tǒng)和細(xì)胞膜的完整性，避免細(xì)胞內(nèi)容物的流出而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了不同凍干保護(hù)劑對(duì)嗜熱鏈球菌M5-5的存活率和形態(tài)的影響。結(jié)果表明：相比于其他6種保護(hù)劑，海藻糖、甘油和脫脂乳對(duì)菌體的保護(hù)效果更顯著，凍干后菌體存活率分別為43.85%、47.51%和40.86%。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，凍干保護(hù)劑的最佳配方為海藻糖60 g/L、谷氨酸鈉20g/L、甘油20g/L、脫脂乳150g/L，此時(shí)嗜熱鏈球菌M5-5凍干后菌體存活率可達(dá)88.41%。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，優(yōu)化后的復(fù)合保護(hù)劑配方對(duì)嗜熱鏈球菌M5-5的菌體形態(tài)和生物膜均有良好的保護(hù)作用。

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Optimization of cryoprotectant formula forStreptococcus thermophilusM5-5 during freeze-drying

JIAO Lin1,ZHENG Xiaowei2,QU Xiaoyu1,SHEN Tong1,YANG Jie1*
(1.College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China; 2.Biotechnology Center,Nutrition and Health Institute,COFCO,Beijing 102209,China)

In order to investigate the effect of different cryoprotectants on cell viability ofStreptococcus thermophilusM5-5 in the process of vacuum freeze-drying,single-factor experiments combining with orthogonal experiments were carried out to optimize protective agents formula based on the cell survival rate ofS.thermophilusM5-5 after vacuum freeze-drying.Results showed that the cell survival rate ofS.thermophilusM5-5 using trehalose,glycerol and skim milk as protective agents was 43.85%,47.51%,and 40.86%,respectively,higher than that using other six protective agents. The optimum protective agents formula forS.thermophilusM5-5 were determined as follows:trehalose 60 g/L,sodium glutamate 20 g/L,glycerol 20 g/L,skim milk 150 g/L,and the cell survival rate ofS.thermophilusM5-5 after vacuum freeze-drying reached 88.41%.Scanning electron microscope results showed that the cell with cryoprotectant addition was intact with smooth surface,which indicated that the well-performed cryoprotectant could effectively reduce the damage on bacterial cells during vacuum freeze-drying.

Streptococcus thermophilus;cryoprotectant;scanning electron microscope

TS202.3

0254-5071（2017）03-0095-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.020

2016-12-05

新疆維吾爾自治區(qū)科技興新項(xiàng)目（2010037B26）

焦琳（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿樗峋l(fā)酵劑。

*通訊作者：楊潔（1963-），女，教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄允称?。月后的存活率與凍干后直接測(cè)得的存活率分別是71.3%和72.4%，表現(xiàn)出較好的貯藏穩(wěn)定性[13]。

乳酸菌是公認(rèn)的益生菌，在維護(hù)人和動(dòng)物腸道健康、促進(jìn)體內(nèi)微生物生態(tài)平衡方面起著重要作用。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物能有效改善腸胃功能、增加免疫力、清除自由基。因此，乳酸菌的潛在應(yīng)用價(jià)值使其成為研究的熱點(diǎn)[1]。但乳酸菌本身對(duì)外界環(huán)境的耐受能力差，很難在生產(chǎn)加工和運(yùn)輸過(guò)程中保持高活性，從而影響其本身的發(fā)酵性能[2]，因此保持乳酸菌在生產(chǎn)流通過(guò)程中的高活性至關(guān)重要，也是未來(lái)發(fā)酵領(lǐng)域的發(fā)展方向[3]。

目前，真空冷凍干燥是有效保存菌種的方法之一[4]。然而在冷凍過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)水形成冰晶，會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)的pH值和離子強(qiáng)度，增加細(xì)胞膜的通透性，對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷；而且真空干燥過(guò)程會(huì)加速樣品表面水分流失，破壞生物大分子的水保護(hù)層，降低細(xì)胞生物活性[5]。因此，為了盡可能減小冷凍干燥過(guò)程對(duì)細(xì)胞的損傷，降低乳酸菌的死亡率，延長(zhǎng)菌種保藏期[6-8]，選擇合適的保護(hù)劑至關(guān)重要。

冷凍保護(hù)劑分為非滲透性和滲透性兩種。非滲透性保護(hù)劑可以在細(xì)胞表面形成保護(hù)層，而滲透性保護(hù)劑則能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與水分子結(jié)合，減緩冰晶形成，且減少細(xì)胞在干燥過(guò)程中的水分流失[9-10]。HUB?LEK Z[11]研究發(fā)現(xiàn)，將非滲透性和滲透性保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)配可以更有效維持細(xì)胞在冷凍干燥過(guò)程中的生物活性。LIM C M等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍干燥過(guò)程中添加脫脂乳和蔗糖后，Lactobacillus salivariusI 24的存活率可達(dá)13%和9%；添加2.5%的谷氨酸鈉作為保護(hù)劑凍干酒類酒球菌（Oenococcusoeni），貯藏6個(gè)