貴州主要發(fā)酵豆制品加工中丙烯酰胺形成動態(tài)

文安燕，張帥，曾海英，2，秦禮康*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025）

貴州主要發(fā)酵豆制品加工中丙烯酰胺形成動態(tài)

文安燕1，張帥1，曾海英1，2，秦禮康1*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025）

以水豆豉、黑豆豉、豆瓣醬及腐乳等貴州主要發(fā)酵豆制品為試材，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）方法，測定其各生產(chǎn)階段的丙烯酰胺含量。結(jié)果表明，在發(fā)酵前的熱處理環(huán)節(jié)中，均無丙烯酰胺形成；但發(fā)酵開始，隨著發(fā)酵過程的延伸，丙烯酰胺的含量呈上升趨勢。到發(fā)酵結(jié)束時，黑豆豉、水豆豉、豆瓣醬及腐乳樣品中丙烯酰胺含量分別達(dá)（15040±191）μg/kg、（16496±204）μg/kg、（16 821±45）μg/kg及（5 655±24）μg/kg，表明低溫發(fā)酵的豆制品體系中會形成大量丙烯酰胺，存在一定食用安全風(fēng)險。

丙烯酰胺；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；發(fā)酵豆制品

近年來，丙烯酰胺（acrylamide，AA）作為一種神經(jīng)毒性、遺傳毒性和致癌性化合物，被國際癌癥機(jī)構(gòu)（Interna tional Agencyfor Research on Cancer，IARC）列為2A類致癌物[1]，倍受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。自2002年4月瑞典斯德哥爾摩大學(xué)首次在油炸或焙烤的淀粉類食品中發(fā)現(xiàn)了含量高達(dá)12 800 μg/kg的丙烯酰胺后[2]，各國食品安全研究機(jī)構(gòu)對不同食品中丙烯酰胺的形成予以了極大關(guān)注，并對丙烯酰胺在食品中的分析檢測[3-5]、形成機(jī)理[6-8]、毒理[9-11]和抑制途徑[12-14]等方面展開了深入的研究。

目前，對食品中的丙烯酰胺研究主要集中在油炸品、烘烤谷物類、速溶咖啡及茶葉等。大量研究表明，在煎、烤、炸等高溫烹飪（＞120℃）條件下，天冬酰胺酸與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，是產(chǎn)生大量丙烯酰胺的主要途徑，同時油脂、蛋白質(zhì)和碳水化合物等成分在高溫條件下會生成丙烯醛進(jìn)而形成丙烯酰胺[15]。但是，較新的研究發(fā)現(xiàn)，在生理學(xué)條件下（37℃、pH7.4），天冬酰胺在被氧化的過程中，也能產(chǎn)生丙烯酰胺[16]，氨和丙烯醛可在各種溫度甚至在室溫下反應(yīng)生成丙烯酰胺[17]。張帥等[18-19]分別采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（highperformanceliquidchromatographytandem massspectrometer，HPLC-MS/MS）或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（gaschromatographytandemmassspectrometer，GC-MS/MS）測定，豆豉、豆瓣醬、腐乳、醬油等發(fā)酵豆制品的丙烯酰胺含量分別達(dá)1000～15000μg/kg、400～2000μg/kg、2000～8000μg/kg和5～1 152 μg/kg。

豆豉、醬油、腐乳和豆醬作為我國四大傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品，其營養(yǎng)保健功能日益引起世界各國食品界和醫(yī)學(xué)界的高度重視[20]。但是，由于豆類發(fā)酵品生產(chǎn)工藝的特殊性，發(fā)酵過程中易受原料品質(zhì)波動、雜菌污染以及環(huán)境因素的影響，存在較大的安全隱患，如生物胺、病源微生物及其毒素等內(nèi)源性污染物已被學(xué)者大量研究[21-23]，可對丙烯酰胺形成動態(tài)卻罕有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-MS/MS方法，對貴州主要發(fā)酵豆制品（包括黑豆豉、水豆豉、豆瓣醬及腐乳）不同加工階段的丙烯酰胺含量進(jìn)行動態(tài)分析，為進(jìn)一步探討傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中丙烯酰胺的形成機(jī)制、風(fēng)險評估以及控制措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料是根據(jù)生產(chǎn)工藝特點(diǎn)自貴州省發(fā)酵豆制品生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行取樣，包括：水豆豉生產(chǎn)中的泡豆、蒸煮、發(fā)酵及成品環(huán)節(jié)；黑豆豉生產(chǎn)中的泡豆、蒸煮、發(fā)酵初期、發(fā)酵終期及成品環(huán)節(jié)；豆瓣醬生產(chǎn)中的泡豆、蒸煮、發(fā)酵、配料及成品環(huán)節(jié)；腐乳后發(fā)酵期為1個月、3個月以及8個月時的樣品。

1.1.2 試劑

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99.8%）：美國Sigma公司；13C3-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99%）：英國Cambridge Isotope Laboratories；甲醇、甲酸（均為色譜純）：美國Tedia公司；Milli-Q超純水：Academic超純水系統(tǒng)制備；乙酸鋅、亞鐵氰化鉀（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-TQD Waters高效液相四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、6 mL 200mgOASIS固相萃取柱：美國Waters公司；X-22R冷凍離心機(jī)：美國BECKMAN公司；Multi Reax旋渦混合器：德國Heidolph公司。

1.3 方法

1.3.1 丙烯酰胺含量方法檢測

在GB 5009.204—2014《食品中丙烯酰胺的測定》的基礎(chǔ)上[24]，適當(dāng)調(diào)節(jié)流動相梯度比例，縮短檢測時間，提高檢測效率。

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取10.00 mg丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解并定容在100 mL棕色容量瓶中，配制成100μg/mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液并至于4℃冰箱中低溫保存。分別配制0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、1 μg/mL的AA標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品10.00mg，用超純水溶解并定容在100 mL棕色容量瓶中，配制成100 μg/mL的13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液并于-20℃條件下保存，再取1 mL內(nèi)標(biāo)儲備液于100 mL容量品種，用超純水稀釋成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)液。

（2）樣品的前處理

稱量與加內(nèi)標(biāo)：準(zhǔn)確稱取樣品1.0g于50mL聚丙烯離心管中，精密加入500 μL的13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)液（1 μg/mL），靜置10 min。

脫脂：向離心管加石油醚20 mL，充分振蕩15 min，待均勻分散后棄去石油醚，反復(fù)操作兩次。

提?。杭右宜徜\與亞鐵氰化鉀各3 mL進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，加入超純水定容至20 mL，振蕩15 min，冷凍離心（4℃、3 600 r/min）15 min，過濾待用。

純化：HLB固相萃取柱（6mL200mgOASIS）先用5mL甲醇活化和5 mL超純水平衡，吸取待用液2 mL緩慢通過HLB固相萃取柱，再用1 mL超純水淋洗，最后用2 mL 40%甲醇水溶液（含有0.01%甲酸）洗脫，收集洗脫液，過0.22 μm水相濾膜。

（3）高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLCC18HPLC柱（210mm×20mm，1.7 μm）；流動相：超純水∶甲醇=99∶1（其中分別加入0.1%甲酸）；柱溫：30℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。

（4）質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧ESI+模式；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：350℃；錐孔電壓：20V；質(zhì)譜躍遷模式：丙烯酰胺（m/z為72.2＞55.0，為定量離子對；m/z為72.2＞44.0，為定性離子對）能量碰撞為9 eV；13C3-丙烯酰胺（m/z為74.79＞58.0，為定性定量離子對）能量碰撞為10 eV。

（5）結(jié)果計(jì)算

按下式計(jì)算試樣中AA的含量。

式中：X為樣品中丙烯酰胺的含量，μg/kg；A為質(zhì)譜儀測定的丙烯酰胺的含量，ng/mL；2為待用液過HLB固相萃取柱體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量，g。

以上樣品中丙烯酰胺含量的檢測均重復(fù)檢測3次，測定結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

將0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見圖1。

不同地區(qū)有著自己國家不同的文化、生活習(xí)慣、語言、工作方式及宗教信仰，我國企業(yè)在管理本土化勞務(wù)的過程中，一定要對當(dāng)?shù)厝嗣竦纳盍?xí)慣、文化風(fēng)俗及宗教信仰等方面的內(nèi)容進(jìn)行充分的了解，避免在管理過程中出現(xiàn)糾紛的情況，使事情變得更加復(fù)雜[5]。因此，企業(yè)勞務(wù)管理人員應(yīng)及時與當(dāng)?shù)氐娜嗣襁M(jìn)行溝通，并制定相應(yīng)的管理辦法，提高管理水平。為此，企業(yè)應(yīng)定期加強(qiáng)管理人員及相關(guān)工作人員的培訓(xùn)學(xué)習(xí)，將“以人為本”的管理理念充分融入管理過程中，使我國的管理人員與當(dāng)?shù)氐膭趧?wù)人員相處的更加融洽。

圖1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of acrylamide

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（Y為響應(yīng)值，X為試樣質(zhì)量濃度）Y=81.827 6X+415.248，相關(guān)系數(shù)R2= 0.984 907，該方法在0.01～1 μg/mL都有良好的線性。

2.2 樣品前處理

本實(shí)驗(yàn)以13C3-丙烯酰胺為內(nèi)標(biāo)，質(zhì)量濃度為1 μg/mL，使用固相萃取柱進(jìn)行萃取，其中洗脫液（甲醇水溶液）的濃度對回收率影響較大。實(shí)驗(yàn)選取3組樣品，分別在甲醇體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%條件下對回收率進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。

表1 不同洗脫液濃度對回收率的影響Table 1 Effect of different eluent concentration on recovery rates

由表1可知，在甲醇體積分?jǐn)?shù)為40%時3組樣品的回收率較好，因此選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)40%為宜。

2.2 流動相的選擇

丙烯酰胺為強(qiáng)極性化合物，在一般反相色譜柱上保留較弱，即使以100%超純水也很難得到很好的保留，因此實(shí)驗(yàn)中選擇添加甲酸來改善質(zhì)譜的離子化效率，同時丙烯酰胺在質(zhì)譜儀中分解為正離子，這更能提高質(zhì)譜檢測靈敏度[25]，并顯著提高相應(yīng)強(qiáng)度。在水相中添加1%甲醇（0.1%甲酸）作為流動相，當(dāng)用超純水-甲醇（99∶1，0.1%甲酸）作為流動相時，與其他參考條件[26-27]比較，峰形較好且顯著地改善拖尾現(xiàn)象，而且當(dāng)加大流動相中超純水的比例時，丙烯酰胺的出峰時間適當(dāng)?shù)匮娱L從而導(dǎo)致目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰能夠有效分離開。

2.3 質(zhì)譜條件的確定

2.4 精密度和內(nèi)標(biāo)回收率

選擇腐乳、豆豉、豆瓣醬3種不同樣品基質(zhì)，分別添加3個不同加標(biāo)量內(nèi)標(biāo)液（13C3-AA1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL）各1mL。各加內(nèi)標(biāo)水平測量6次，作為精密度試驗(yàn)。以回收率作為衡量方法的準(zhǔn)確度，以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）作為方法的精密度。測定結(jié)果見表2。

表2 不同樣品的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)Table 2 Results of recovery rates of different samples(n=5)

由表2可知，腐乳的回收率在84.0%～88.3%，平均回收率為86.6%；豆豉的回收率在90.1%～93.1%，平均回收率為91.7%；豆瓣醬的回收率在83.9%～87.4%，平均回收率為85.0%。它們的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）（n=5）為3.7%～8.6%，均在允許范圍內(nèi)，符合殘留分析要求。因此，該方法可以用來分析測定腐乳、豆豉以及豆瓣醬中丙烯酰胺的含量。

2.5 發(fā)酵豆制品檢測結(jié)果

使用該方法對水豆豉、黑豆豉、豆瓣醬及腐乳等貴州主要發(fā)酵豆制品不同加工階段的丙烯酰胺的含量進(jìn)行測量。

2.5.1 水豆豉不同生產(chǎn)階段丙烯酰胺含量

對水豆豉泡豆、蒸煮、發(fā)酵（制曲）和成品階段的丙烯酰胺含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖2。

圖2水豆豉不同生產(chǎn)階段丙烯酰胺含量Fig.2 Contents of acrylamide in water Douchi from different producing stages

圖2 表明，在水豆豉生產(chǎn)階段中的泡豆和蒸煮環(huán)節(jié)，未檢測出丙烯酰胺，而在發(fā)酵階段檢測到了丙烯酰胺。通過檢測，發(fā)酵階段中丙烯酰胺含量為（13 228±64）μg/kg，成品中含量為（15 040±191）μg/kg，并且兩階段丙烯酰胺含量差異顯著（P＜0.05）。水豆豉制作工藝一般采用的是細(xì)菌，細(xì)菌型豆豉中主要的微生物是枯草芽孢桿菌。在制曲的過程中創(chuàng)造了一個高溫高濕的環(huán)境條件，大多數(shù)微生物生長受到抑制，枯草桿菌卻能迅速繁殖[28]。在較高溫度條件下，使之繁殖于蒸熟大豆上，借助其較強(qiáng)的蛋白酶系生產(chǎn)出風(fēng)味獨(dú)特的豆豉，且豆粒上布滿黏液、可牽拉成絲并有特殊臭味。而枯草芽孢桿菌在高溫高濕條件下發(fā)酵大豆，可能形成一種低溫（或常溫）、高濕（或液態(tài)）的非典型美拉德反應(yīng)體系，從而生成丙烯酰胺。

2.5.2 黑豆豉不同生產(chǎn)階段丙烯酰胺含量

對黑豆豉泡豆、蒸煮、發(fā)酵初期、發(fā)酵末期及成品階段的丙烯酰胺含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖3。

圖3黑豆豉不同生產(chǎn)階段丙烯酰胺含量Fig.3 Contents of acrylamide in black Douchi from different producing stages

圖3 表明，黑豆豉的生產(chǎn)階段中泡豆和蒸煮環(huán)節(jié)未檢測出丙烯酰胺，在發(fā)酵以及成品階段有丙烯酰胺。在發(fā)酵初期、末期及成品中丙烯酰胺含量分別為（9013±313）μg/kg、（13 619±723）μg/kg、（16 496±204）μg/kg，并且發(fā)酵初期的含量與末期以及成品含量差異顯著，發(fā)酵末期含量和成品含量差異顯著（P＜0.05）。對于黑豆豉，發(fā)酵過程結(jié)束加入烹制好的油辣椒，其成品丙烯酰胺含量與發(fā)酵末期相比，差異顯著，油辣椒的制作生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的丙烯酰胺對于成品中丙烯酰胺含量的影響較大，其產(chǎn)生的途徑可能是由于在油炸高溫環(huán)境下發(fā)生的美拉德反應(yīng)。

2.5.3 豆瓣醬不同生產(chǎn)階段丙烯酰胺含量

對豆瓣醬泡豆、蒸煮、發(fā)酵、配料及成品階段的丙烯酰胺含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖4。

圖4表明，在豆瓣醬的生產(chǎn)過程中，泡豆和蒸煮環(huán)節(jié)未產(chǎn)生丙烯酰胺，在發(fā)酵、配料以及成品階段有丙烯酰胺的產(chǎn)生。發(fā)酵期間、配料階段及成品中丙烯酰胺含量分別為（14855±107）μg/kg、（16337±44）μg/kg、（16821±45）μg/kg，并且發(fā)酵階段與配料及成品中丙烯酰胺含量兩兩差異顯著（P＜0.05）。發(fā)酵過程完結(jié)加入調(diào)料后，丙烯酰胺含量也有小范圍的上升，并且含量差異顯著，說明在鹽辣培的制作生產(chǎn)環(huán)節(jié)也會產(chǎn)生丙烯酰胺，其產(chǎn)生的途徑可能是由于在油炸高溫環(huán)境下發(fā)生的美拉德反應(yīng)。

圖4 豆瓣醬不同生產(chǎn)階段丙烯酰胺含量Fig.4 Contents of acrylamide in fermented bean paste from different producing stages

2.5.4 腐乳不同發(fā)酵階段丙烯酰胺含量

腐乳的生產(chǎn)，成品并非是直接經(jīng)過預(yù)處理如泡豆、蒸煮后接種發(fā)酵而制成的，在預(yù)處理之后，還要經(jīng)過原料性狀的變化，整個生產(chǎn)工藝比較繁雜且耗時長，難以取樣，故對腐乳后熟階段一個月、三個月和八個月階段的丙烯酰胺含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖5。

圖5腐乳不同發(fā)酵階段丙烯酰胺含量Fig.5 Contents of acrylamide in sufu from different fermented stages

圖5 表明，隨著腐乳發(fā)酵時間的延長，丙烯酰胺的含量出現(xiàn)上升的趨勢。發(fā)酵一個月、三個月及八個月中丙烯酰胺的含量分別為（4 057±123）μg/kg、（4 651±38）μg/kg、（5 655±24）μg/kg，并且這三個階段中丙烯酰胺含量差異顯著（P＜0.05）。

現(xiàn)有丙烯酰胺形成理論認(rèn)為，丙烯酰胺是由富含淀粉的食品原料在高溫（120～170℃）、低濕（水分含量5%）的美拉德反應(yīng)過程中產(chǎn)生的[6]。而從高濕態(tài)發(fā)酵的水豆豉、黑豆豉、腐乳、豆瓣醬等傳統(tǒng)發(fā)酵制品中檢測出高含量的丙烯酰胺，卻無法用現(xiàn)有形成理論來詮釋。豆類傳統(tǒng)發(fā)酵制品可能是一種低溫（或常溫）、高濕（或液態(tài)）的非典型美拉德反應(yīng)體系。對于本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，在發(fā)酵豆制品中，丙烯酰胺產(chǎn)生于微生物前發(fā)酵階段（即制曲階段），其形成機(jī)理是否也是由于微生物體內(nèi)某種氧化性物質(zhì)作用而產(chǎn)生，還有待進(jìn)一步研究分析。

3 結(jié)論

水豆豉、黑豆豉、豆瓣醬及腐乳等貴州主要發(fā)酵豆制品加工中，發(fā)酵前各工序均無丙烯酰胺形成；但隨著發(fā)酵時間的延長，丙烯酰胺的含量呈上升趨勢；發(fā)酵結(jié)束時，黑豆豉、水豆豉、豆瓣醬及腐乳樣品中丙烯酰胺含量分別達(dá)（15040±191）μg/kg、（16496±204）μg/kg、（16821±45）μg/kg及（5 655±24）μg/kg。通過探索在常溫、高濕條件下的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中丙烯酰胺動態(tài)變化，揭示了低溫、高濕條件下存在新的丙烯酰胺產(chǎn)生途徑或酶促機(jī)制，對進(jìn)一步研究丙烯酰胺的風(fēng)險控制具有重要的理論創(chuàng)新意義和實(shí)際應(yīng)用價值。

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Dynamic of acrylamide formation in main fermented soy products in Guizhou province

Using main fermented soy products in Guizhou province such as water Douchi,black Douchi,fermented bean paste and sufu as raw material,the acrylamide contents at different processing stages were determined with HPLC-MS/MS.The results showed that no acrylamide was produced at the heat treatment phase of materials.However,the acrylamide content was significantly increased at fermentation phase.At the end of fermentation,the acrylamide content of black Douchi,water Douchi,fermented bean paste and sufu reached(15 040±191)μg/kg,(16 496±204)μg/kg, (16 821±45)μg/kg and(5 655±24)μg/kg,respectively.It indicated that soy products in low temperature fermentation system could produce a large quantity of acrylamide,which may pose risks towards food safety.

acrylamide;HPLC-MS/MS;fermented soy products

TS264.2

0254-5071（2017）03-0085-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.018

2016-09-09

貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)（黔科合NY[2013]3049號）

文安燕（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橛椭c植物蛋白工程。

*通訊作者：秦禮康（1965-），男，教授，博士，研究方向?yàn)閭鹘y(tǒng)特色發(fā)酵食品工業(yè)化。

WEN Anyan1,ZHANG Shuai1,ZENG Haiying1,2,QIN Likang1*

(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store&Processing of Guizhou Province,Guiyang 550025,China)