塔城地區(qū)酸馬奶中耐乙醇乳酸菌的篩選與鑒定

金丹，蔣彩虹，蔣艾廷，喬傳麗，郭金鳳，盧士玲，李寶坤*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

塔城地區(qū)酸馬奶中耐乙醇乳酸菌的篩選與鑒定

金丹，蔣彩虹，蔣艾廷，喬傳麗，郭金鳳，盧士玲，李寶坤*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

以新疆塔城地區(qū)酸馬奶為研究對象，采用傳統(tǒng)方法初步篩選出乳酸菌共53株，通過生理生化試驗，確定有乳酸桿菌24株，乳酸球菌29株，以不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液進(jìn)行脅迫12 h。結(jié)果表明，乙醇對菌株的生長有抑制作用，篩選出對乙醇耐受性較強(qiáng)的菌株，其中菌株S7-1、S7-2、SMN3-3、SMN10-1、SNT16可耐受體積分?jǐn)?shù)13%的乙醇脅迫。通過總DNA序列分析，確定菌株SMN3-3為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），菌株SMN10-1為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus），菌株S7-1與S7-2為面包乳桿菌（Lactobacillus crustorum），菌株SNT16為乳酸片球菌（Lactobacillus fermentum）。

酸馬奶；乳酸菌；篩選；乙醇脅迫；鑒定

酸馬奶又被稱作“艾日格”或“策格”，是一種以生馬奶為原材料[1]，由乳酸菌與酵母菌共同發(fā)酵而成的歷史悠久的發(fā)酵乳飲品[2]，是哈薩克族與蒙古族等少數(shù)民族的傳統(tǒng)發(fā)酵飲品，且具有一定的保健功能，在日常飲食生活中占據(jù)重要地位。乳酸菌是一類能夠發(fā)酵糖類物質(zhì)產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱，其革蘭氏染色為陽性，形態(tài)多為桿狀或球狀[3-4]。生產(chǎn)發(fā)酵中所需的優(yōu)良乳酸菌應(yīng)具有良好的發(fā)酵性能和較強(qiáng)的耐受性[5]，以確保發(fā)酵制品被食用后微生物能夠在人體胃腸道中生存，這也是益生乳酸菌發(fā)揮其作用的關(guān)鍵所在[6]。

在發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中，乳酸菌自身會受到多種不利條件的影響，嚴(yán)重制約其自身的生長代謝能力，進(jìn)而將會影響乳酸菌功能作用與活性能力的發(fā)揮和利用[7]。如高酸、低溫、滲透壓改變、乙醇濃度影響等，其中，乙醇是在馬奶酒正產(chǎn)發(fā)酵中最常見的脅迫條件之一[8]。乙醇是一種能夠造成細(xì)胞膜通透性改變[9]、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流失、影響酶活性等的有機(jī)溶劑[10]。在菌體生長的過程中，乙醇濃度過高會對菌體的生理活性及其新陳代謝等方面造成不同程度的影響[11]。在對菌體進(jìn)行脅迫時，不僅要從生理角度了解脅迫機(jī)制，更需要從分子生物學(xué)方面對其進(jìn)行研究。目前國內(nèi)外對乳酸菌乙醇耐受性及其機(jī)理的研究較少。

本試驗以新疆塔城地區(qū)的酸馬奶樣品為研究對象，采用傳統(tǒng)方法對乳酸菌進(jìn)行初步篩選，通過不同乙醇溶液的脅迫作用，選取最佳耐受菌株，并對其進(jìn)行總DNA測序分析鑒定，以期為進(jìn)一步研究乳酸菌微觀結(jié)構(gòu)與代謝組學(xué)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸馬奶：分別取自新疆塔城地區(qū)奇巴吉爾（簡稱S）、種羊場（簡稱SMN）、圖爾滾村（簡稱SNT）農(nóng)牧民家庭自制。

MRS液體培養(yǎng)基[12-13]：蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，磷酸氫二鉀2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH為6.2～6.4，于121℃滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入15 g/L瓊脂，121℃滅菌20 min。

無水乙醇（體積分?jǐn)?shù)≥99.7%）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；細(xì)菌基因組總DNA提取試劑盒（離心柱型）、溶菌酶（活力單位＞20 kU/mg）、Marker Ι、2×PCR Mixture、ddH2O與EB染液：北京天根生化科技有限公司。

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）ATCC4356、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）ATCC19258、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）ATCC 29212：石河子大學(xué)食品學(xué)院畜產(chǎn)實驗室。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D雙人單面潔凈工作臺：江蘇蘇潔凈化設(shè)備有限公司；DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；XH-C旋渦混合器：金壇市醫(yī)療儀器廠；LDZX-30KB6立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SL2002N電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；伯樂BIO-RAD凝膠成像儀：美國GelDocXR公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

取1 mL酸馬奶樣品接種于50 mL MRS液體培養(yǎng)基，37℃活化24 h，用滅菌生理鹽水做10倍梯度稀釋至10-7。取三個適當(dāng)稀釋梯度（10-5、10-6、10-7）的菌液以同心圓形式涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，待菌落形成后，再用接種環(huán)挑取單個菌落，以井字形劃線接種到MRS固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行純化[14]。純化兩次后，觀察菌落形態(tài)特征，并對菌株進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。革蘭氏染色陽性、接觸酶陰性菌即為乳酸菌屬[15]。將已經(jīng)分離純化的菌株轉(zhuǎn)接到凍藏管上，在-18℃條件下保藏備用[16]。

1.3.2 乳酸菌生理生化試驗

對分離得到的菌株，參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》[17]對所分離的菌株進(jìn)行耐鹽性、運動性、硝酸鹽還原、糖醇發(fā)酵、葡萄糖產(chǎn)氣、吲哚試驗等生理生化試驗鑒定。

1.3.3 不同含量乙醇脅迫對乳酸菌存活率的測定[18]

選取對數(shù)生長末期的菌株，以2%的接種量加入不同含量（5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%）乙醇的培養(yǎng)基中[19]進(jìn)行乙醇脅迫12 h，脅迫后進(jìn)行梯度稀釋，選取適合梯度在MRS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布37℃培養(yǎng)48 h，每個稀釋度做3個平行試驗，測定菌株存活率。存活率計算公式如下：

式中：NA為未添加乙醇的活菌數(shù)，CFU/mL；NB為不同乙醇含量脅迫后的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

（1）菌株的DNA提取

采用細(xì)菌組總DNA提取試劑盒（離心柱型）進(jìn)行提取，按照說明書操作（第二步略做改動，在實驗操作第二步時需添加溶菌酶，37℃水浴30min，可用來破壞乳酸菌的細(xì)胞壁）。

（2）PCR擴(kuò)增

對所篩選菌株的16S rDNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。引物由上海生工股份有限公司合成，分別為上游引物341F（5-CCTACGGGN GGCWGCAG-3）和下游引物805R（5-GACTACHVGGGTA TCTAATCC-3），PCR反應(yīng)體系為50 μL，引物各2 μL，2 μL的DNA稀釋液，預(yù)混液25 μL，補充19 μL ddH2O至終體積為50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃預(yù)變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在凝膠成像儀中進(jìn)行觀察。擴(kuò)增后的產(chǎn)物由上海生工生物工程股份有限公司對其進(jìn)行測序，測序結(jié)果經(jīng)美國國立生物技術(shù)信息中心（NationalCenter for BiotechnologyInformation，NCBI）官網(wǎng)Nucleotide BLAST中的已知序列進(jìn)行比對[20]，選擇與其相似性最高的已知菌株，對兩者相似性進(jìn)行分析。使用MEGA 5軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩

從新疆塔城地區(qū)3份農(nóng)牧民家庭自制酸馬奶中所分離出的乳酸菌菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果如圖1所示。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)（A）和顯微鏡鏡檢（B）結(jié)果Fig.1 Results of colony morphology(A)and microscope inspection (B)of isolated strains

由圖1可知，采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)分離的方法，從新疆塔城地區(qū)的3份酸馬奶樣品中初步篩出53株乳酸菌，乳酸菌菌落顏色呈乳白色，有獨特氣味，表面微凸、光滑呈粘稠狀，均以單個菌落或成對出現(xiàn)于平板中。所篩選菌株革蘭氏染色均為陽性，接觸酶陰性，鏡檢后發(fā)現(xiàn)所篩得的菌株分為桿狀與球狀兩種形態(tài)，其中桿菌有24株，球菌有29株。

2.2 生理生化試驗結(jié)果

對桿菌分離株屬特性的鑒定時，所分離到的24株桿菌接觸酶試驗、硝酸鹽還原試驗、6.5%NaCl均不生長，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，因此鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillus）。29株無芽孢球菌，革蘭氏染色陽性、接觸酶試驗、硝酸鹽還原試驗、葡萄糖產(chǎn)氣試驗均為陰性，其結(jié)果與對照菌株一致，從而將這29株分離菌鑒定為乳酸球菌。以標(biāo)準(zhǔn)菌株嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）ATCC4356及嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）ATCC19258與糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）ATCC29212為參考。參照《乳酸菌細(xì)菌分類鑒定及實驗方法》[14]和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》[17]對24株乳桿菌及29株乳酸球菌進(jìn)行糖醇發(fā)酵與最適生長溫度等生理生化試驗，將生理生化及糖醇發(fā)酵結(jié)果相同的菌株分為一類，選取其中一株為代表菌株進(jìn)行鑒定試驗。

表1 乳酸菌生理生化試驗鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of physiological and biochemical experiments of lactic acid bacteria

由表1可知，結(jié)合生理生化與糖醇發(fā)酵試驗結(jié)果，菌株SMN3-3可發(fā)酵多種糖類，但不發(fā)酵鼠李糖與木糖，且15℃條件下生長，即鑒定為干酪乳桿菌，而菌株S6-1對乳糖、木糖等均不發(fā)酵，即判斷為消化乳桿菌。菌株S7-1在15℃條件下不生長且不發(fā)酵甘露醇，可將其鑒定為詹氏乳桿菌，而將不發(fā)酵木糖與山梨醇的菌株S3-1鑒定為耐酸乳桿菌。菌株S7-2不發(fā)酵乳糖、半乳糖、木糖與兩種醇類，將其鑒定為德式乳桿菌，但菌株SMN10-1可發(fā)酵鼠李糖在內(nèi)的單糖及多糖，即判斷為糖乳桿菌。菌株SMN5-1在15℃條件下生長但不發(fā)酵鼠李糖，可鑒定為植物乳桿菌，將15℃條件下不生長但可發(fā)酵蔗糖等多種糖類的菌株SNT15鑒定為發(fā)酵乳桿菌。

菌株SNT8在pH9.6與6.5%NaCl環(huán)境中及在15℃、45℃條件下也均可生長，可發(fā)酵甘露醇，不發(fā)酵山梨醇，將其鑒定為糞腸球菌。菌株S1-1在pH9.6、6.5%NaCl與15℃條件下均不生長，且不發(fā)酵麥芽糖、木糖、甘露醇，可將其鑒定為嗜熱鏈球菌。菌株SNT10在15℃、45℃條件下及pH9.6、 6.5%NaCl環(huán)境中均能生長，但不發(fā)酵山梨醇與甘露醇，將其鑒定為植物乳球菌。菌株SNT16在15℃條件下不生長，45℃條件下生長，可發(fā)酵鼠李糖，不發(fā)酵甘露醇、山梨醇與蔗糖，將其鑒定為乳酸片球菌。

2.3 乙醇脅迫試驗篩選結(jié)果

將篩選出的12株菌株進(jìn)行乙醇脅迫試驗，結(jié)果如表2所示。由表2可知，在體積分?jǐn)?shù)為5%乙醇脅迫后，菌株均能夠存活，其最高存活率為31.95%，最低僅為1.24%，而在體積分?jǐn)?shù)為8%乙醇脅迫時，菌株的存活率有明顯的下降，乙醇脅迫效果達(dá)顯著水平（P＜0.05）。與朱敏等[21]研究結(jié)果相似，均在乙醇含量8%時有較大幅度的降低，但其菌株最高耐受乙醇含量為8%，而本試驗在繼續(xù)提高乙醇含量時發(fā)現(xiàn)，在體積分?jǐn)?shù)為9%乙醇脅迫時會有部分菌株死亡，僅5株菌株（S7-1、S7-2、SMN3-3、SMN10-1、SNT16）能夠耐體積分?jǐn)?shù)為13%乙醇脅迫，但在體積分?jǐn)?shù)為14%乙醇脅迫時，存活率極低。因此所篩菌株可最高耐受體積分?jǐn)?shù)為13%乙醇脅迫，并且隨著乙醇含量的增加，菌株存活率逐步降低，故乙醇對菌株的生長具有抑制作用。

表2 乙醇脅迫試驗結(jié)果Table 2 Results of ethanol stress experiments

2.4 16S rDNA序列分析

2.4.1 16S rDNA分析

在對菌株進(jìn)行乙醇脅迫后，對最終篩的5株菌株（S7-1、S7-2、SMN3-3、SMN10-1、SNT16）的16SrDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而后經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可知，除Marker條帶外得到5條清晰的特異性條帶，片段大小均在400～500 bp間。

圖2 5株菌的16S rDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoretogram of 16S rDNA of 5 strains

2.4.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對所篩選出的5株菌（S7-1、S7-2、SMN3-3、SMN10-1、SNT16）進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，對所擴(kuò)增的16S rDNA序列進(jìn)行分析，分析結(jié)果與BLAST中的已知序列進(jìn)行比對，選擇與其相似性最高的已知菌株，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。

圖3 基于16S rDNA的耐受乙醇菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA of ethanol tolerant strains

由圖3可知，菌株SMN3-3、SMN10-1與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）及鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）的同源性為100%，菌株SNT16與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的同源性為98%，菌株S7-1、S7-2與面包乳桿菌（Lactobacillus crustorum）的同源性為100%。因其同源性較高，故將菌株SMN3-3鑒定為副干酪乳桿菌（Lactobacillusparacasei）、菌株SMN10-1鑒定為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、菌株S7-1與S7-2鑒定為面包乳桿菌（Lactobacillus crustorum），菌株SNT16鑒定為乳酸片球菌（Lactobacillus fermentum）。

3 結(jié)論

本研究以新疆塔城地區(qū)乳樣為原料，共分離出53株乳酸菌，經(jīng)生理生化試驗后鑒定有乳酸桿菌共24株，乳酸球菌共29株。通過對所篩選出的12株菌株進(jìn)行乙醇脅迫，其中菌株S7-1、S7-2、SMN3-3、SMN10-1、SNT16可耐受濃度為13%的乙醇脅迫。對所篩選5株菌進(jìn)行16S rDNA序列分析，結(jié)果表明，菌株SMN3-3被鑒定為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），菌株SMN10-1被鑒定為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus），菌株S7-1與S7-2被鑒定為面包乳桿菌（Lactobacillus crustorum），菌株SNT16被鑒定為乳酸片球菌（Lactobacillus fermentum）。為進(jìn)一步研究乳酸菌受乙醇脅迫后微觀結(jié)構(gòu)差異提供理論基礎(chǔ)，使得耐受乙醇微生物資源庫的到擴(kuò)充和廣泛的應(yīng)用。

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Screening and identification of ethanol tolerance lactic acid bacteria from Tacheng kumiss

JIN Dan,JIANG Caihong,JIAN Aiting,QIAO Chuanli,GUO Jinfeng,LU Shiling,LI Baokun*
(College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

Using the kumiss in Xinjiang Tacheng prefecture as research object,53 strains of lactic acid bacteria were screened preliminarily,in which 24 strains wereBacillusspp.and 29 strains wereCoccusspp.by physiological and biochemical experiments.The strains screened were stressed with different concentrations of ethanol solution for 12 h.The results showed that ethanol had an inhibitory effect on the growth of the strains.The strains with high ethanol tolerance were screened,including strains S7-1,S7-2,SMN3-3,SMN10-1 and SNT16 which could tolerate concentration of 13% ethanol.By total DNA sequence analysis,the strain SMN3-3 and SMN10-1 were identified asLactobacillus paracaseiandLactobacillus rhamnosus, respectively.Strain S7-1 and S7-2 were identified asLactobacillus crustorum,and strain SNT16 was identified asLactobacillus fermentum.

kumiss;lactic acid bacteria;screening;ethanol stress;identification

TS201.3

0254-5071（2017）03-0044-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.010

2016-11-21

國家自然科學(xué)基金地區(qū)項目（31560444）

金丹（1992-），女，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品加工與安全。

*通訊作者：李寶坤（1979-），男，副教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。