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    海洋枝頂孢霉BH0531發(fā)酵液殺線蟲組分的分離及活性測定

    2017-04-07 12:53:26劉曉霞李娜苗麗華申佩娟馮欣孟慶恒孫建華
    中國釀造 2017年3期
    關(guān)鍵詞:孢霉代謝物發(fā)酵液

    劉曉霞,李娜,苗麗華,申佩娟,馮欣,2,孟慶恒,2*,孫建華,2

    (1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,天津300387;2.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300387)

    海洋枝頂孢霉BH0531發(fā)酵液殺線蟲組分的分離及活性測定

    劉曉霞1,李娜1,苗麗華1,申佩娟1,馮欣1,2,孟慶恒1,2*,孫建華1,2

    (1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,天津300387;2.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300387)

    實(shí)驗(yàn)采用生物活性跟蹤法,通過超濾、Sephadex凝膠層析、離子交換樹脂、硅膠板薄層層析,以及特異性鑒別染色等方法對海洋枝頂孢霉BH0531發(fā)酵液的殺線蟲活性組分進(jìn)行分級分離和初步的性質(zhì)分析。結(jié)果表明,Sephadex凝膠柱層析(G-25,G-10)可有效分離獲得殺線蟲活性組分,3 d的線蟲校正死亡率達(dá)98.33%;以正丁醇:水:無水乙醇=1∶1∶1(V/V)為展開劑的薄層層析,可將活性組分有效分離,Rf=0.31,斑點(diǎn)洗脫物的線蟲校正死亡率達(dá)到94.00%;定性染色結(jié)果顯示,茚三酮反應(yīng)陽性,證實(shí)有α-氨基存在,茚三酮吡啶呈紅色,顯現(xiàn)出寡肽性質(zhì);雙甲酮染色呈亮黃色,表明具有酮糖性質(zhì)。結(jié)果表明,BH0531殺線蟲活性代謝物應(yīng)為含有酮糖基團(tuán)的短肽類化合物。

    海洋枝頂孢霉;殺線活性組分;活性跟蹤;分離

    植物寄生線蟲是一類世界性分布的重要植物病原物,全球每年因植物線蟲造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)千億美元[1],已成為僅次于真菌病害的第二大植物病害[2],防控形勢嚴(yán)峻。真菌殺線劑(具殺線活性的代謝產(chǎn)物)作為繼殺線蟲活菌劑(淡紫擬青霉活菌劑)之后的第二代生防制劑,已引起國際上的廣泛重視[3]。而海洋真菌因其特殊的生境,秉承了代謝物種類和代謝途徑的多樣性,業(yè)已成為尋找新型殺線蟲活性物質(zhì)的的資源庫。已有來自海洋的真菌Lachnumpapyraceum(Karst.)產(chǎn)生的異香豆素(isocoumarin)的鹵化衍生物被證實(shí)具有明顯的殺線蟲活性[4];澳大利亞學(xué)者從南澳大利亞海篩選出兩株具有殺線蟲活性的海洋真菌Aspergilluscaneus和Raspailiasp.[5]。肖永堂等[6]對188株海洋真菌代謝物進(jìn)行了殺線蟲毒力測定,并觀察到一株海洋真菌的代謝物對小桿線蟲有作用,推測該菌株代謝物作用機(jī)理可能與伊維菌素類似,是一種神經(jīng)毒劑。郭道森等[7]先后從青島近海分離得到了具有殺線活性的輪枝孢霉(Verticilliumsp.)和青霉(Penicilliumsp.)。這些研究進(jìn)展顯示,從海洋真菌中篩選殺線蟲活性代謝物已成為可能。

    海洋枝頂孢霉BH0531是一株從渤海水域自主分離得到的具有明確殺線蟲活性的絲狀真菌,其殺線活性與代謝產(chǎn)物密切相關(guān)[8]。進(jìn)一步的黃瓜盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),該菌所產(chǎn)生的活性代謝物對南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)同樣有明確的殺線活性,并使根結(jié)指數(shù)明顯降低,同時(shí)還具有改善土壤微生態(tài)環(huán)境的作用[9];研究還發(fā)現(xiàn),發(fā)酵液對染病植株的生長及保護(hù)酶具有促進(jìn)作用[10],而對線蟲體內(nèi)保護(hù)酶則呈現(xiàn)出抑制作用[11]?;钚晕镞€具有分子質(zhì)量小、水溶性好、耐熱和pH適應(yīng)范圍寬的特點(diǎn)[8]。為進(jìn)一步明確其活性組分的理化特性,闡明相關(guān)物質(zhì)與殺線蟲功能的關(guān)系,實(shí)驗(yàn)采用生物活性跟蹤法,以松材線蟲為靶標(biāo)線蟲,對殺線蟲活性組分進(jìn)行了初步的分離純化和殺線活性測定,旨在為菌株BH0531的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 供試菌株

    海洋枝頂孢霉(Acremoniumsp.)BH0531,菌種保藏號CGMCC-5445:由天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.1.2 供試線蟲

    松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus):中國農(nóng)科院植保所提供。

    1.1.3 供試培養(yǎng)基

    活化培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potatodextrose agar,PDA)):去皮土豆200 g/L煮汁,葡萄糖20 g/L,瓊脂15 g/L,pH自然。121℃、0.1 MPa滅菌20min。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:去皮土豆200 g/L(浸汁),葡萄糖20 g/L,pH自然。121℃、0.1 MPa滅菌20 min。

    1.1.4 供試藥品

    葡聚糖凝膠Sephadex G-25、G-10:北京索萊寶科技有限公司;離子交換樹脂:南開大學(xué)化工廠;水合茚三酮:天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;雙甲酮(98%):北京百靈威科技有限公司;正丁醇、吡啶、甲醛(均為分析純):天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;HSGF245薄層層析硅膠板:煙臺市黃務(wù)硅膠開發(fā)試驗(yàn)廠。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Centrifuge 5810R型冷凍離心機(jī):德國Eppendorf AG公司;SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;GZX-9140MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;BSZ-100型自動(dòng)部分收集器:上海滬西分析儀器廠;TP10-20型超濾泵、MT系列UEOS-503中空纖維膜組件(50 mm×386 mm,截留分子質(zhì)量6 ku):天津天膜工程技術(shù)有限公司;UV-2550型紫外可見分光光度儀:美國Varian公司;DME/MVC2000型顯微鏡:德國徠卡公司;凝膠柱層析(0.5 cm×40 cm):上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠;96孔板:美國Costar公司;無菌式針頭過濾器(0.22 μm孔徑):德國Sartorius公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 發(fā)酵液小分子粗提物的制備

    將4℃保藏的海洋枝頂孢霉BH0531菌種接入活化培養(yǎng)基(PDA),26℃條件下生化培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)7 d活化。加入無菌水洗下孢子,制備成106個(gè)/mL的孢子懸液,以1%的接種量將孢子懸液接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,26℃、120 r/min培養(yǎng)4 d[12]。將發(fā)酵好的發(fā)酵液8 000 r/min離心30 min除菌體,再經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾,即為發(fā)酵大分子濾液。采用截留分子質(zhì)量為6 000 u的中空纖維膜組件對發(fā)酵濾液進(jìn)行超濾。超濾后濾液置于真空干燥箱內(nèi),抽真空710 MPa,50~60℃進(jìn)行干燥。

    1.3.2 代謝物分級分離及殺線蟲活性

    Sephadex G-25凝膠柱層析:取1.48 g萃取后真空干燥濃縮的發(fā)酵液干物質(zhì)溶于10 mL無菌水中,經(jīng)過孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾后,上樣量為1 mL,超純水做洗脫劑。通過恒流泵控制流速1mL/管,用自動(dòng)收集器收集30管。共收集10次,收得總液體300 mL,平均每個(gè)組分10 mL。將分離收集得到的分離活性物的每個(gè)組分的10 mL液體濃縮為2.5 mL,分別檢測殺線蟲活性。Sephadex G-10凝膠柱層析:將經(jīng)過Sephadex G-25凝膠柱有活性管合并,過G-10凝膠柱收集(同上G-25),做殺線活性檢驗(yàn)。

    1.3.3 分離物性質(zhì)及活性分析

    溶解性質(zhì)采用水飽和乙酸乙酯萃取法,將分離物萃取3次后收集酯相和水相,分別檢測殺線活性,以判斷活性代謝物的溶解性質(zhì)。萃取后有活性相,分別采用001×7型陽離子交換樹脂和201×7型陰離子交換樹脂分離活性組分,并通過殺線活性分析判斷帶電荷情況。裝柱高2/3、平衡、上樣量1 mL、超純水洗脫。

    1.3.4 活性組分的薄層分離及初步定性分析

    以正丁醇∶水∶無水乙醇(1∶1∶1,V/V)的比例作為展開劑,在10cm×5cm的硅膠板下端1cm處點(diǎn)樣,點(diǎn)樣間距為1.5cm,密閉式展開,展開方式為上行展開,展開時(shí)間為90 min。用茚三酮溶液(0.2 g本品溶于100 mL無水乙醇)噴板,于110℃烘箱內(nèi)烘烤30 min顯色檢驗(yàn)α-氨基酸[13];用1%茚三酮吡啶溶液與冰醋酸按5∶1混合,噴板后于100℃加熱5 min顯色檢驗(yàn)二肽或三肽短肽類物質(zhì);用雙甲酮溶液(10 g雙甲酮溶于90 mL乙醇與10 mL 85%磷酸中)顯色,噴板后于110℃加熱15~20 min檢驗(yàn)酮糖[14]。根據(jù)顯色的Rf值將斑點(diǎn)溶解做殺線活性檢驗(yàn)。斑點(diǎn)洗脫物進(jìn)一步在波長200~600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長掃描,并以超純水作空白校準(zhǔn)基線,用以判定紫外吸收特性。

    1.3.5 殺線蟲活性(殺線率)的測定方法

    以無菌水為對照組,松材線蟲為靶標(biāo)線蟲,取無菌96孔板,每孔加入100 μL的靶標(biāo)懸蟲液(約100頭),再將收集的分離液分別取100 μL等體積加入。設(shè)3組重復(fù),26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d于顯微鏡下觀測靶標(biāo)線蟲的死亡情況,線蟲校正死亡率的公式為:

    2 結(jié)果與分析

    2.1 分級分離物及殺線蟲活性

    超濾獲得的菌株BH0531發(fā)酵液粗提物進(jìn)一步經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱層析分離,分離結(jié)果如表1所示。

    表1 菌株BH0531發(fā)酵液G-25凝膠柱層析分離的各組分線蟲存活率(3 d)Table 1 Mortality for each component of BH0531 fermentation broth by G-25 gel chromatography on nematodes(3 d)

    從表1可以看出,殺線活性組分主要集中在13~25管收集物(殺線率≥60%),達(dá)到A級(殺線率≥90%)的有5管,其中殺線率≥95%的主要集中在14~17管,處于分離過程的中段區(qū)域。另有5管(18~21、24管)達(dá)到B級(殺線率≥80%),主要出現(xiàn)在分離過程的后段。這一現(xiàn)象表明,活性組分為Sephadex G-25分離范圍內(nèi)的分子質(zhì)量相對較小的組分。先行收集的相對分子質(zhì)量較大的組分未表現(xiàn)出明顯的殺線活性(殺線率≤40%)。在此基礎(chǔ)上,將G-25凝膠柱分離收集的有活性管合并,進(jìn)一步進(jìn)行了分離范圍更小的Sephadex G-10凝膠柱分離檢驗(yàn),結(jié)果顯示,G-10凝膠柱的分離物3 d的線蟲死亡率為88.72%,校正死亡率達(dá)到88.20%,接近A級。提示活性物質(zhì)的分子質(zhì)量介于G-25分離范圍的下限和G-10的上限之間。

    2.2 分離物性質(zhì)及活性分析

    為進(jìn)一步判別活性組分的理化性質(zhì),實(shí)驗(yàn)采用水飽和乙酸乙酯萃取和離子交換的方法對分離物進(jìn)行了進(jìn)一步的分離和活性檢驗(yàn),結(jié)果見表2。

    表2 菌株BH0531發(fā)酵液不同萃取相的殺線蟲活性(3 d)Table 2 Nematicidal activity of different extraction phases of BH0531 fermentation broth(3 d)

    由表2可知,分離物的殺線蟲活性主要出現(xiàn)在水相組分,校正死亡率達(dá)到B級,而酯相殺線活性較弱,表明殺線蟲活性組分為具有一定極性的水溶性物質(zhì)。

    用處理好的001×7型陽離子交換樹脂、201×7型陰離子交換樹脂洗脫分離物見表3。

    表3 菌株BH0531發(fā)酵液水相萃取物離子交換樹脂的殺線蟲活性(3 d)Table 3 Nematicidal activity of aqueous phase of BH0531 fermentation broth by different anion-exchange resins(3 d)

    由表3可知,經(jīng)過陽離子交換并洗脫后殺線蟲校正死亡率達(dá)91.24%,而201×7型陰離子樹脂交換后,因結(jié)合牢固而未能將活性組分洗脫下來。表明海洋枝頂孢霉BH0531殺線蟲活性物質(zhì)含有較強(qiáng)的正電荷。

    2.3 分離物屬性的定性分析

    對G25凝膠柱分離的菌株BH0531殺線活性物進(jìn)行了進(jìn)一步的硅膠板薄層層析色譜分離,紫外觀察可見到明顯的分離物顯色斑點(diǎn)(圖1A),茚三酮乙醇溶液染色呈陽性(圖1B),表明分離物含α-氨基,印證了前期研究提出的活性物可能為含氮糖類的推測[12]。隨后的茚三酮吡啶溶液染色可見紅色顯色斑點(diǎn)(Rf3=0.31),提示該組分應(yīng)為二肽或三肽(圖1C)。雙甲酮溶液染色可見到亮黃色斑點(diǎn)組分(Rf4=0.31),表明含有酮糖基團(tuán)(圖1D)。紫外-可見光全波長掃描結(jié)果顯示(圖2),在波長217.5 nm處有單一較大吸收峰(Abs=3.704),表明活性組分存在n→π*、π→π*躍遷的吸收帶,提示有C=O,N=O等基團(tuán)[15]。依據(jù)Rf對未染色的相應(yīng)組分進(jìn)行洗脫并進(jìn)行殺線活性檢驗(yàn)的結(jié)果表明,3 d的線蟲校正死亡率為94.32%,證實(shí)該組分即為殺線蟲活性組分。

    圖1 分離物硅膠板薄層層析色譜分離及顯色結(jié)果Fig.1 Isolation and chromogenic results of silica gel plate by thin layer chromatography

    圖2 分離物紫外可見全波長掃描結(jié)果Fig.2 Scanning results of ultraviolet visible wavelength of the separated products

    3 結(jié)論

    上述研究結(jié)果表明,采用殺線蟲活性跟蹤檢測的方法,經(jīng)6 000 u超濾、Sephadex G-25、G-10凝膠柱層析等分級分離方法可有效獲得海洋枝頂孢霉BH0531殺線蟲活性組分,活性物殺線蟲校正死亡率最高可達(dá)98.33%。進(jìn)一步的水飽和乙酸乙酯萃取法萃取、離子交換結(jié)果證實(shí)該活性組分為帶正電的水溶性物質(zhì)。硅膠板薄層層析可進(jìn)一步分離、并純化獲得該組分。定性分析結(jié)果表明,殺線蟲活性組分應(yīng)為含有酮糖基團(tuán)的短肽類物質(zhì)。這類物質(zhì)的生物活性在其他領(lǐng)域已有研究報(bào)道,如MALMSTRM J等[17]在裸孢殼菌Emericella variecolor代謝物中發(fā)現(xiàn)三種聚酮varitriol,varioxirane,dihydroterrein具有抗菌作用;CHEN Z M等[18]在海洋真菌枝頂孢霉SCSIO 115的發(fā)酵液中分離了對腫瘤細(xì)胞具有毒性的三種新環(huán)肽。但在殺線蟲活性的研究中的有相關(guān)報(bào)道還不多見,其具體化學(xué)結(jié)構(gòu)和殺線蟲作用的機(jī)理還有待進(jìn)一步的深入研究。

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    Separation and activity determination of nematicidal components from marine-derived Acremoniumsp.BH0531 fermentation broth

    LIU Xiaoxia1,LI Na1,MIAO Lihua1,SHEN Peijuan1,FENG Xin1,2,MENG Qingheng1,2*,SUN Jianhua1,2
    (1.College of Life Science,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China;2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, Tianjin 300387,China)

    The nematicidal active components from marine-derivedAcremoniumsp.BH0531 fermentation broth were fractionated and preliminarily identified through the methods of ultra-filtration,Sephadex gel chromatography,anion-exchange resin,thin layer chromatography(TLC),as well as specific differential staining under the guidance of bio-active assay.The results showed that the nematicidal active components were separated and purified effectively by Sephadex G-25 and Sephadex G-10 gel chromatography,the adjusted mortality of the nematodes at 3 d was up to 98.33%.The TLC results indicated that the active components can be effectively separated using 1-butanol,H2O,anhydrous ethanol(1∶1∶1)(V/V)as developing solvent,Rf=0.31.The spot of silica gel plate,which adjusted mortality of the nematodes was 94.00%.The qualitative staining results indicated that the inhydrin color reaction was positive,which proved the presence of α-amino group.The inhydrin pyridine color reaction was red,showing oligopeptide properties.The dimedone staining was bright yellow,showing the properties of ketose.These results suggested that the marine-derived fungusAcremoniumsp.BH0531 fermentation broth with nematicidal activity should contain oligopeptides compounds with ketose groups.

    marine-derivedAcremoniumsp.;nematicidal active components;activity tracking;separation

    Q939.9

    0254-5071(2017)03-0035-04

    10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.008

    2017-01-01

    國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31272019);天津市自然基金聯(lián)合項(xiàng)目(15JCYBJC51400)

    劉曉霞(1992-),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槲⑸锏幕钚晕镔|(zhì)。

    *通訊作者:孟慶恒(1963-),副教授,碩士,研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。

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