摻鍶聚磷酸鈣骨修復(fù)材料的制備及其對成骨細(xì)胞增殖的影響

俞雷鈞

（浙江省立同德醫(yī)院骨傷科，浙江杭州 310012）

摻鍶聚磷酸鈣骨修復(fù)材料的制備及其對成骨細(xì)胞增殖的影響

俞雷鈞

（浙江省立同德醫(yī)院骨傷科，浙江杭州 310012）

目的改進聚磷酸鈣的力學(xué)特性和生物活性，為臨床骨修復(fù)提供新材料。方法制備摻鍶聚磷酸鈣骨修復(fù)材料，采用萬能材料試驗機測試抗壓強度，并采用噻唑藍(lán)（MTT）比色法考察其對成骨細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果摻鍶聚磷酸鈣多孔支架的抗壓強度為（212.4±5.3）MPa，明顯大于聚磷酸鈣多孔支架的（172.5±8.3）MPa（P＜0.05）；摻鍶聚磷酸鈣多孔支架降解0，7，14，21 d時的抗壓強度均大于聚磷酸鈣多孔支架，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝8.907，8.222，8.302，7.445，P＜0.05）。MTT比色法結(jié)果表明，培養(yǎng)3，4，5 d后，摻鍶聚磷酸鈣、聚磷酸鈣作用的成骨細(xì)胞的吸光度（A）值高于陰性對照，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝2.559，6.000，4.533，2.546，3.574，2.932，P＜0.05）；培養(yǎng)4，5 d后，摻鍶聚磷酸鈣作用的成骨細(xì)胞的A值高于聚磷酸鈣，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝2.733，2.038，P＜0.05）。結(jié)論新型骨修復(fù)材料摻鍶聚磷酸鈣具有良好的抗壓特性，并能促進成骨細(xì)胞的增殖，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

摻鍶聚磷酸鈣；骨修復(fù)材料；抗壓強度；成骨細(xì)胞增殖

骨修復(fù)材料的研究核心，在于制作可作為支架的生物相容性材料，并能與細(xì)胞復(fù)合，這就要求骨修復(fù)材料必須有良好的細(xì)胞相容性，置入體內(nèi)后，其生物降解速率應(yīng)與骨的生理生長速率相匹配，且降解產(chǎn)物應(yīng)對正常組織無毒性；此外，骨修復(fù)材料還應(yīng)能誘導(dǎo)骨內(nèi)形成新的血管以供給細(xì)胞營養(yǎng)，并促進自身降解[1－3]。優(yōu)良的骨修復(fù)材料應(yīng)具有良好的力學(xué)強度，并有利于骨修復(fù)階段中成骨作用。聚磷酸鈣是近年來臨床應(yīng)用廣泛的骨修復(fù)材料，具有良好的生物活性、生物相容性與生物可降解性[4]。鍶是人體的必需元素，具有促進骨形成、抑制骨吸收的作用。將鍶元素?fù)饺刖哿姿徕}中，可能會改變聚磷酸鈣的生物活性[5]。據(jù)此，筆者制備了一種新型的摻鍶聚磷酸鈣骨修復(fù)材料，并考察其對成骨細(xì)胞增殖的影響，旨在改進聚磷酸鈣的力學(xué)特性和生物活性，為骨科臨床提供新的骨修復(fù)材料。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器

AG－10TA型電子萬能試驗機（日本島津公司）；MCO－18AIC型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；BIO－RAD608型酶標(biāo)儀（美國BioRad公司）；IX2－SL型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.1.2 材料與試藥

大鼠ROS17／2.8成骨細(xì)胞株，購自四川大學(xué)華西醫(yī)院移植工程與移植免疫實驗室。碳酸鍶（分析純，成都市科龍化工試劑廠，批號為1405231）；碳酸鈣（分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司，批號為150117）；DMEM培養(yǎng)基、胰酶（美國GIBCO公司）；胎牛血清（北京圣馬元亨生物制品研究所）；噻唑藍(lán)（MTT，美國Sigma公司）；聚乙烯醇（分析純，重慶北碚精細(xì)化工廠）；磷酸、二甲亞砜、乙酸異戊酯、無水乙醇（國藥化學(xué)試劑有限公司），均為分析純。

1.2 制備方法

按照鍶／鈣的物質(zhì)的量百分比5%分別稱取碳酸鍶和碳酸鈣，加入磷酸溶液中反應(yīng)，生成相應(yīng)的磷酸二氫鹽，室溫放置至少12 h，用無水乙醇去除剩余的磷酸至pH＝6，將上述混合鹽置坩堝內(nèi)，500℃恒溫下煅燒12 h，再以15℃／min的速率逐漸升溫至1 200℃，此時混合鹽熔融，再保溫1 h后淬火，獲得摻鍶聚磷酸鈣無定型燒料。研磨無定型燒料，過200目篩，另取過60目篩硬脂酸作為致孔劑，聚乙烯醇作為黏合劑，與摻鍶聚磷酸鈣粉末充分混合，壓制成高20 mm、直徑10 mm的胚，在800℃恒溫下持續(xù)燒制3 h，制得含鍶量物質(zhì)的量百分比為5%的摻鍶聚磷酸鈣多孔支架。

1.3 抗壓強度測定

采用萬能材料試驗機，設(shè)置加壓速度為6 mm／min，測定摻鍶聚磷酸鈣多孔支架的軸向破壞載荷，并根據(jù)破壞載荷和材料的截面積計算抗壓強度。此外，評價摻鍶聚磷酸鈣多孔支架在降解過程中的抗壓強度，采用恒溫水浴振蕩器，振蕩頻率為2 Hz，溫度為（37±0.5）℃，降解液采用三羥基甲基氨基甲烷的氯化氫溶液，試驗pH模擬生理pH（7.4±0.2），并以不加鍶的聚磷酸鈣多孔支架作為對照，分別于0，7，14，21 d時取出多孔支架，測定抗壓強度，比較抗壓強度的差異。

1.4 成骨細(xì)胞增殖情況考察

不同材料對成骨細(xì)胞增殖的影響采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測[6－7]。將摻鍶聚磷酸鈣、聚磷酸鈣在121℃下高壓滅菌20 min，按照培養(yǎng)液與試樣表面積之比為100 L／m2，無菌浸提72 h制作材料浸提液。在96孔板的每孔中加入成骨細(xì)胞懸液與材料浸提液各100 μL，成骨細(xì)胞接種濃度4×107／L；陰性對照孔則僅加入200 μL培養(yǎng)液（n＝8）；37℃恒溫培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)1，2，3，4，5 d后加入20 μL MTT，并繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再吸出孔中的培養(yǎng)液，每孔加二甲基亞砜150 μL，置振蕩器上振蕩15 min，然后采用酶標(biāo)儀測定各個孔在570 nm波長的吸光度(A)值，得到成骨細(xì)胞的增殖情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行t檢驗，檢驗水準(zhǔn)為α＝0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗壓強度

摻鍶聚磷酸鈣多孔支架的抗壓強度明顯大于聚磷酸鈣多孔支架（P＜0.05）；摻鍶聚磷酸鈣多孔支架降解0，7，14，21 d時的抗壓強度均大于聚磷酸鈣多孔支架，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝8.907，8.222，8.302，7.445，P＜0.05）。詳見表1。

2.2 成骨細(xì)胞增殖情況

MTT比色法結(jié)果顯示，培養(yǎng)3，4，5 d后，摻鍶聚磷酸鈣、聚磷酸鈣浸提液作用的成骨細(xì)胞的A值高于陰性對照，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝2.559，6.000，4.533，2.546，3.574，2.932，P＜0.05）；培養(yǎng)4，5 d后，摻鍶聚磷酸鈣浸提液作用的成骨細(xì)胞的A值高于聚磷酸鈣，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝2.733，2.038，P＜0.05）。詳見表2。

表1 降解過程中不同骨修復(fù)材料的抗壓強度（±s，MPa，n＝5）

表1 降解過程中不同骨修復(fù)材料的抗壓強度（±s，MPa，n＝5）

注：與聚磷酸鈣多孔支架比較，aP＜0.05。

骨修復(fù)材料摻鍶聚磷酸鈣多孔支架聚磷酸鈣多孔支架21 d 150.6±12.0a94.8±11.7 0 d 212.4±5.3a172.5±8.3 7 d 168.3±9.4a117.3±10.2 14 d 155.9±10.4a103.6±9.5

表2 不同材料對成骨細(xì)胞增殖的影響（±s）

表2 不同材料對成骨細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與陰性對照比較，aP＜0.05；與聚磷酸鈣比較，bP＜0.05。

材料A值摻鍶聚磷酸鈣聚磷酸鈣陰性對照1 d 0.21±0.10 0.24±0.10 0.22±0.08 2 d 0.30±0.11 0.32±0.12 0.25±0.07 3 d 0.49±0.17a0.41±0.06a0.32±0.08 4 d 0.65±0.10ab0.52±0.09a0.35±0.10 5 d 0.67±0.18ab0.51±0.13a0.34±0.10

3 討論

骨科手術(shù)需要植入生物材料與組織工程移植物，其中聚磷酸鈣是非常重要的組織工程材料，具有良好的生物相容性[5，8－9]。血管生成及再生在機體的生理中十分重要，在骨組織傷口的愈合過程中更是如此，這在一定程度上決定了患者的預(yù)后[10]。但植入組織工程材料后的局部血管形成過程十分緩慢，想達(dá)到大尺寸移植物及血管組織的有效血管化較困難。故眾多研究致力于改善植入后的血管生成，雖取得了較理想的效果，但仍需加入其他物質(zhì)對移植物進行物理性和化學(xué)性修飾，修飾方法較復(fù)雜，臨床應(yīng)用受限。

鍶是人體的必需營養(yǎng)元素，其質(zhì)量約占人體骨總質(zhì)量的萬分之一[11]，主要分布于骨骼和牙齒中，機體約99%的鍶存在于骨骼中。鍶在機體中可抑制破骨細(xì)胞的活性及增殖，從而抑制骨吸收；同時，鍶能加速成骨細(xì)胞的分化，并促進前成骨細(xì)胞的增殖，從而加速成骨過程。但應(yīng)注意，鍶在相應(yīng)局部必須達(dá)到一定的有效濃度才能發(fā)揮相應(yīng)的效果[12]。

當(dāng)組織工程移植物植入機體內(nèi)后，其力學(xué)強度會不同程度地受到人體的影響，其中，生物陶瓷類材料的力學(xué)強度受影響最大，其力學(xué)強度通常衰減明顯。因此，降低植入材料的力學(xué)強度衰減也成為組織材料的研究熱點。制備摻鍶聚磷酸鈣后，必須驗證其抗壓強度，否則無法成為適宜的骨修復(fù)材料。本研究結(jié)果表明，在聚磷酸鈣骨修復(fù)材料中摻入一定量的鍶，可明顯提高聚磷酸鈣材料的抗壓強度，且在降解過程中抗壓強度仍高于普通聚磷酸鈣材料，表明加入鍶元素后可有效減緩聚磷酸鈣的力學(xué)強度衰減量。

成骨細(xì)胞是促進骨形成的重要功能性細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌與礦化過程。機體中的骨組織不停地進行重建，主要包括：破骨細(xì)胞黏附于舊骨組織區(qū)域，分泌出可溶解骨組織中礦物質(zhì)的酸性物質(zhì)，并可分泌蛋白酶消解骨基質(zhì)中的蛋白質(zhì)成分，從而形成骨吸收的典型陷窩結(jié)構(gòu)；此外，成骨細(xì)胞黏附于被吸收的骨組織部位，分泌出骨基質(zhì)，并進一步礦化成為新的骨組織。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間的作用平衡是維持人體正常骨總量的關(guān)鍵因素，而在骨科手術(shù)后的骨修復(fù)階段中成骨作用應(yīng)占優(yōu)勢。因此，優(yōu)良的骨修復(fù)材料也應(yīng)有利于成骨作用。MTT比色法結(jié)果顯示，摻鍶聚磷酸鈣材料對成骨細(xì)胞的增殖具有更強的促進作用。這是由于摻鍶聚磷酸骨修復(fù)材料浸提后，加上材料本身降解可釋放出一定濃度的鍶離子，作用于成骨細(xì)胞后，可激活成骨細(xì)胞中表達(dá)鈣敏感受體，從而激活三磷酸肌醇促有絲分裂蛋白激酶信號傳導(dǎo)通道，使成骨細(xì)胞更好地生長和增殖[13]。

綜上所述，新型骨修復(fù)材料摻鍶聚磷酸鈣具有良好的抗壓特性，并能促進成骨細(xì)胞的增殖，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

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Preparation of Strontium Calcium Phosphate Bone RepairM aterial and Its Effect on the Proliferation of Osteoblasts

Yu Leijun

（Department of Orthopaedics and Traumatology，Tongde Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou，Zhejiang，China310012）

ObjectiveTo improve the mechanical properties and biological activity of calcium phosphate，and to provide a new bone repair material for orthopedics clinic.M ethodsStrontium doped calcium phosphate bone repair material was prepared，compressive strength wastestedbyuniversalmaterialtestingmachine，andMTTmethodwasusedtoinvestigateitseffect ontheproliferationof osteoblasts.ResultsThe compressive strength of strontium doped calcium phosphate porous scaffold was（212.4±5.3）MPa.After degradation for 0 d，7 d，14 d and 21 d，the compressive strength of strontium doped calcium phosphate were greater than that of calcium phosphate porous scaffold，and the differences were statistically significant（t＝8.907，8.222，8.302，7.445，P＜0.05）.The MTT results indicated that 3d，4 d，5d after culture，A values of extracts osteoblast of strontium doped calcium polyphosphate and calcium polyphosphate were higher than negative control，the differences were statistically significant（t＝2.559，6.000，4.533，2.546，3.574，2.932，P＜0.05）；After culture for 4 d and 5 d，the A value of the osteoblast in extraction solution of calcium doped calcium phosphate were higher than those of calcium phosphate，and the differences were statistically significant（t＝2.733，2.038，P＜0.05）.ConclusionAs a new bone repair material，strontium doped calcium phosphate has good compressive properties，and can promote the proliferation of osteoblasts，has a good clinical application prospects.

strontium doped calcium phosphate；bone repair materials；compressive strength；osteoblast proliferation

R608；R965

A

1006－4931(2017)02－0013－03

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.02.004

2016－10－07；

2016－11－14)

浙江省科學(xué)技術(shù)廳2014年合作研發(fā)和成果轉(zhuǎn)化項目[2014F50005]。

俞雷鈞，男，大學(xué)本科，主任中醫(yī)師，研究方向為脊柱退行性疾病的診治，(電話)0571－89972351。