高寒草地優(yōu)勢植物根際細(xì)菌促生特性及初步鑒定

雷 楊，白 潔，李智燕，姚 拓

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 / 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省草原技術(shù)推廣總站, 甘肅 蘭州 730070）

作為全球主要的陸地生態(tài)系統(tǒng)之一的高寒草地生態(tài)系統(tǒng)，在水土保持、涵養(yǎng)水源、生態(tài)平衡等方面發(fā)揮著重要的作用[1]。近年來，由于高寒草地獨(dú)特的生境與人類活動，破壞了高寒草地生態(tài)平衡，使植被群落結(jié)構(gòu)和土壤的穩(wěn)定性降低，高寒草地面臨著嚴(yán)重退化的威脅。隨著高寒草地的退化，生長于高寒草地的優(yōu)勢植株從多年生禾本科逐步向一年生草本植物發(fā)生逆向演替，這為其他雜類草提供了更多的生長機(jī)會與空間[2-3]，不僅會影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變[4]，還可能引起病原微生物的增加從而導(dǎo)致植物土傳病害的發(fā)生[5]，加劇高寒草地的退化。根據(jù)仁青吉等[6]研究報(bào)道，短期內(nèi)在甘南高寒退化草地施用化肥，草地修復(fù)效果明顯提高。但化肥施用在調(diào)控修復(fù)退化高寒草地的生物多樣性上并不具有可持續(xù)性效果[7]，而林麗等[8]、任卓然等[9]和Zhao 等[10]研究發(fā)現(xiàn)在退化高寒草地施用微生物肥料能夠促進(jìn)植被生長，土壤養(yǎng)分和植物根際微生物群落也相應(yīng)得到了改善，并且研究表明微生物肥料作為傳統(tǒng)肥料的替代品能夠?qū)崿F(xiàn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)[11]，表明修復(fù)退化高寒草地來維持生態(tài)平衡還需要著眼于微生物的調(diào)控[12]。

植物根際促生菌 (plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)是一類通過固氮、溶磷、分泌植物生長激素特性和拮抗病原微生物以促進(jìn)植物生長的有益根際細(xì)菌[13-14]。研究表明PGPR 作為生物肥料在植被修復(fù)方面可促進(jìn)植物生長，并增強(qiáng)植物抗逆性[15]。鐘松等[16]在黃河源區(qū)高寒草地施用不同PGPR 菌肥，發(fā)現(xiàn)其均能提高土壤速效養(yǎng)分，意味著PGPR 可在探索退化高寒草地的修復(fù)技術(shù)和可持續(xù)生態(tài)修復(fù)措施中發(fā)揮出至關(guān)重要的作用。市面上普通的PGPR 菌劑在修復(fù)高寒退化草地上面臨很大挑戰(zhàn)。研究表明在高寒地區(qū)低溫等惡劣的生存環(huán)境，來自高寒地區(qū)生長植物根際分離的PGPR 會發(fā)揮更好的作用[17]。因此，篩選出兼具多種優(yōu)良特性的耐低溫PGPR 對高寒退化草地生態(tài)恢復(fù)具有很好的應(yīng)用前景。因而，眾多研究學(xué)者對高寒草地PGPR 的研究關(guān)注越來越多，且有研究發(fā)現(xiàn)具有耐低溫特性的PGPR 在高寒退化草地中具有發(fā)揮修復(fù)功能的潛力[18-19]。目前，在我國適用于修復(fù)退化高寒草地微生物肥料的研發(fā)以及優(yōu)良耐低溫PGPR 菌株資源的篩選少見報(bào)道，鑒于高寒草地的獨(dú)特生境，篩選來自于該獨(dú)特生境的植物根際有益細(xì)菌，通過評價(jià)其促生特性，進(jìn)而篩選獲得耐低溫且具有優(yōu)良特性的菌株，后期可用于增強(qiáng)土壤與植物的有益互作，有利于推動與維持高寒草地生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和良性循環(huán)。

本研究從前期研究獲得的高寒草地功能微生物資源庫中，選取18 株菌株，在低溫條件下，測定其固氮、溶磷、分泌植物生長激素(indole acetic acid,IAA)和生防能力，從中篩選出綜合特性較優(yōu)的PGPR 菌株，并結(jié)合分子生物學(xué)方法將目的菌株進(jìn)行鑒定，為后期開發(fā)可應(yīng)用于高寒退化植被修復(fù)的微生物菌劑提供優(yōu)良耐低溫菌株資源，為高寒草地生態(tài)恢復(fù)提供科學(xué)支撐和理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

1)供試培養(yǎng)基： LB (luria bertani, LB) 固體培養(yǎng)基[20]用于菌種的保藏與培養(yǎng)； NFM (nitrogen free medium)培養(yǎng)基用于固氮酶活性的測定[13]；NBRIP(national botanical research institute’s phosphate，NBRIP)培養(yǎng)基[20]用于溶無機(jī)磷特性測定，NBRIP 培養(yǎng)基中的相同質(zhì)量的植酸鈣來代替磷酸鈣用于溶有機(jī)磷特性測定[18]；King 氏液體培養(yǎng)基用于IAA 的測定[20]；PDA 培養(yǎng)基用于真菌培養(yǎng)[21]。

2)供試菌株和病原菌：前期在15 ℃條件下分離獲得的18 株候選菌株(表1)。

表1 供試菌株Table 1 Strains tested

病原菌為前期分離所得病原菌：茄病鐮刀菌(Fusarium solani)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、串珠鐮刀菌(Fusarium moniliformi)、銳頂鐮孢菌(Gibberella acuminata)[22]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 固氮酶活性測定

用接種環(huán)將菌株挑取一環(huán)接種于盛有10 mL 半固體NFM 培養(yǎng)基中(血清瓶，規(guī)格30 mL)，每株菌3 次重復(fù)，對照為不接菌處理，用棉花塞封口后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h (15 ℃)后采用乙炔還原法[23]測定菌株固氮酶活性。

1.2.2 溶磷特性及pH 測定

將供試菌株接種至盛有已滅菌的50 mL NBRIP(有機(jī)磷培養(yǎng)基用相同質(zhì)量植酸鈣代替NBRIP 培養(yǎng)基中的磷酸鈣)液體培養(yǎng)基[24]的150 mL 三角瓶中，菌株接種好以后培養(yǎng)12 d (15 ℃、180 r·min-1)，鉬藍(lán)比色法[24](molybdenum blues colorimetry, MBC)測定菌株溶磷量，用酸度計(jì)測定每株菌培養(yǎng)液的pH。

1.2.3 菌株分泌IAA 特性的測定

分別接種500 μL 菌懸液(108cfu·mL-1)于已滅菌裝有50 mL 液體king 培養(yǎng)基的150 mL 三角瓶中。置于15 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)12 d，后吸取以上各菌株培養(yǎng)液 10 mL 離心10 min (10 000 r·min-1、4 ℃)，吸取上清液5 mL，并加等體積的Salkowski 比色液[25]，測定培養(yǎng)液在波長530 nm 的吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所測IAA 濃度(μg·mL-1)[24]。

1.2.4 菌株生防能力的測定

利用平板對峙法[13]初步測試所有菌株對上述4 種病原菌的拮抗作用。使用直徑為90 mm 的培養(yǎng)皿。采用“十”字交叉法分別在中心處點(diǎn)接病原菌菌絲，在“十”字兩端距中心23 mm 處點(diǎn)接供試菌株，重復(fù)3 次，對照平板為單接病原菌絲。25 ℃培養(yǎng)5～7 d，待整個平板被對照鋪滿時，計(jì)算拮抗菌株抑制率，按照以下公式計(jì)算：

通過初篩發(fā)現(xiàn)接有供試菌株的PDA 平板有抑菌帶之后，按照上述方法復(fù)篩，3 次重復(fù)，觀察測定拮抗菌株抑菌帶寬度。

1.2.5 優(yōu)良耐低溫PGPR 菌株鑒定

將上述篩選的溶磷菌株LPA7、LNA2，固氮菌株CND1，分泌IAA 菌株LMJ2，生防菌株LMG2、LMY8，平板劃線接種于LB 固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h(15 ℃)。按照試劑盒說明書提取細(xì)菌總DNA 并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，后用1%凝膠瓊脂糖電泳進(jìn)行PCR 產(chǎn)物檢測。利用正向引物27F (5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′)和反向引物1 492R (5′-GGTT ACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增菌株的16S rRNA基因序列。25 μL 反應(yīng)體系：2 × Taq PCR Master-Mix 12.5 μL、DNA 模 板 3 μL、正 反 向 引 物 各1.5 μL、ddH2O 6.5 μL。PCR 擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)循環(huán)30 次；72 ℃總延伸10 min；將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%凝膠瓊脂糖電泳檢測后由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。測序結(jié)果在 EZBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)中進(jìn)行序列比對分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2016 和SPSS 24.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、One-Way ANOVA 統(tǒng)計(jì)分析和Duncan 極差法進(jìn)行差異顯著性比較，圖表數(shù)據(jù)為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差；采用Origin 2021 軟件繪圖。通過MEGA7.0 軟件以鄰接法構(gòu)建所測菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap 為1 000 次。

2 結(jié)果分析

2.1 18 株菌株促生特性

供試18 株菌株中除菌株CPB3、CPJ2、ZWA1、LMJ2未檢測出固氮酶活性外，其余14 株菌在15 ℃培養(yǎng)下 的 固 氮 酶 活 性 介 于25.43～230.52 nmol·(h·mL)-1(圖1)，其中，菌株ZWC1 的固氮酶活性最高，達(dá)230.52 nmol·(h·mL)-1，其次是菌株LMB5，為 216.49 nmol·(h·mL)-1，菌 株LTZ1 和CND1、ZWE1 的 固 氮酶活性分別為181.72、144.67、138.95 nmol·(h·mL)-1，菌株ZWF1 和LPA7 的固氮酶活性分別為95.46 和93.84 nmol·(h·mL)-1，其 余 菌 株 固 氮 酶 活 性 均 低 于69.46 nmol·(h·mL)-1。

圖1 菌株的固氮能力Figure 1 Nitrogen-fixing capacity of strains

供試18 株菌株均能分泌生長激素IAA，分泌量介于12.45～71.71 μg·mL-1(圖2)，其中以菌株LTZ1分 泌IAA 量 最 大，為71.71 μg·mL-1，其 次 是 菌 株LMJ2，分泌IAA 量為69.13 μg·mL-1。菌株LNA2 分泌IAA 量最小，為12.45 μg·mL-1。

圖2 菌株分泌植物生長激素(IAA)的能力Figure 2 Indole acetic acid (IAA) secreted by strains

供試18 株菌株有機(jī)磷溶磷量介于51.76～115.06 μg·mL-1(圖3)，18 株 菌 株 溶 有 機(jī) 磷 的pH 介于2.20～4.37，其中， 菌株ZWF1 的溶有機(jī)磷含量最高為115.06 μg·mL-1，pH 2.20。供試18 株菌株無機(jī)磷 的 溶 磷 量 介 于9.22～380.28 μg·mL-1(圖4)，pH 4.07～6.64。其中菌株LNA2 溶無機(jī)磷量最高，達(dá)380.28 μg·mL-1，pH 4.29。其次菌株LPA7 溶無機(jī)磷量為321.57 μg·mL-1，pH 4.07。綜上，供試18 株菌株均能溶無機(jī)磷和有機(jī)磷。

圖3 菌株的溶有機(jī)磷能力Figure 3 Organic phosphate solubility of strains

圖4 菌株的溶無機(jī)磷能力Figure 4 Inorganic phosphate solubility of strains

2.2 抑制植物病原真菌能力

通過測定18 株菌株對病原真菌茄病鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、串珠鐮刀菌、銳頂鐮孢菌的抑菌能力(表2)，初篩發(fā)現(xiàn)菌株LNA2、LMY8、ZWA1、LMJ2、LMG2 對病原真菌銳頂鐮孢菌有抑制能力，而對其他病原真菌并無抑制能力。復(fù)篩發(fā)現(xiàn)菌株LMG2、LMJ2 對病原真菌銳頂鐮孢菌的抑菌能力顯著(P＜0.05)，抑菌率分別為31.00%和30.75%。

表2 植物根際促生菌(PGPR)對病原真菌的拮抗效果Table 2 Antagonistic effect of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) on pathogenic bacteria

2.3 優(yōu)良耐低溫PGPR 菌株鑒定

綜合評價(jià)各菌株促生特性和抑菌效果，篩選出6 株優(yōu)良PGPR 菌株，對其進(jìn)行基于16S rRNA 基因序列的鑒定，通過同源序列比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。其中，篩選得到的編號LMG2 菌株和LMJ2 菌株的16S rRNA 基因序列與Pseudomonas pisciumP50T的相似度分別為99.27%和99.51%； 另外兩株編號為LNA2 和LPA7 的菌株與Pseudomonas neuropathica的親緣關(guān)系最近，它們的16S rRNA 基因序列與P.neuropathicaP155T的相似度為99.11%。編號CND1的16S rRNA 基因序列與猴假單胞菌Pseudomonas simiaeOliT的相似度為99.78%，編號LMY8 的16S rRNA 基因序列與Pseudomonas kairouanensisKC12T的相似度為99.57% (圖5)。

圖5 基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA showing the phylogenetic relationships among isolated strains

3 討論

高寒草地的退化使得優(yōu)勢植被發(fā)生逆向演替，限制了植被根際的有益微生物發(fā)揮作用[26]。微生物肥料的出現(xiàn)，成為調(diào)控退化高寒地區(qū)植物、土壤及微生物三者的橋梁，使綠色高效的生態(tài)恢復(fù)方式成為了可能。因此，挖掘生存于高寒地區(qū)的多功能PGPR 菌株并研發(fā)微生物肥料，有望解決高寒退化草地修復(fù)的問題[27]。

氮和磷在植物生產(chǎn)、光合作用和大分子生物合成等過程中起著至關(guān)重要的作用。同時，在高寒生態(tài)系統(tǒng)中氮素和磷素是有機(jī)體必需的兩種限制性營養(yǎng)元素；在生物固氮過程中，土壤微生物扮演著不可替代的角色[28]，合理發(fā)揮固氮菌的生物固氮作用，對于修復(fù)和維穩(wěn)退化高寒草地生態(tài)有著重要意義。低溫是高寒地區(qū)影響植物正常生長的因素之一，低溫會導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，從而降低抗氧化酶活性，最終導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡，耐低溫PGPR 的接種可以增強(qiáng)植物耐低溫脅迫[17]。本研究測定的18 株耐低溫菌株中除4 株菌低溫下未表現(xiàn)出固氮酶活性外，除個別固氮能力較弱，剩余菌 株固氮酶活性介于25.43～230.52 nmol·(h·mL)-1。李明源等[19]在祁連山高寒草地分離的固氮菌株固氮能力與本研究相比較弱，但對垂穗披堿草(Elymus nutans)的生長有明顯促進(jìn)作用，也可推測本研究分離的固氮菌也具有促進(jìn)植物生長的潛力。本研究所篩選得到的P.simiae菌株促生特性與白潔等[20]的研究結(jié)果相比，本研究在低溫條件下測定的P.simiae固氮能力高于常溫下測定的P.simiae固氮能力，可見即使菌株同源，但在不同溫度的作用下固氮酶活性的大小仍有所不同，這與所分離PGPR 的植物、土壤、生境和地域等有關(guān)[13,23]。也可推測本研究篩選的固氮菌有望在實(shí)際使用中更適應(yīng)低溫的高寒草地，并發(fā)揮更好的固氮作用。溶磷菌能夠通過分泌有機(jī)酸等物質(zhì)來分解土壤中的難溶性磷酸鹽，改善土壤結(jié)構(gòu)與提高土壤養(yǎng)分促進(jìn)植物吸收磷素，加速植物生長[28]。通過溶磷能力的測定，本研究中18 株菌株的溶有機(jī)磷量高于劉曉婷和姚拓[18]在紅原高寒草甸植株根際篩選的溶磷菌溶有機(jī)磷量，溶無機(jī)磷量則反之，這也許與配制溶磷培養(yǎng)基時所選擇的磷源、菌株自身特性有關(guān)[18]。本研究中菌株溶有機(jī)磷菌株的發(fā)酵液pH 整體偏低并與溶有機(jī)磷量沒有關(guān)聯(lián)，但溶無機(jī)磷量隨發(fā)酵液pH 的降低而增大。楊美英等[29]研究發(fā)現(xiàn)，溶磷培養(yǎng)基中pH 越低，表示菌株在溶磷過程中分泌的有機(jī)酸含量越高，種類越多。后續(xù)可以針對本研究篩選的溶磷菌株進(jìn)行有機(jī)酸種類的研究和分析，深入探究溶磷的機(jī)制和機(jī)理。

IAA 在植物的生長發(fā)育中必不可少。由根際微生物分泌的IAA 可促進(jìn)植物地上部分的生長以及根系伸長，增加了參與養(yǎng)分吸收的根毛和側(cè)根的數(shù)量[30]。Noori 和Saud[31]分離的20 株P(guān)GPR 中，有75%的菌株可分泌IAA，可分泌IAA 的PGPR 能夠促進(jìn)植物根系生長。本研究綜合篩選獲得的6 株假單胞菌株均能分泌IAA，表明6 株菌對高寒草地優(yōu)勢植株生長發(fā)育具有促生潛力。高寒草地的退化引起根際病原微生物泛濫易使植物病害發(fā)生，影響植物生長[5,32]。為此，在篩選優(yōu)良PGPR 時，除了關(guān)注其固氮、溶磷和分泌IAA 能力，還需聚焦菌株在極端生境中是否具有抑制病原菌的能力。蘭曉君[33]從天祝草原草(Koeleria macrantha)根際分離的生防芽孢桿菌TZF1 均對小麥長蠕孢(Helmintho sporium tritici-vulgaris)、茄鏈格孢(Alternaria solani)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)等6 株病原真菌的抑菌率均在64%以上。楊成德等[34]從東祁連山高寒草地上珠芽蓼(Bistorta vivipara)分離的Z19 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)對核盤菌屬、絲核菌屬等的植物病原真菌具有抗性，且可能具有應(yīng)用在高寒草地的潛能。目前，芽孢桿菌屬有關(guān)抑制病原菌的研究已非常成熟。而假單胞菌屬菌株在植物病害的防治中也發(fā)揮著作用，前人研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬菌株一般可通過產(chǎn)生如抗生素、植物激素、揮發(fā)性化合物氰化氫和鐵載體等次級代謝物來有效控制植物病蟲害的發(fā)生，有利植物的生長發(fā)育[35-36]，除上述假單胞菌屬菌株通過產(chǎn)生次級代謝物來控制病害的途徑，Chen 等[37]研究發(fā)現(xiàn)P.pisciumZJU60 可以通過調(diào)控真菌組蛋白修飾來抑制禾谷鐮刀菌(F.graminearum)。有研究[22]報(bào)道，銳頂鐮孢菌(G.acuminata)是引起植物土傳病害的病原真菌之一，對植物的致病力僅次于禾谷鐮刀菌，當(dāng)前對該病原真菌的拮抗研究缺乏報(bào)道。在本研究中，通過平板對峙法研究得出有5 株菌株均對病原真菌G.acuminata表現(xiàn)出拮抗作用。其中拮抗作用最強(qiáng)的菌株LMG2 經(jīng)鑒定為P.piscium，此菌株拮抗病原真菌的機(jī)制是否與上述蛋白調(diào)控有關(guān)還尚未可知，后續(xù)還需對該菌株拮抗病原真菌G.acuminata的機(jī)理進(jìn)行深入研究。

本研究對候選菌株進(jìn)行16S rRNA 基因序列比對后，分析結(jié)果顯示均屬于假單胞菌屬，這可能與假單胞菌能在4～37 ℃條件下生長[38]，且具有分布廣、耐受能力強(qiáng)的特性以及研究地區(qū)宿主植物所處生態(tài)環(huán)境的特殊性有關(guān)。并且從鑒定結(jié)果可知，存在兩個菌株為同一個屬同一個種且與模式菌株相似度相近，但由于菌株遺傳特性不同，所表現(xiàn)的促生特性各有差異，因此篩選菌株也應(yīng)從多方面綜合考慮[20,39]?？紤]到自然條件的不可控性，篩選獲得的6 株耐低溫多功能植物根際促生菌對于生長在高寒草地植物的實(shí)際促生效果還需進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證。

4 結(jié)論

選取的18 株菌有14 株菌在低溫條件下均具有固氮、溶磷和分泌植物生長激素IAA 的能力。經(jīng)過特性測定，綜合比較獲得6 株優(yōu)良PGPR，其中菌株LPA7、菌株LNA2 溶有機(jī)磷和溶無機(jī)磷能力最強(qiáng)，菌株CND1 固氮能力最好，菌株LMJ2 分泌IAA 能力最強(qiáng)，菌株LMG2 拮抗病原真菌G.acuminata效果最好。 6 株優(yōu)良耐低溫菌株被鑒定為：菌株LMG2和LMJ2 為P.piscium，菌株LMY8 為P.kairouanensis，菌株CND1 為猴假單胞菌(P.simiae)，菌株LNA2、LPA7 為P.neuropathica。6 株優(yōu)良耐低溫菌株可為后續(xù)制作適用高寒草地的微生物菌劑提供優(yōu)質(zhì)菌株資源。