百里香酚-殼聚糖復(fù)合膜及其在豬肉保鮮中的應(yīng)用

王 娣WANG Di 張仁鳳 - 張 彬 程 柏 許 暉 柯春林 - 任茂生 -

(蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

百里香酚(Thymol)又稱麝香草酚[1]，是百里香屬植物中重要成分，主要存在于百里香精油和百里香活性提取物中。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)百里香酚對(duì)常見(jiàn)食品污染菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等均有一定抑制作用[1-4]，對(duì)鮮切蔬菜、水果等保鮮也有影響，保鮮效果較好[5-7]，但未發(fā)現(xiàn)用于肉類的保鮮中。單核增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)是常見(jiàn)的肉類食品污染菌，致病性很強(qiáng)，可導(dǎo)致人死亡。調(diào)查發(fā)現(xiàn)中國(guó)多個(gè)省份都有關(guān)于人和動(dòng)物感染單核增生李斯特氏菌的案例報(bào)道[8]，尤其豬肉、牛肉等生鮮食品容易感染李斯特氏菌[9-11]，目前尚未見(jiàn)到有關(guān)百里香酚對(duì)食品污染菌單核增生李斯特氏菌的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)采用管碟法研究百里香酚對(duì)單核增生李斯特氏菌的最小抑制濃度，并研究不同濃度的百里香酚對(duì)單核增生李斯特氏菌生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞滲透性的影響；制作百里香酚-殼聚糖復(fù)合膜(CH/TO)，并把復(fù)合膜應(yīng)用于豬肉的保鮮中，研究復(fù)合膜對(duì)豬肉保藏中菌數(shù)的影響，為百里香酚作為一種新型肉類保鮮劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料、菌種與試劑

豬后腿瘦肉：購(gòu)自蚌埠家樂(lè)福超市；

單核增生李斯特氏菌(Listeriamomocytogenes)：CGMCC1.9144，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；

胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基(TSA-YE)：上海博微生物科技有限公司；

胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯培養(yǎng)基(TSB-YE)：上海博微生物科技有限公司；

吐溫-80、冰醋酸、丙三醇、葡萄糖：分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；

DPPH：分析純,東京化成工業(yè)株式會(huì)社；

百里香酚：AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

殼聚糖：脫乙酰度95%，BR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器

恒溫培養(yǎng)箱：PWT-P42B型，華德利科學(xué)器材有限公司；

恒溫振蕩箱：HZQ-X500型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

牛津杯：10 mm×7.8 mm×6 mm，中國(guó)科歡有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：KDC-160HR型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；

微生物比濁儀：WBS-100型，北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

電導(dǎo)率儀：DDBJ-350型，齊威儀器有限公司；

質(zhì)構(gòu)儀：TA.XT Plus型，英國(guó)Stable Micro Systems公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 百里香酚抑菌活性研究

(1) 不同濃度百里香酚溶液的配置：取1.00 g百里香酚，加入0.5%吐溫-80，用無(wú)菌水溶解，配置成濃度為1.00 mg/mL 的原液密封冷藏，備用。

(2) 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定：采用管碟法檢測(cè)百里香酚對(duì)單核增生李斯特氏菌的最小抑菌濃度(MIC)[12][13]24,53。制作含單核增生李斯特氏菌的TSA-YE平板，將無(wú)菌牛津杯置于平皿內(nèi)，注入不同濃度(100.00，50.00，25.00，12.50，6.25 μg/mL)的百里香酚溶液100 μL，做空白對(duì)照。

(3) 百里香酚對(duì)單核增生李斯特氏菌生長(zhǎng)曲線的影響：研究1/2 MIC、1 MIC百里香酚不同濃度對(duì)李斯特氏菌生長(zhǎng)曲線的影響[14]。在比色管中加入TSB-YE培養(yǎng)基10 mL，使比色管里的菌體濃度在1×106CFU/mL，百里香酚終濃度為1/2 MIC、1 MIC，做空白對(duì)照；生長(zhǎng)曲線檢測(cè)采用微生物比濁儀，每隔1 h測(cè)吸光度值A(chǔ)600 nm。

(4) 細(xì)胞膜滲透性及細(xì)胞中核酸、蛋白質(zhì)泄露的檢測(cè)：利用電導(dǎo)率法研究百里香酚對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的影響[13]52。電導(dǎo)率是衡量溶液離子強(qiáng)度高低的參數(shù)，抑菌劑會(huì)破壞微生物細(xì)胞膜，使細(xì)胞滲透性增強(qiáng)，電解質(zhì)外泄，電導(dǎo)率上升[14]。在260，280 nm處測(cè)吸光度值分析細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)的泄露[15]。參照并改進(jìn)Kong等[16]的方法，將單核增生李斯特氏菌懸液用5%葡萄糖溶液清洗獲得等滲細(xì)胞；移取106CFU/mL 菌懸液至無(wú)菌比色管中，加入百里香酚使其終濃度為0，1，2 MIC，每隔0.5 h測(cè)1次電導(dǎo)率；測(cè)細(xì)菌核酸(A260)和蛋白質(zhì)(A280)的泄露量。

1.2.2 百里香酚-殼聚糖復(fù)合膜(CH/TO)的制作及其性能檢測(cè)

(1) CH/TO復(fù)合膜的制作：殼聚糖是天然多糖中唯一的陽(yáng)離子聚合多糖，具有一定抗氧化和抑菌活性[17-18]。將百里香酚和殼聚糖混合制備復(fù)合膜，使其在百里香酚膜中含量為0.00%，0.25%，0.50%，1.00%。具體方法：取2.0 g殼聚糖，加入不同量百里香酚(0.25，0.50，1.00 g)，再加入1.0 mL 冰醋酸、1.0 mL丙三醇和200 μL吐溫-80，去離子水定容至100 mL，攪拌混勻后超聲脫氣，40 ℃ 烘干成膜，4 ℃ 冷藏，備用。

(2) CH/TO復(fù)合膜的硬度與強(qiáng)度檢測(cè)：采用質(zhì)構(gòu)儀檢測(cè)百里香酚-殼聚糖復(fù)合膜(CH/TO)硬度和穿刺強(qiáng)度。比較不同濃度(0.25%，0.50%，1.00%)百里香酚-殼聚糖復(fù)合膜的硬度；選擇直徑2 mm的探針，比較不同濃度百里香酚-殼聚糖復(fù)合膜的穿刺力，做空白對(duì)照。

(3) CH/TO復(fù)合膜對(duì)DPPH自由基清除活性：抗氧化試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[19]，比較在15，25 ℃時(shí) CH/TO的抗氧化能力。將CH/TO樣品(3 cm×3 cm)置于50%的乙醇溶液中，每隔1 h取1 mL與4 mL DPPH溶液混勻，避光靜止30 min，于517 nm處測(cè)吸光度。DPPH自由基清除能力按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

P——DPPH自由基清除率，%；

A0——空白的吸光度值；

Ai——樣品的吸光度值。

1.2.3 CH/TO復(fù)合膜對(duì)豬肉的保鮮作用

(1) 豬肉保藏中菌落總數(shù)的測(cè)定：將豬后腿瘦肉無(wú)菌分割成5.0 g肉塊，用殼聚糖膜和百里香酚濃度為1%的CH/TO復(fù)合膜包裹，4 ℃冷藏，每隔2 d測(cè)定菌落總數(shù)[20]。

(2) 豬肉感官評(píng)定：感官評(píng)定小組由6人組成，每隔2 d對(duì)豬肉的顏色、氣味、百里香味進(jìn)行綜合評(píng)定[21]。按表1采用5點(diǎn)評(píng)分法對(duì)豬肉進(jìn)行評(píng)分。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌作用研究

表2百里香酚對(duì)單核增生李斯特氏菌抑菌圈大小?

Table 2 Inhibitory effect of thymol on the size of inhibitory zone ofListeriamonocytogenes

? “--”表示沒(méi)有抑菌圈；不同小寫(xiě)字母表示同一列數(shù)據(jù)之間有顯著性差異(P<0.05)。

2.1.1 最小抑菌濃度(MIC) 由表2和圖1可知，隨著百里香酚濃度的增加，對(duì)單核增生李斯特氏菌的抑菌圈直徑不斷增加，當(dāng)百里香酚濃度為6.25 μg/mL時(shí)，無(wú)抑菌圈且牛津杯內(nèi)有少許菌生長(zhǎng)。因此確定最小抑菌濃度(MIC)為12.5 μg/mL。

2.1.2 對(duì)單核增生李斯特氏菌生長(zhǎng)曲線的抑制作用 由圖2 可知，空白對(duì)照組中單核增生李斯特氏菌生長(zhǎng)正常；而百里香酚濃度為1 MIC時(shí)，細(xì)菌幾乎不生長(zhǎng)；在1/2 MIC濃度下，細(xì)菌遲滯期比較長(zhǎng)，且菌體生長(zhǎng)緩慢，菌數(shù)遠(yuǎn)低于空白對(duì)照組。

2.1.3 細(xì)胞膜滲透性 電導(dǎo)率的改變直接反映出細(xì)胞滲透性的變化。由圖3可知，空白對(duì)照組電導(dǎo)率變化幅度很小。隨著百里香酚濃度的增加(1 MIC和2 MIC)和時(shí)間的延長(zhǎng)，電導(dǎo)率值不斷增加，表明有離子釋放出來(lái)，可能是一定濃度的百里香酚破壞了單核增生李斯特氏菌的細(xì)胞膜滲透性，隨著細(xì)胞膜的破壞，細(xì)胞內(nèi)組分泄漏所致。

2.1.4 細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)泄露 百里香酚對(duì)單核增生李斯特氏菌作用后的菌懸液隨時(shí)間的變化情況(A260、A280)見(jiàn)圖4、5。試驗(yàn)結(jié)果表明，百里香酚能使單核增生李斯特氏菌細(xì)胞滲透性增加，使細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)核酸和蛋白質(zhì)泄漏出來(lái)。由圖4、5可知，0.0～0.5 h，吸光度值基本無(wú)變化，說(shuō)明百里香酚抑菌需要作用一段時(shí)間，隨著百里香酚濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度值開(kāi)始逐漸增加，并在1.5 h后達(dá)到平衡，表明百里香酚破壞了細(xì)菌的細(xì)胞膜，細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生泄露所致；空白對(duì)照組的吸光度則始終未發(fā)生變化，表明細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)的泄露與百里香酚的作用有關(guān)。

2.2 百里香酚-殼聚糖復(fù)合膜(CH/TO)的制作及其性能檢測(cè)

2.2.1 CH/TO復(fù)合膜的制作 由圖6可知，空白的殼聚糖膜顏色比較淡，隨著百里香酚濃度的增加，混合溶液呈現(xiàn)乳白色，可能是吐溫-80乳化作用所致，成膜后膜顏色隨百里香酚濃度的增加而加深，呈淡黃色，同時(shí)散發(fā)出百里香酚的獨(dú)特芳香氣味。

2.2.2 CH/TO的硬度與穿刺強(qiáng)度 由表3可知，隨著百里香酚濃度的增加，穿刺強(qiáng)度從106.35±2.35逐漸減小至70.6±2.3，硬度從236.7±11.1逐漸降至80.1±7.7，降幅明顯，可能是百里香酚屬疏水性物質(zhì)，會(huì)破壞膜的均一性和連續(xù)性，使膜的韌性下降。

? 不同小寫(xiě)字母表示同一列數(shù)據(jù)之間有顯著性差異(P<0.05)。

2.2.3 DPPH法測(cè)定百里香酚-殼聚糖復(fù)合膜抗氧化作用

由圖7、8可知，百里香酚能有效清除DPPH自由基，清除率隨百里香酚濃度的增加不斷增大并趨于平衡；溫度對(duì)DPPH自由基清除能力也有一定影響，15 ℃效果低于25 ℃，百里香酚濃度為1.00%的CH/TO， 25 ℃溫度下4 h時(shí)DPPH自由基清除率超過(guò)75%，而15 ℃溫度下DPPH自由基清除率不到60%。可能高溫更有利于DPPH自由基的清除。

2.3 百里香酚-殼聚糖復(fù)合膜對(duì)豬肉的抑菌保鮮作用

Figure 7 DPPH removal rate of different concentration thymol of compound membrane at 25 ℃

Figure 8 DPPH removal rate of different concentration thymol of compound membrane at 15 ℃

2.3.1 菌落總數(shù)檢測(cè) 在NY 5029—2008中規(guī)定，鮮豬肉的菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為≤1×106CFU/g。由圖9可知，在0～2 d 時(shí)，殼聚糖膜和CH/TO復(fù)合膜包裹的豬肉菌落總數(shù)基本相同，殼聚糖膜包裝的豬肉在第8天超過(guò)了NY 5029—2008標(biāo)準(zhǔn)限值，菌落總數(shù)增加了60%，而CH/TO包裝的豬肉，在12 d后菌落總數(shù)仍低于標(biāo)準(zhǔn)限值，只增長(zhǎng)了19%，表明百里香酚-殼聚糖復(fù)合膜可以有效抑制微生物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)豬肉的貯藏期。

2.3.2 感官評(píng)定 由表4和圖10可知，經(jīng)過(guò)10 d的冷藏，使用保鮮膜包裹的豬肉色澤由初始值1增加到最大值5，在第10天肉色失去光澤、發(fā)綠并伴有腐敗臭味。CH/TO復(fù)合膜處理后的豬肉，冷藏到10 d色度略增加，沒(méi)有出現(xiàn)臭味。

3 結(jié)論

? 不同小寫(xiě)字母表示同一列數(shù)據(jù)之間有顯著性差異(P<0.05)。

本試驗(yàn)對(duì)百里香酚的抑菌活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明其對(duì)食品污染菌單核增生李斯特氏菌具有一定抑菌作用，最小抑菌濃度為12.5 μg/mL；且百里香酚會(huì)破壞單核增生李斯特氏菌細(xì)胞膜，細(xì)胞內(nèi)含物滲出引起電導(dǎo)率變化，使核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生泄漏；百里香酚-殼聚糖復(fù)合膜性質(zhì)檢測(cè)試驗(yàn)表明膜的硬度和穿刺強(qiáng)度會(huì)隨著膜中百里香酚濃度的增加而逐漸降低，且復(fù)合膜具有一定抗氧化能力，對(duì)DPPH自由基清除率為75%(1.00%百里香酚，25 ℃)；為完善復(fù)合膜的性能，后續(xù)試驗(yàn)將添加不同濃度的乳化劑和塑化劑與百里香酚復(fù)合成膜，并用于豬肉油脂的抗氧化研究中；百里香酚-殼聚糖復(fù)合膜豬肉保鮮試驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)合膜能有效地抑制豬肉中微生物的生長(zhǎng)繁殖，降低菌落總數(shù)，延長(zhǎng)豬肉的冷藏期，后續(xù)試驗(yàn)將深入研究百里香酚對(duì)豬肉腐敗菌群的抑制作用，進(jìn)一步提高百里香酚的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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