HPLC-ICP-MS法測定水產動物及其制品中5種砷形態(tài)的含量

王林裴WANG Lin-pei 鄭亞哲 - 彭新然 -

(1. 漯河出入境檢驗檢疫局，河南 漯河 462000；2. 啟迪桑德環(huán)境資源股份有限公司，北京 101102)

砷在自然界中廣泛存在，在地殼所含元素的豐度中排第54位[1]。隨著工業(yè)的快速發(fā)展，包括礦業(yè)開采、化石燃料燃燒等人為活動，大量的砷進入到環(huán)境中，造成嚴重的砷污染問題[2]。砷主要以4種價態(tài)(-Ⅲ、0、Ⅲ、Ⅴ)存在，在生物地球化學循環(huán)過程以及在生物體內發(fā)生甲基化等過程，其化學形態(tài)發(fā)生了一系列變化[3]，主要以無機態(tài)的As(Ⅲ)和As(Ⅴ)，有機態(tài)的一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)、砷甜菜堿(AsB)和砷膽堿(AsC)形式存在[4]。

不同形態(tài)的砷其環(huán)境毒理學性質相差迥異，無機砷毒性高于有機砷，目前國內外僅對水產動物及其制品中無機砷限量作出規(guī)定，但有研究[5]表明，有些有機砷可能與癌細胞活性有關，也具有一定的毒性。砷總量的測定已經不能夠客觀地對砷化合物的安全性作出評價[6]。經過多年的發(fā)展研究，國內外主要采用聯(lián)用方法對砷形態(tài)進行檢測分析。用砷元素特征檢測器如AAS(原子吸收光譜儀)[7-8]、AFS(原子熒光光譜儀)[9-10]、ICP-AES(電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀)[11]、ICP-MS(電感耦合等離子體質譜儀)[12-14]等與色譜等分離手段聯(lián)用，從而將不同形態(tài)的砷檢測出來[15]。氣相色譜(GC)較適用于易揮發(fā)或中等揮發(fā)的有機金屬化合物的分離，而且分離之前的衍生化步驟不僅使分離、分析過程復雜化，而且增加了待測元素形態(tài)丟失或玷污的可能性、毛細管電泳(CE)[16]分離效率高，操作條件溫和，但在分離過程中，樣品在分析中的原始形態(tài)可能由于電解質或pH的調節(jié)而發(fā)生變化，樣品的組成也會對CE分離造成一定影響，且CE與ICP-MS的對接問題不如ICP-MS成熟。

液相色譜因其極佳的分離能力和ICP-MS的高靈敏度，可采用陰離子交換柱來分離不同形態(tài)的砷、用ICP-MS檢測[17]。由于水產動物及其制品中有機砷通常含量較高，尤其是砷甜菜堿，此種形態(tài)砷不易與三價砷完全分離。本試驗采用微波消解的方法對樣品進行前處理，并且對微波消解條件進行優(yōu)化,以選擇對各種砷形態(tài)進行充分提取的最佳溫度；采用Hanmilton PRX-X100陰離子色譜柱進行分離，并對色譜條件進行優(yōu)化，使有機砷與無機砷完全分離，以避免各種砷形態(tài)檢測的影響，從而建立一種新型的快速有效分離檢測砷形態(tài)的方法，為相關食品的監(jiān)管檢驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞砷酸鹽[As(Ⅲ)]標準品：GBW 08666，(75.7±1.2) μg/g，國家標準物質研究中心；

砷酸鹽[As(Ⅴ)]標準品：GBW 08667，(17.5±0.4) μg/g，國家標準物質研究中心；

一甲基砷(MMA)標準品：GBW 08668，(25.1±0.8) μg/g，國家標準物質研究中心；

二甲基砷(DMA)標準品：GBW 08669，(52.9±1.8) μg/g，國家標準物質研究中心；

砷甜菜堿(AsB)的標準品：GBW 08670，(38.8±1.1) μg/g，國家標準物質研究中心；

調諧溶液：500 ng/mL Li、 Co、Yi、Ce、Tl混合標準溶液，2% 硝酸介質，美國安捷倫科技有限公司；

乙醇：優(yōu)級純，天津科密歐化學試劑有限公司；

氨水、乙二胺四乙酸、磷酸二氫銨：分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；

硝酸：優(yōu)級純，北京化工廠；

試驗室用水：由Milli-Q Advantage A10系統(tǒng)制備的高純水，所用容器使用前均用25% HNO3溶液浸泡過夜。

1.2 儀器與設備

電感耦合等離子體質譜儀：Agilent 7700x型，美國安捷倫科技有限公司；

高效液相色譜儀：Agilent 1260系列，四元梯度泵，美國安捷倫科技有限公司；

超純水器：Mill-Q Advantage A10系統(tǒng)，美國Millipore科技有限公司；

超聲清洗器：KQ5200DE型，中國昆山儀器有限公司；

恒溫水浴振蕩器：SHZ-88型，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；

酸度計：PHS-3C型，上海雷磁儀電科學儀器股份有限公司；

分析天平：精度為0.001 g，XPE205型，瑞士梅特勒-托利多科技有限公司；

微波消解儀：CEM MARS 6 ONETOUCH型，美國CEM公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 硝酸溶液(0.15 mol/L) 量取10 mL硝酸，溶于水并稀釋至1 000 mL。

1.3.2 流動相 流動相A(25 mmol/L NH4H2PO4溶液)：稱取磷酸二氫銨2.876 g，用水溶解，并定容到1 000 mL容量瓶，用氨水調節(jié)pH到8.0，經0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣30 min；流動相B為乙醇。

1.3.3 亞砷酸鹽 [As(Ⅲ)]標準儲備液(10 μg/mL，以As計) 稱取0.132 g，用水稀釋定容至10 mL，避光保存在4 ℃冰箱中。

1.3.4 砷酸鹽 [As(Ⅴ)]標準儲備液(10 μg/mL，以As計)

稱取0.571 4 g，用水稀釋定容至10 mL，避光保存在4 ℃ 冰箱中。

1.3.5 一甲基砷(MMA)標準儲備液(10 μg/mL，以As計)

稱取0.398 g，用水稀釋定容至10 mL，避光保存在4 ℃冰箱中。

1.3.6 二甲基砷(DMA)標準儲備液(10 μg/mL，以As計)

稱取0.198 g，用水稀釋定容至10 mL，避光保存在4 ℃冰箱中。

1.3.7 砷甜菜堿(AsB)標準溶液儲備液(10 μg/mL，以As計) 稱取0.257 g，用水稀釋定容至10 mL，避光保存在4 ℃冰箱中。

1.3.8 混合標準使用液(1.0 μg/mL) 準確移取亞砷酸鹽 [As(Ⅲ)]、砷酸鹽 [As(Ⅴ)]、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)和砷甜菜堿(AsB)5種標準儲備液各0.1 mL，用水稀釋定容至10 mL。

1.3.9 混合標準工作液 分別移取混合標準使用液0.0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mL于一組10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，得到以上5種砷形態(tài)的濃度分別0，10，20，40，80，100 μg/L的混合標準工作液。

1.4 試驗方法

1.4.1 儀器條件

(1) ICP-MS工作條件：功率1 550 W，玻璃同心霧化器，石英霧化室，半導體控溫于(2±0.1) ℃，石英矩管，2.5 mm 中心通道，屏蔽矩，Pt采樣錐和截取錐，載氣流量：1.02 mL/min，補償氣0.15 mL/min，采樣深度：7.5 mm，采集質量數(shù)：砷75，氯35；分析時間10 min，峰面積定量載氣(氬氣)純度≥99.99%。

(2) 色譜條件：色譜柱為Hanmilton PRX-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)，流動相A(25 mmol/L NH4H2PO4溶液，pH 8.0)∶B(乙醇)=99∶1(體積比)，流速1.0 mL/min；進樣量50 μL，柱溫25 ℃。

1.4.2 樣品前處理 將樣品混勻打碎后稱取1.0 g(精確至0.001 g)左右，置于微波消解罐中，加入20 mL 0.15 mol/L的硝酸溶液，設置微波輔助條件，在80 ℃提取30 min。待處理完畢后，取出冷卻至室溫。經萃取后將所得溶液于8 000 r/min 離心15 min，取5 mL上清液至離心管中，加5 mL 正己烷，振搖1 min后，8 000 r/min離心15 min，棄去上層正己烷，此過程重復1次。吸取下層清液用0.45 μm 有機濾膜過濾及Bond Elut C18柱凈化后進樣，按相同方法作樣品空白。

1.5 砷形態(tài)含量的計算

試樣中的砷形態(tài)含量按式(1)計算：

(1)

式中：

X——試樣中不同砷形態(tài)的含量，mg/kg；

f——稀釋因子；

c——測定液中不同的砷形態(tài)的質量濃度，μg/L；

co——空白溶液中不同砷形態(tài)的濃度，μg/L；

V——加入提取劑的體積，mL；

1 000——換算系數(shù)；

m——稱樣量，g。

1.6 試驗條件的優(yōu)化

1.6.1 色譜條件的優(yōu)化 由于流動相對砷形態(tài)的分離效果影響程度較大，因此試驗通過控制變量法，研究流動相洗脫方式、流動相A(pH 8.0的25 mmol/L NH4H2PO4溶液)和B(乙醇)的比例、流動相的pH等因素對分離度的影響，進而優(yōu)化出分離效果較好的色譜條件。

(1) 洗脫方式的選擇：色譜柱為Hanmilton PRX-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)，選擇已優(yōu)化好的流動相A的pH(A與B體積比為99∶1)，流速1.0 mL/min；進樣量50 μL，柱溫25 ℃，ICP-MS工作條件如1.3.2，采用等度和梯度洗脫2種方式，梯度洗脫程序見表1。比較5種不同砷形態(tài)的分離效果。

(2) 流動相pH的選擇：色譜柱為Hanmilton PRX-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)，流速1.0 mL/min；進樣量50 μL，柱溫25 ℃，ICP-MS工作條件如1.3.2，配制不同pH的流動相A(A與B體積比為99∶1)，pH分別為6.57，8.00，8.57，進樣，觀察分離效果進而優(yōu)化選擇。

(3) 流動相A、B比例的優(yōu)化：色譜柱為Hanmilton PRX-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)，流速1.0 mL/min；進樣量50 μL，柱溫25 ℃，ICP-MS工作條件如1.3.2，流動相A與B的體積比分別為 80∶20，90∶10，95∶5，99∶1，觀察分離效果以選擇最優(yōu)比例。

1.6.2 提取溫度的優(yōu)化 保持試驗條件(包括色譜條件和ICP-MS工作條件)均相同，考察了不同溫度(50，60，70，80，90，100 ℃)對5種砷形態(tài)提取效率的影響。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 洗脫方式的選擇 由于水產動物中含有較高濃度的無機砷，因此選用陰離子交換色譜柱、洗脫能力較強的磷酸鹽緩沖體系，試驗比較了等度洗脫和梯度洗脫不同方式對5種砷形態(tài)的分離效果。由圖1可知，2種方式均可有效分離5種砷形態(tài)，但是梯度洗脫時間較長，與等度洗脫分離效果無明顯差別，而等度洗脫較為方便并且可以縮短分離時間，在8 min 內能夠實現(xiàn)5種砷形態(tài)的分離且效果較好。因此選用等度洗脫方式。

Figure 1 The effect of different eluting methods on the separation effect of 5 types of arsenic

2.1.2 流動相的優(yōu)化 預試驗發(fā)現(xiàn)，加入EDTA與否對出峰效果及峰型無明顯影響。因此，不在流動相中加入EDTA。

(1) 流動相pH值對分離度的影響：流動相pH值的變化對5種砷形態(tài)的保留時間影響較大。由圖2可知，當pH為6.57和8.71時均不能正常出峰；而pH為8.00時，5種砷形態(tài)均可正常出峰，且保留時間較短；pH為8.71時，As(Ⅴ)的保留時間增加，且AsB與As(Ⅲ)無法分離。因此選擇最佳pH為8.00。

(2) 流動相A與B比例的選擇：據(jù)報道[18]，加入適量的有機相可以提高ICP-MS對砷檢測的靈敏度，但加入有機溶劑過多，會使矩管及錐孔積炭效應嚴重，反而降低儀器靈敏度。由圖3可知，隨著有機溶劑比例的減小，5種砷形態(tài)的保留時間逐漸減小，As(Ⅴ)的保留時間由A與B體積比為80∶20 時的9.37 min減小到A與B體積比為99∶1時的7.98 min，同時也能保持較高的靈敏度。因此，考慮選擇流動相A與B體積比為99∶1。

2.2 提取溫度的選擇

由于溫度對5種砷形態(tài)的提取效率影響較大，其中As(Ⅲ)和As(Ⅴ)還會在一定條件下會發(fā)生轉化，而有機砷形態(tài)穩(wěn)定性較好，因此考察了溫度對5種砷形態(tài)的提取效果的影響。試驗中以0.15 mol/L硝酸水溶液為提取劑，提取時間設為30 min，分別設置不同溫度對5種砷形態(tài)進行提取，結果見表2。對于DMA、MMA 2種砷形態(tài)來說，隨著溫度的增加，提取效率逐漸增加，但80 ℃以后增加幅度減小，AsB的提取效率受溫度影響較小。As(Ⅲ)在溫度高于80 ℃后易轉化，使提取效率降低，而As(Ⅴ)在80 ℃以后提取效率有所增加，可能是由于過高的溫度使得As(Ⅲ)發(fā)生了某種程度的轉化，而總砷也是隨著溫度升高，提取效率增加，但是當溫度>80 ℃以后增加幅度不大，說明80 ℃以后大部分的砷形態(tài)提取得較為完全，無需在更高溫度條件下進行提取。綜合考慮，選擇80 ℃為最佳提取溫度。

2.3 方法的線性范圍及檢出限

分別配制0～100 μg/L的5種砷形態(tài)化合物混合標準系列溶液，在優(yōu)化好的色譜條件及ICP-MS工作條件下進行分析，濃度梯度在0～100 μg/L時，相關系數(shù)r均在0.999 0以上。采用逐級稀釋法，在0.1 μg/L時As(Ⅲ)的信噪比(S/N)≥3；在0.4 μg/L時As(Ⅴ)的信噪比(S/N)≥3；在0.15 μg/L時MMA的信噪比(S/N)≥3；在0.15 μg/L時DMA的信噪比(S/N)≥3；在0.5 μg/L時AsB的信噪比(S/N)≥3；由此確定5種砷形態(tài)化合物的檢出限分別為0.1～0.5 μg/L；稱樣量為1.0 g，定容體積為20 mL，5種砷形態(tài)的最低檢出濃度、定量限(以S/N≥10確定方法定量限)等數(shù)據(jù)見表3。由表3可知，5種砷形態(tài)的最低檢出濃度為0.002～0.010 mg/kg，定量限為0.007～0.010 mg/kg。

2.4 精密度試驗

為檢驗方法的精密度，選擇濃度為10 μg/L的5種形態(tài)砷的混合標準溶液連續(xù)平行測定6次，其相對標準偏差分別為1.5%，3.3%，4.5%，4.5%，2.9%，精密度良好，結果見表4。

?X表示標準溶液的質量濃度，ng/mL；Y為儀器響應值。

2.5 加標回收試驗

準確稱取相同質量(1.000 g左右)的已攪碎蝦肉組織，并向其中加入3種濃度水平(分別為5，20，80 μg/L)的5種砷形態(tài)的混合標準溶液，用1.3所述方法進行樣品前處理，在已優(yōu)化好的色譜條件和ICP-MS工作條件下進行測定，平行進樣3次，計算平均回收率，見表5。由表5可知，加標濃度為5 μg/L時，回收率為87.8%～97.5%；加標濃度為20 μg/L時，回收率為91.0%～95.5%；加標濃度為80 μg/L時，回收率為92.3%～95.6%，均滿足GB/T 27404—2008標準的要求(80%～110%)。

2.6 方法準確度驗證

采用有證標準物質金槍魚肉組織BCR 627，考察方法準確度。由表6可知，本方法對金槍魚肉組織標準物質中砷形態(tài)測定結果能與標準參考值保持一致。說明該方法準確度較高，結果穩(wěn)定可靠。

2.7 實際樣品測定

? N.D表示未檢出。

抽取漯河市市售13種水產動物及其制品各6批次，根據(jù)優(yōu)化后的儀器條件和樣品處理方法分別對其進行5種砷形態(tài)含量的檢測，見表7。由表7可知，在不同種類的水產動物樣品及其制品中，有機砷含量較高，無機砷[As(Ⅲ)和As(Ⅴ)之和]含量較低，大部分在0.005～0.063 mg/kg，均符合GB 2762—2012中污染物限量的規(guī)定(魚類及其制品中無機砷的限量不超過0.1 mg/kg，其他水產動物及其制品中無機砷含量不超過0.5 mg/kg)。

? N.D表示未檢出。

3 結論

本研究建立了用20 mL 0.15 mol/L硝酸水溶液微波消解的前處理方法提取樣品中的砷形態(tài)，Agilent 1260 Infinity LC與Agilent 7700x ICP-MS聯(lián)用技術分離測定水產動物及其制品中的5種砷形態(tài)。與GB 5009.17—2014中所述的測定無機砷的前處理方法相比，該法簡單、測定周期短，采用He模式下的碰撞反應池可以消除Cl對As的潛在干擾，穩(wěn)定性好，同時具有較高的靈敏度；采用磷酸鹽緩沖液作為流動相，Hanmilton PRX-X100陰離子色譜柱作為分析柱，通過對色譜條件進行優(yōu)化，也可以使5種砷形態(tài)達到良好的分離效果，檢出限較低，精密度高；該方法在砷質量濃度為0～100 μg/L 時呈現(xiàn)良好的線性關系，5種形態(tài)砷的相關系數(shù)均在0.999 0以上；通過對有證標準物質金槍魚魚肉組織BCR 627進行測定及加標回收試驗驗證了此方法的準確度，因此本研究所建立的方法適用于快速測定水產動物及其制品中的砷形態(tài)。

但是，由于砷有多種存在形態(tài)，本試驗只研究了砷酸根[As(Ⅴ)]、亞砷酸根[As(Ⅲ)]、砷甜菜堿AsB、一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)5種砷形態(tài)的分離檢測效果，而砷膽堿(AsC)、洛克沙砷(ROX)、4-羥基苯砷酸(4-HPAA)、4-硝基苯砷酸(4-NPAA)等有機砷常作為飼料添加劑使用，能夠提高飼料轉化率、提高產蛋量，但是仍具有一定的毒性，過量添加會使動物中樞神經系統(tǒng)失調，促使腦病和視神經萎縮的發(fā)病率升高；若這些有毒性的有機砷在動物體內代謝過程中殘留或降解為其他砷形態(tài)化合物，對動物造成損害的同時，也會經過食物鏈進入到人體，從而威脅人體健康。因此，同時分離、測定多種砷形態(tài)的簡單高效方法仍需進一步開發(fā)。

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