基于納米金復(fù)合探針的沙門(mén)氏菌快速定量檢測(cè)

謝同彬XIE Tong-bin 梅 林

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

近年來(lái)，食品安全問(wèn)題引起了世界各國(guó)的普遍重視。致病菌污染帶來(lái)的食品安全事故也經(jīng)常被報(bào)道，如法國(guó)的李斯特氏菌病、日本的腸出血性大腸桿菌O157: H7 和雪印牛奶的葡萄球菌腸毒素中毒事件等[1]。由食源性致病菌引起的食品中毒事件已成為全世界舉足輕重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

沙門(mén)菌屬是一種能引起人發(fā)生傷寒、副傷寒、急性腸胃炎、敗血癥等疾病且能寄生在人和動(dòng)物腸道內(nèi)的重要人畜共患病病原體，食品被沙門(mén)氏菌感染對(duì)其安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

目前中國(guó)國(guó)標(biāo)(GB 4789.4—2016)規(guī)定沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法的主要步驟為前增菌、分離、生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定等。該法耗時(shí)費(fèi)力、繁瑣復(fù)雜，需 4～7 d才能得出檢測(cè)結(jié)果，且非運(yùn)動(dòng)型沙門(mén)菌在環(huán)境樣本中存活時(shí)間較短，需要及時(shí)處理樣本。另外檢測(cè)從不同部位分離得到的沙門(mén)氏菌，生化結(jié)果并不是完全一致的[2]，因此國(guó)標(biāo)法被認(rèn)為敏感度較低，檢測(cè)結(jié)果的判斷主觀(guān)性較強(qiáng)。除了傳統(tǒng)的國(guó)標(biāo)法外，目前應(yīng)用較多的還有免疫學(xué)技術(shù)和PCR技術(shù)[3-4]。此外，還有一些分子生物學(xué)技術(shù)：包括基因芯片技術(shù)[5]、核酸探針技術(shù)[6]等，以及電阻抗法[7]、SPR生物傳感器法[8]。但是鑒于現(xiàn)有的方法都存在一些問(wèn)題，比如分子生物學(xué)檢測(cè)方法雖然有快速、靈敏且特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但成本和技術(shù)要求較高，很難得到廣泛應(yīng)用；免疫學(xué)技術(shù)雖然具有重現(xiàn)性好、靈敏度高和較強(qiáng)特異性的優(yōu)點(diǎn)，但成本較高，不適于基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)一種超靈敏、快速、低成本的檢測(cè)方法就顯得非常有意義。

近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)[9]納米材料不僅具有許多優(yōu)良的生物學(xué)和理化特性，使得其在生物領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，而且功能化的納米顆粒在食源性致病菌檢測(cè)方面能夠發(fā)揮巨大的作用。例如：量子點(diǎn)具有量子效應(yīng)，受激發(fā)光刺激會(huì)產(chǎn)生熒光，能夠?qū)κ吃葱灾虏【M(jìn)行定量檢測(cè)[9-10]；納米金具有優(yōu)良的光學(xué)性能，當(dāng)其發(fā)生粒子團(tuán)聚時(shí)，體系顏色會(huì)發(fā)生變化，可進(jìn)行食源性致病菌的半定量檢測(cè)，且耗時(shí)較短[11]；由于磁性納米材料具有順磁性，當(dāng)對(duì)其表面進(jìn)行生物學(xué)修飾后，可以利用其優(yōu)良的特異性對(duì)致病菌進(jìn)行分離、富集和純化，從而能快速達(dá)到國(guó)標(biāo)法前增菌的效果，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間[12]。

本試驗(yàn)擬利用量子點(diǎn)的優(yōu)良發(fā)光性質(zhì)，組裝在納米金粒子上作為顯示探針進(jìn)行信號(hào)放大，再用磁性納米材料作為捕獲探針?lè)蛛x提取沙門(mén)氏菌，檢測(cè)量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，從而定量檢測(cè)食品中的沙門(mén)氏菌含量，以期研發(fā)一種新型的快速定量檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碲粉：分析純，中國(guó)Alfa Aesar公司；

氯金酸：分析純，上海久岳化工有限責(zé)任公司；

親和素：化學(xué)純，美國(guó)Amresco公司；

巰基丙酸、EDC、NHS：分析純，美國(guó)Sigma Aldrich公司；

硼氫化鈉、氯化鎘、氯化高鐵、1，6-己二胺：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

所有沙門(mén)氏菌DNA序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 主要儀器

透射電鏡(TEM)：JEM2100型，日本JEOL公司；

熒光/化學(xué)發(fā)光儀：Zenyth 3100型，奧地利(Anthos)公司；

集熱式磁力加熱攪拌器：DF-101S型，河南鞏義市予華儀器廠(chǎng)；

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)器：Centrifuge 5804R型，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；

熒光光譜儀：F-7000型，日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 CdTe量子點(diǎn)的制備 采用巰基丙酸制備CdTe量子點(diǎn)，具體步驟為：稱(chēng)取0.031 9 g碲粉于燒瓶中，稱(chēng)取0.037 8 g 硼氫化鈉于5 mL離心管中，用5 mL 超純水溶解洗滌，通氮?dú)獬醣Ｗo(hù)；并始終冰浴以保證反應(yīng)溫度；稱(chēng)取0.114 2 g水合氯化鎘于三口燒瓶中，同時(shí)加入磁性轉(zhuǎn)子和100 mL超純水；用移液槍移取對(duì)應(yīng)量巰基丙酸于三口燒瓶中，滴加NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至11.2；安裝冷凝回流裝置；通入氮?dú)獬?0 min，將油浴鍋升溫至100 ℃；取反應(yīng)7 h后的樣品，待合成液冷卻至室溫后，放入4 ℃ 冰箱儲(chǔ)存，備用。采用透射電鏡對(duì)其形貌進(jìn)行表征，并用熒光分光光度計(jì)對(duì)量子點(diǎn)的光譜性質(zhì)進(jìn)行表征[13-14]。

1.3.2 納米金的制備 采用檸檬酸三鈉還原法制備納米金溶液，具體步驟為：準(zhǔn)確量取100 mL新鮮配制的0.01%氯金酸溶液，于圓底燒瓶中，回流加熱攪拌至溶液沸騰，并持續(xù)10 min；然后快速加入10 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)反應(yīng)10 min至溶液不再變色；停止加熱，繼續(xù)攪拌15 min直至得到棕紅色液體，待合成液冷卻至室溫后，放入4 ℃冰箱儲(chǔ)存，備用。用透射電鏡對(duì)其形貌進(jìn)行表征[15]。

1.3.3 CdTe量子點(diǎn)-納米金顯示探針的制備 依據(jù)親和素-生物素特異性結(jié)合的原理，利用顯示DNA連接CdTe量子點(diǎn)和納米金粒子，具體步驟為：取100 μL CdTe量子點(diǎn)溶液，加入到200 μL含有4 mg EDC的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，攪拌混合反應(yīng)；將1 mg NHS加入到上述溶液中，混合反應(yīng)；將80 μL 1 mg/mL 親和素加入其中，混合反應(yīng)，離心。用PBS清洗一次后，再離心，將最終產(chǎn)品保存于4 ℃?zhèn)溆茫蝗?00 μL上述備用溶液，加入770 μL 顯示DNA(顯示DNA序列: SH-5'-ATA TCC ACG CAG GAA ATA ACA GGA CTT-3'-biotin)反應(yīng)24 h；然后加入250 μL納米金溶液，并溫和搖晃反應(yīng)16 h，離心。用0.1 mol/L NaCl和PBS的混合液清洗一次后，再離心溶解，保存于4 ℃?zhèn)溆?。用透射電鏡對(duì)其形貌進(jìn)行表征[16-17]。

1.3.4 氨基化Fe3O4磁性納米粒子的制備 采用水熱-溶劑熱方法，具體步驟為：準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g 六合水氯化高鐵、6.5 g 1,6-己二胺、2.0 g無(wú)水乙酸鈉，置于50 mL具塞圓底燒瓶中，加入30 mL乙二醇，于50 ℃恒溫水浴鍋中劇烈攪拌，直至溶液變?yōu)橥该骶萍t色，轉(zhuǎn)移至帶有四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜中，并放置于198 ℃ 烘箱中反應(yīng)6 h，然后停止加熱取出，待自然冷卻至室溫時(shí)，用無(wú)水乙醇、超純水交替洗滌3～5次，于50 ℃烘箱干燥；最終得到氨基化的磁珠顆粒，存于4 ℃ 備用。用透射電鏡對(duì)其形貌進(jìn)行表征[18]。

1.3.5 磁性納米粒子捕獲探針的制備 利用親和素和生物素的特異性結(jié)合原理，制備磁性納米粒子捕獲探針。具體步驟為：稱(chēng)取5 mg氨基化Fe3O4磁性納米粒子，倒入含5%戊二醛的PBS溶液中，反應(yīng)4 h；通過(guò)磁力收集并用PBS清洗3次；加入300 μL 1 mg/mL親和素，反應(yīng)4 h；用PBS通過(guò)磁力收集清洗3次，保存于4 ℃。吸取100 μL上述溶液，再吸取100 μL 10 nmol/L捕獲DNA溶液(捕獲DNA序列: GAG CGT GCC TTA CCG ACG ATA-biotin-3')，于37 ℃反應(yīng)2 h，然后用PBS磁力收集洗滌3次，存于 4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 沙門(mén)氏菌目標(biāo)DNA檢測(cè) 吸取稀釋不同數(shù)量級(jí)濃度(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7)的目標(biāo)DNA溶液,(目標(biāo)DNA序列: 5'-TAT CGT CGG TAA GGC ACG CTC AAT TGT CGT TAA AGT CCT GTT ATT TCC TGC GTG GAT AT-3')各100 μL和雜交緩沖溶液100 μL，于42 ℃反應(yīng)2 h，磁力收集洗滌3次；然后吸取100 μL顯示探針和100 μL雜交緩沖溶液，于42 ℃反應(yīng)2 h，磁力收集洗滌3次；最后用熒光光譜儀測(cè)定反應(yīng)溶液的熒光強(qiáng)度，從而計(jì)算得出目標(biāo)DNA濃度和熒光強(qiáng)度的線(xiàn)性關(guān)系。

1.3.7 復(fù)合納米探針?lè)▽?duì)含有沙門(mén)氏菌的食品樣品的檢測(cè)

為了檢驗(yàn)本法的靈敏度和準(zhǔn)確性，取人為添加不同濃度沙門(mén)氏菌(原液，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5)的市售牛奶樣品，用成品試劑盒提取沙門(mén)氏菌DNA，然后用本方法檢測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度，以此來(lái)判斷本法的可行性和準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 CdTe量子點(diǎn)的表征

由圖1可知，CdTe量子點(diǎn)的粒徑為4 nm左右，呈圓球形。由圖2可知，碲化鎘的最大發(fā)射波長(zhǎng)為587 nm。

2.2 納米金粒子的透射電鏡圖

由圖3可知，納米金粒的直徑約為12.5 nm，適于作核酸標(biāo)記物。

2.3 顯示探針的表征

本方法利用親和素和生物素特異性結(jié)合的原理，將顯示DNA連接上CdTe量子點(diǎn)，再利用巰基和納米金特異性結(jié)合的特點(diǎn)，使一個(gè)納米金上連接多個(gè)量子點(diǎn)，以起到信號(hào)放大作用。由圖4可知，每個(gè)納米金粒子已成功連接了多個(gè)量子點(diǎn)。

2.4 氨基化Fe3O4磁性納米粒子的透射電鏡圖

試驗(yàn)采用水熱-溶劑熱法制備了氨基化的單晶Fe3O4磁性納米顆粒。由圖5可知，氨基化Fe3O4磁性納米粒子均為球狀的單晶，粒徑大約在30～60 nm。

2.5 合成的沙門(mén)氏菌目標(biāo)DNA檢測(cè)

在10～1 000 fmol/L范圍內(nèi)，沙門(mén)氏菌DNA濃度與熒光強(qiáng)度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為IF=0.198[DNA]+55.00，R2=0.997，且得到的檢出限為8 fmol/L。

2.6 納米探針?lè)z測(cè)含有沙門(mén)氏菌的食品樣品的檢測(cè)結(jié)果分析

根據(jù)《食品中致病菌限量》(GB 29921—2013)的要求，食品中不得檢出沙門(mén)氏菌。為了檢驗(yàn)本法的靈敏度和準(zhǔn)確性，取人為添加不同濃度沙門(mén)氏菌的市售牛奶樣品，用成品試劑盒提取DNA后，分別檢測(cè)含有梯度稀釋沙門(mén)氏菌濃度的牛奶(表1)，當(dāng)檢測(cè)到稀釋10-5的牛奶后，再檢測(cè)稀釋1倍、2倍、5倍、10倍的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示稀釋到2倍時(shí)，已經(jīng)檢測(cè)不出。因此，將10-5再稀釋1倍的熒光強(qiáng)度，帶入2.5得到的方程中，計(jì)算得出最低檢出限是4 fmol/L。

3 結(jié)論

為了適應(yīng)檢測(cè)需要，避免現(xiàn)有方法存在的缺陷，本試驗(yàn)利用發(fā)光量子點(diǎn)的高靈敏度，將多個(gè)量子點(diǎn)結(jié)合到納米金上進(jìn)行信號(hào)放大，以達(dá)到超靈敏的檢測(cè)目的，克服了國(guó)標(biāo)方法需要前增菌的繁瑣步驟。此外，利用磁性納米材料的磁分離作用，免去了以往的提取分離步驟。同時(shí)，本方法一次性制得的顯示探針和捕獲探針溶液，可以多次使用，減少成本，相比分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的高成本、高技術(shù)要求，具有良好的應(yīng)用推廣前景。

對(duì)于沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，該法顯示了良好的穩(wěn)定性，在10～1 000 fmol/L范圍內(nèi)，沙門(mén)氏菌DNA濃度與熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為IF=0.198[DNA]+55.00，R2=0.997，得到的檢出限為8 fmol/L。在檢測(cè)被沙門(mén)氏菌污染的牛奶樣品中，也顯示了優(yōu)良的應(yīng)用性，最低檢出限為4 fmol/L。需要指出的是，最低檢測(cè)限的不同主要是由于將不同濃度的沙門(mén)氏菌液加入到牛奶中，用試劑盒提取沙門(mén)氏菌DNA，通過(guò)這個(gè)過(guò)程，與直接檢測(cè)合成的沙門(mén)氏菌DNA序列濃度相比更加準(zhǔn)確，同時(shí)也反映了在今后檢測(cè)實(shí)際樣品中沙門(mén)氏菌時(shí)，本法具有更好的靈敏度，可以達(dá)到超靈敏檢測(cè)的目的。

鑒于納米金和量子點(diǎn)復(fù)合探針的優(yōu)良檢測(cè)特性，以及磁性納米探針的特異分離效應(yīng)，本試驗(yàn)研發(fā)了一種快速、簡(jiǎn)便、低成本、高靈敏度的沙門(mén)氏菌新型快速定量檢測(cè)技術(shù)。后續(xù)試驗(yàn)將繼續(xù)優(yōu)化檢測(cè)條件，證實(shí)本法的特異性和靈敏度，并擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。

[1] 周明東. 食源性致病菌快速檢測(cè)方法的建立及其試劑盒的研制和應(yīng)用[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012: 15-17.

[2] 王杰, 陳穎鈺, 彭清潔, 等. 沙門(mén)菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2016, 37(4): 94-98.

[3] 趙平, 楊光, 丁松喬, 等. 食品中沙門(mén)氏菌檢測(cè)研究進(jìn)展[J]. 食品安全導(dǎo)刊, 2016(5): 100-101.

[4] 閏琳, 王曉英, 郭云昌, 等. 應(yīng)用Taqman實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)禽肉中沙門(mén)菌的研究[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 48(8): 731-735.

[5] 許俊鋼. 基因芯片快速檢驗(yàn)細(xì)菌的臨床應(yīng)用[J]. 中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥, 2016, 11(1): 33-34.

[6] 賀氣志, 寧毅, 陳珂珂, 等. 基于核酸功能化的氧化石墨烯技術(shù)快速檢測(cè)含 SSeC 基因鼠傷寒沙門(mén)氏菌的研究[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2016, 36(6): 453-457.

[7] 劉喆, 張書(shū)蕭, 王少輝, 等. 沙門(mén)氏菌的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展[J]. 中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào), 2012, 20(2): 81-86.

[8] 胡靜, 胡佳佳, 沈雯, 等. 同時(shí)檢測(cè)沙門(mén)氏菌和炭疽桿菌磁致伸縮生物傳感器制備與應(yīng)用[J]. 農(nóng)業(yè)工業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 32(5): 297-301.

[9] 李萌立, 李忠海, 李節(jié), 等. 量子點(diǎn)熒光探針技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 食品與機(jī)械, 2013, 29(5): 241-244.

[10] WANG Hong, LI Yan-bin, WANG Andrew, et a1. Rapid，sensitive，and simultaneous detection of three foodborne pathogens using magnetic nanobead·based immunoseparation and quan-tum dot-based multiplex immunoassay[J]. Journal of Food Protection, 2011, 74(12): 2 039-2 047.

[11] SU Hai-chao, MA Qiang, SHANG Kun, et a1. Gold nanoparticles as colorimetric sensor: a case study onE.coliO157:H7 as a model for Gram-negative bacteria[J]. Sens Actuators B, 2012, 161(1): 298-303.

[12] 王馨, 胡文忠, 陳晨, 等. 納米材料在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2016, 42(6): 243-247.

[13] 王書(shū)源, 李忠海, 黎繼烈, 等. 高熒光CdTe量子點(diǎn)熒光探針測(cè)定 CU2+[J]. 食品與機(jī)械, 2015, 31(2): 125-129.

[14] HUA Xiao-feng, LIU Tian-cai, CAO Yuan-cheng, et al. Characterization of the coupling of quantum dots and immunoglobulin antibodies[J]. Anal. Bioanal. Chem., 2006, 386(6): 1 665-1 671.

[15] SOON C, YOUNGESO M, HYOJONG Y. Finely tunable fabrication and catalytic activity of gold multipod nanoparticles[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2016, 469(1): 269-276.

[16] XING Yun, CHAUDRY Q, SHEN Christopher, et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry[J]. Nat. Protoc., 2007, 2(5): 1 152-1 165.

[17] HENNING-KNECHTEL A, WIENS M, LAKATOS M, et al. Dielectrophoresis of gold nanoparticles conjugated to DNA origami structures[J]. Beilstein J Nanotechnol., 2016, 1(7): 948-956.

[18] BAGHANIL A N, MAHVI A H, GHOLAMI M, et al. One-Pot synthesis, characterization and adsorption studies of amine-functionalized magnetite nanoparticles for removal of Cr (VI) and Ni (II) ions from aqueous solution: kinetic, isotherm and thermodynamic studies[J]. Journal of Environmental Health Science & Engineering, 2016, 14(1): 11-22.