保健食品中非法添加藥物的廣譜篩查和確證

張 帆 Fan 王美玲 - 李蓉娟 - 顏鴻飛 - 張 瑩 黃志強 -

(1. 湖南省檢驗檢疫科學(xué)研究院，湖南 長沙 410004；2. 長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004；3. 中南大學(xué)，湖南 長沙 410083；4. 東港出入境檢驗檢疫局，遼寧 東港 118300)

隨著中國保健食品市場的飛速發(fā)展，保健食品安全事件也不斷出現(xiàn)，一些不法分子為了突顯產(chǎn)品功效，常在中成藥、保健食品中非法添加一些藥物[1-3]，如保健酒、配制酒中違法添加西地那非(俗名“偉哥”)或近似成分；降血糖功能產(chǎn)品添加二甲雙胍、格列苯脲等降糖藥；減肥功能產(chǎn)品添加西布曲明等。由于此類藥物為處方藥，國家嚴(yán)禁添加在任何保健食品中，若患者在不知情的情況下持續(xù)、大量服用這樣所謂的保健食品，有可能產(chǎn)生難以預(yù)知的不良生理反應(yīng)，呈現(xiàn)藥物中毒癥狀，嚴(yán)重時有可能威脅到患者的生命安全。2012年3月20日，國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了《保健食品中可能非法添加的物質(zhì)名單(第一批)》，涉及西布曲明等六大類50余種物質(zhì)，以此來監(jiān)控功能性保健品中的非法添加藥物。

目前國內(nèi)外對保健品中非法添加化學(xué)物質(zhì)的檢測已有許多的研究報道，主要集中在對已知化合物進(jìn)行定性和定量分析。保健食品中非法藥物添加主要存在添加藥物劑量不明確、配伍關(guān)系不確切、所添加藥物來源不明、所含藥物雜質(zhì)不清晰等隱患。為篩查的目標(biāo)選擇帶來了難度，需要建立靈敏度好、專屬性好的分析方法，進(jìn)一步加強對保健食品中非法添加的化學(xué)藥物進(jìn)行鑒別檢測。分析方法有紫外分光光度法[4]、薄層色譜法[5]、高效液相色譜法[6]、高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-9]等。高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)憑借其選擇性好、靈敏度高、較強的抗干擾能力等優(yōu)勢，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中國保健品種濫用藥物的定量測定和篩查中。但該分析方法屬于 “目標(biāo)分析方法”，具有較強的針對性，只適用于對該方法中預(yù)設(shè)的目標(biāo)化合物進(jìn)行分析。然而化學(xué)藥品種類繁多、數(shù)量巨大，不法分子經(jīng)常費盡心思尋找限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定之外的其他替代化學(xué)藥品以逃避法律的監(jiān)管。因此無法對保健食品中非法添加物進(jìn)行全面快速篩查，阻礙了保健食品安全監(jiān)測和預(yù)警體系的建立。

離子阱—飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(LCMS-IT-TOF)由于既具備高分辨率和高質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度，又具備多級質(zhì)譜功能(最多到10級)，能提供未知化合物的結(jié)構(gòu)信息。通過精確質(zhì)量數(shù)的檢索匹配及多級特征碎片離子確證，可以快速且方便地對未知化合物實現(xiàn)快速篩查與鑒定[10-11]。本試驗在自建藥物數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，擬采用離子阱—飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜通過精確質(zhì)量數(shù)的檢索匹配，對保健食品中非法添加藥物實現(xiàn)快速篩查，并使用多級特征碎片離子進(jìn)行確證，根據(jù)碎片離子，推導(dǎo)出裂解途徑。應(yīng)用于某品牌減肥保健食品，從中發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)該保健食品中非法添加了西布曲明。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-二極管陣列檢測器-離子阱-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀：LCMS-IT-TOF型，配LC MS solution V 3.6工作站，日本島津公司；

超聲波清洗器：B 5510E型，美國必能信公司；

高速離心機：1-15P型，德國Sigma公司；

超純水機： Milli-Q Advantage A10型，美國Millipore公司。

比沙可啶、芐氟噻嗪、布美他尼、多慮平、芬氟拉明、呋塞米、氟西汀、甲氯噻嗪、氯噻嗪、氯噻酮、氫氯噻嗪、舍曲林、西布曲明、吲達(dá)帕胺：純度>95%，美國Sigma公司；

麻黃堿、去甲麻黃堿：純度>95%，中國藥品生物制品檢定所；

十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)：40～60 mm，北京艾杰爾有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，德國Merck公司；

其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別稱取10.0 mg上述標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，轉(zhuǎn)入棕色樣品瓶中，于-20 ℃下冷凍保存。試驗中用甲醇稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4 ℃下保存。

1.2.2 樣品制備 膠囊樣品，傾出內(nèi)容物連同膠囊殼一起搗碎，混勻。

1.2.3 樣品前處理 稱取1.00 g試樣(精確至0.001 g)置于25 mL離心管中，加入15 mL乙腈，超聲提取20 min，冷卻至室溫，將樣品全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用10 mL乙腈分?jǐn)?shù)次清洗離心管，合并清洗液至容量瓶中，并用乙腈定容至刻度，搖勻后，靜置5 min。取2 mL上清液到另一潔凈的離心管中，加入10 mg C18粉末，充分渦旋后，以18 000 r/min 離心3 min，取0.5 mL上清液，用流動相稀釋至1.0 mL，過0.22 μm有機微孔濾膜后，上機供測試。

1.2.4 色譜條件 色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse AAA柱(4.5 mm×150 mm，5 μm)；流動相A為0.1%乙酸水溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫程序：0～8 min，5% B～20% B；8～26 min，20% B～50% B； 26～33 min，50% B～100% B；100% B 保持7 min，40.0～40.1 min，100% B～5% B；40.1～45.0 min，5% B。柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL，檢測波長230 nm。

1.2.5 質(zhì)譜條件 離子源：ESI，正負(fù)離子同時掃描；掃描范圍：MS1m/z150～1 000，MS2m/z50～500，MS3m/z50～500；加熱模塊溫度：200 ℃；CDL溫度：200 ℃；霧化氣流速：1.5 L/min；干燥氣流速：10 L/min；離子源電壓：正離子模式+4.5 kV，負(fù)離子模式-3.5 kV；檢測器電壓：1.7 kV；質(zhì)量數(shù)校準(zhǔn)方法：自動調(diào)諧優(yōu)化電壓，外標(biāo)法校準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件優(yōu)化

目前文獻(xiàn)[7,9]報道的保健食品中減肥類藥物的提取方法，主要使用甲醇、乙腈、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-10 mmol/L 醋酸銨等有機溶劑進(jìn)行超聲萃取。本研究是對多種違禁藥物進(jìn)行篩查，所涉及的化合物種類較多，化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，性質(zhì)相差較大，需要一種普適強的提取方法。分別比較了甲醇、乙腈、1%乙酸甲醇、1%乙酸乙腈和甲醇-水(1+1，體積比)等溶劑的提取效果。試驗結(jié)果顯示，用甲醇或甲醇-水提取，由于溶劑極性大，提取的雜質(zhì)較多，基質(zhì)干擾嚴(yán)重。在提取溶劑中加入乙酸，對提取效果無明顯改善，反而部分含氨基化合物的回收率下降。乙腈屬于通用型試劑，用乙腈提取能兼顧大多數(shù)化合物的提取效率，且基質(zhì)干擾相對較少，適用于多組分篩選。C18吸附劑能有效去除樣品中的油脂和其他非極性干擾物，使基質(zhì)抑制得到改善，故選用C18吸附劑進(jìn)行凈化。

2.2 質(zhì)譜條件和色譜條件的優(yōu)化

由于篩查的化合物種類較多，電離性質(zhì)不同，除了主要在正離子模式下有響應(yīng)的化合物以外，還有少部分化合物在負(fù)離子模式下電離。本方法充分利用離子阱—飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜快速正負(fù)極轉(zhuǎn)換功能，能夠?qū)悠吠瑫r進(jìn)行正負(fù)離子模式掃描，從而實現(xiàn)一次進(jìn)樣卻能得到所有化合物的質(zhì)譜信息，極大地節(jié)省了分析時間。

多種非法添加藥物極性差異比較大，有極性、中等極性或弱極性化合物?？疾炝顺Ｓ眉状?水、乙腈-水混合溶劑體系作為流動相對目標(biāo)化合物的色譜行為和離子化程度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)使用乙腈-水體系作為流動相時，大部分待測化合物的響應(yīng)值比用甲醇-水作流動相時高。試驗還進(jìn)一步比較了流動相中加入0.1%乙酸、0.1%甲酸、5 mmol/L 甲酸銨、5 mmol/L乙酸銨等揮發(fā)性試劑對靈敏度的影響。正離子模式下流動相中加入酸，可顯著提高離子化效率和靈敏度。負(fù)離子模式下，流動相中加入酸性溶液，會抑制分析物的去質(zhì)子化。因此當(dāng)加入0.1%甲酸溶液后，目標(biāo)化合物響應(yīng)明顯減弱，有些幾乎不出峰，如氫氯噻嗪。采用5 mmol/L乙酸胺-乙腈作流動相時，個別化合物峰型較寬，拖尾嚴(yán)重。綜合考慮，本試驗采用0.1%乙酸-乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，使所有化合物都盡可能出峰，擴大篩查范圍，并且具有較高的靈敏度和較好的分離度。

2.3 高分辨質(zhì)譜譜庫的建立

參照法規(guī)、指令、相關(guān)文獻(xiàn)、新聞報道等，盡可能查到保健食品中所有減肥類非法添加物的名單，并將這些化合物名稱、分子式、精確分子量輸入到Excel文檔，將Excel文檔導(dǎo)入MetaID軟件作為一級高分辨質(zhì)譜篩查譜庫。利用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，建立多級碎片離子及保留時間信息數(shù)據(jù)庫，用于進(jìn)一步定性確證。包含中英文名稱、CAS號、分子量、分子式、結(jié)構(gòu)式、加合模式、電離模式、一級質(zhì)譜圖、二級等多級質(zhì)譜圖等信息，導(dǎo)入ACD LABS 12.0 MS Manager 軟件用于譜庫檢索。通過譜庫檢索，未知化合物質(zhì)譜圖中主要碎片離子峰的m/z與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對比，最后得到的結(jié)果用各級譜圖匹配度(MSsimilarity)來衡量相似性，匹配度的程度可作為確證參考。該數(shù)據(jù)庫同時是開放的體系，可不斷增加化合物種類，還可自行對非法添加藥物的多級質(zhì)譜庫進(jìn)行擴展。16種常見減肥藥物的多級質(zhì)譜庫信息見表1。

表1 16種化合物的分子式、保留時間、精確質(zhì)量數(shù)、主要碎片離子以及膠囊樣品中篩查限、平均回收率和精密度

Table 1 List of target illegal adulterants with corresponding molecular formula, retention time, polarity, diagnostic precursor ions, sequential multistage fragment ions (MS2and MS3)a,accurate mass data, screening detection limit(SDL), average recovery (at SDL) and precisions (RSD)

2.4 篩查流程圖

保健食品中非法添加藥物種類繁多，除了添加常用的治療藥物，還常添加治療藥物的結(jié)構(gòu)類似物、臨床上本不用作治療或已被淘汰的藥物以及尚未獲得批準(zhǔn)的新型藥物或先導(dǎo)化合物。因此保健食品中非法添加藥物的篩查即包括已知化合物名稱，并有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的目標(biāo)化合物篩查；又包括已知化合物名稱，但無相應(yīng)對照品，或既不知化合物名稱，又無對照品的非目標(biāo)化合物篩查。篩查分析面臨兩個難點：① 化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，相對分子質(zhì)量范圍廣;② 非目標(biāo)化合物的分析中無相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，無法進(jìn)行比對研究。本研究建立了如圖1所示的篩查策略。步驟①適用于目標(biāo)化合物篩查，步驟②和③適用于非目標(biāo)化合物篩查。通過紫外光譜確定非法添加藥物特征吸收波長，結(jié)合濫用藥物高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，通過精確質(zhì)量數(shù)的檢索匹配對非法添加藥物實現(xiàn)快速篩查，并使用保留時間、同位素豐度和多級特征碎片離子進(jìn)行確證。

2.5 實際樣品篩查

應(yīng)用該方法對實際樣品進(jìn)行篩查，圖2為市售某減肥膠囊樣品溶液正模式下的離子流圖。在23.5 min有一個很強的色譜峰，對應(yīng)的分子離子峰為m/z280.181 3、二級碎片離子為m/z235.124 8；m/z179.062 9、m/z153.046 1、m/z139.031 4、m/z125.015 9，三級碎片離子為m/z103.054 3，見圖2。根據(jù)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)，采用分子式預(yù)測軟件預(yù)測其對應(yīng)的分子式，得到4個候選的化合物，其中一種化合物分子式為C17H26NCl。

同時由MetID solution 篩查軟件按精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行自動快速定性篩查，篩查結(jié)果為西布曲明。為進(jìn)一步確證該化合物的存在，將所得的多級高分辨質(zhì)譜碎片離子，在自建的藥物高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中搜索，得到其二級碎片離子與西布曲明的匹配度達(dá)到99.4%，見圖3、4，且保留時間與西布曲明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間一致。因而確認(rèn)該減肥膠囊中含有西布曲明。根據(jù)特征子離子碎片信息推斷出該化合物的多級裂解規(guī)律見圖5，在正電荷中心N+的吸引下，與正電荷中心連接的胺基N—C鍵斷裂，丟失C2H7N，形成m/z為235.124 8 的中間體，該中間體有3種結(jié)構(gòu)形式：四元環(huán)形式以及穩(wěn)定性更好的五元環(huán)和開環(huán)結(jié)構(gòu)形式，經(jīng)分子預(yù)測軟件可知m/z179.062 9、m/z153.046 6、m/z139.030 9和m/z125.015 9，這些碎片離子是由開環(huán)結(jié)構(gòu)的中間體分別丟失C4H8、C6H10、C7H12和C8H14得到，m/z為139.030 9的二級碎片離子進(jìn)一步裂解，丟失HCl得到m/z為103.054 3的碎片離子。這與文獻(xiàn)[12]報道的西布曲明完全相符，因此進(jìn)一步確證了保留時間為23.5 min 的化合物為西布曲明。

Figure 4 Confirmation of thecompoundvia library matching by using ACD/MS Manager based on retention precision and MSn spectrum similarity

3 結(jié)論

本試驗采用液相色譜-二極管整列檢測器-離子阱-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜對保健食品中的非法添加藥物進(jìn)行了篩查與確認(rèn)。通過譜庫檢索、分子式預(yù)測、以及多級碎片離子質(zhì)譜圖鑒定，可對已知以及非目標(biāo)化合物進(jìn)行檢測，并根據(jù)碎片離子信息，推斷其裂解規(guī)律。該方法簡單、快速，為“非目標(biāo)”檢測分析、篩查范圍廣、在不使用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌返那闆r下即可得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)論。適用于食品、藥品中減肥類非法添加物以及其他非法添加物的快速篩查與鑒定。

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