黑曲霉代謝組學(xué)研究進(jìn)展*

靳夢(mèng)琦 李 軍 朱鳳妹 劉 暢

1（河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北昌黎066600）

2（河北省果品加工工程技術(shù)研究中心，河北昌黎066600）

黑曲霉是一種廣泛存在于自然界中的絲狀子囊真菌，屬于真核生物。黑曲霉的分生孢子頭呈黑褐色放射狀，頂囊呈球形，雙層小梗，多見(jiàn)于糧食、植物性產(chǎn)品以及土壤中，生長(zhǎng)的適宜pH值為3～7。黑曲霉是重要的工業(yè)發(fā)酵菌種，在有機(jī)酸發(fā)酵和工業(yè)酶制劑方面有著廣泛的應(yīng)用，同時(shí)在生物技術(shù)開(kāi)展過(guò)程中發(fā)揮了很大的作用，很多產(chǎn)品來(lái)自于絲狀真菌的初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物。由于美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）已經(jīng)認(rèn)定許多來(lái)自黑曲霉的產(chǎn)物是安全的，所以黑曲霉被廣泛用于食品級(jí)產(chǎn)物的生產(chǎn)過(guò)程中。

代謝組學(xué)是指對(duì)生物體內(nèi)一切代謝物進(jìn)行定性定量分析，它是關(guān)于生物體系內(nèi)源代謝物質(zhì)種類、數(shù)量及其變動(dòng)規(guī)律的科學(xué)，研究生物整體、系統(tǒng)或器官的內(nèi)源性代謝物質(zhì)及其與內(nèi)在或外在因素的相互作用，并尋找代謝物與生理病理變化的相對(duì)關(guān)系，其在系統(tǒng)生物學(xué)研究中占據(jù)著極其重要的地位。代謝組學(xué)研究的物質(zhì)大多數(shù)為相對(duì)分子質(zhì)量在1 000以內(nèi)的小分子物質(zhì)。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后的系統(tǒng)生物學(xué)中另一個(gè)重要的組成部分，同時(shí)也是目前組學(xué)研究的熱門研究領(lǐng)域之一。代謝組學(xué)研究與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究相比，具有易于檢測(cè)、有數(shù)據(jù)庫(kù)、通用性強(qiáng)、結(jié)果直接、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)；與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相比，通過(guò)代謝物分析能夠更敏銳地分析環(huán)境擾動(dòng)或脅迫對(duì)細(xì)胞的影響，因?yàn)樵谟行┣闆r下環(huán)境的改變并不能影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平，卻可以通過(guò)其代謝產(chǎn)物的變化而表現(xiàn)出來(lái)。由于對(duì)黑曲霉基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究越來(lái)越清晰，進(jìn)一步推動(dòng)了黑曲霉代謝組學(xué)研究的發(fā)展，可靠的胞內(nèi)代謝物組數(shù)據(jù)的獲取和代謝通量分析是揭示細(xì)胞真實(shí)代謝狀態(tài)的直接證據(jù)，對(duì)于提高代謝工程和工業(yè)發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化的理論和實(shí)踐水平也具有重要意義。本文對(duì)黑曲霉代謝組學(xué)研究方法及研究進(jìn)展進(jìn)行了概述，以期推進(jìn)代謝組學(xué)在黑曲霉研究領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 黑曲霉代謝組學(xué)研究過(guò)程

作為新興的分子生物學(xué)技術(shù)，代謝組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用在生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域中。尤其在微生物領(lǐng)域中，該技術(shù)已取得了較大的進(jìn)展。代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用高通量檢測(cè)方法對(duì)微生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，并對(duì)其代謝產(chǎn)物的代謝途徑進(jìn)行研究整理。以Aspergillus和Penicillium為例，真菌細(xì)胞的次級(jí)代謝產(chǎn)物據(jù)估計(jì)達(dá)到10 000多種，但目前已知的代謝產(chǎn)物不足10%。本文以黑曲霉代謝組學(xué)研究為例，講述代謝組學(xué)研究方法中的樣品處理、代謝物分析鑒定和數(shù)據(jù)分析。

1.1 樣品處理

黑曲霉代謝組學(xué)研究要求黑曲霉的生長(zhǎng)條件是能夠控制和重復(fù)的。必須嚴(yán)格控制溫度、pH、培養(yǎng)基組成、溶解O2和CO2等，以明確界定生長(zhǎng)條件，建立標(biāo)準(zhǔn)的和可重復(fù)的參考培育條件。黑曲霉菌絲球在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)受到多種因素的影響，例如pH、孢子濃度、營(yíng)養(yǎng)成分、培養(yǎng)條件、黑曲霉的生長(zhǎng)狀態(tài)等。胡立明等人對(duì)黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的液體發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步研究黑曲霉代謝組學(xué)提供了良好的培養(yǎng)基礎(chǔ)。

在黑曲霉代謝組學(xué)研究中對(duì)取樣的要求十分嚴(yán)格，要求快速取樣，這樣不僅能防止底物濃度發(fā)生巨大變化，而且還能保證黑曲霉的代謝產(chǎn)物維持穩(wěn)定，為接下來(lái)的分析處理減少了影響。因此許多快速取樣設(shè)備應(yīng)運(yùn)而生，如BioScope裝置和Fast Swinnex Filtration（FSF）裝置等，均可實(shí)現(xiàn)樣品的快速采集。

與此同時(shí)，為了保證提取過(guò)程中代謝產(chǎn)物的完整性和真實(shí)性，要求在快速取樣后迅速對(duì)樣品進(jìn)行淬滅以終止代謝反應(yīng)。在淬滅過(guò)程中，要盡可能保證細(xì)胞的完整性并快速淬滅酶活力。液氮冷凍或高氯酸滅活技術(shù)是在動(dòng)物和植物代謝組學(xué)研究中最為常用的2種滅活方法，但對(duì)于微生物的代謝組學(xué)研究，為了將胞內(nèi)代謝物與胞外代謝物有效分離，則采用冷甲醇處理的淬滅方法，同時(shí)研究表明淬滅時(shí)用冷甲醇處理真核細(xì)胞的效果要好于處理原核細(xì)胞。目前這種方法在L.lactis、S.cerevisiae、E.coli、C.g lutam i2cum、A.niger、B.subtilis中均有應(yīng)用。因此在絲狀真菌黑曲霉的代謝物淬滅時(shí)運(yùn)用冷甲醇處理的方法在目前較為適用。

代謝物的提取是黑曲霉代謝組學(xué)研究中最為重要的步驟之一。代謝物的提取程度直接影響試驗(yàn)的分析結(jié)果，因此在對(duì)代謝物進(jìn)行提取時(shí)要求最大限度提取代謝物并且保證代謝物的完整性，不破壞或改變代謝物的相應(yīng)理化性質(zhì)。目前關(guān)于代謝物的提取溶劑有冷甲醇、熱乙醇、高氯酸或堿、熱甲醇、甲醇和氯仿混合液以及乙腈等。對(duì)于蛋白質(zhì)應(yīng)通過(guò)溶劑沉淀出來(lái)，如加入乙腈或甲醇使其變性；對(duì)于脂肪和脂質(zhì)這類水不溶性的，可用2∶1的氯仿和甲醇混合液萃取得到?；诖罅垦芯勘砻?，出于對(duì)代謝物提取率的考慮，大多數(shù)提取方法采用熱乙醇提取。

1.2 代謝物的分析鑒定

代謝物的檢測(cè)、分析鑒定是代謝組學(xué)技術(shù)的重要組成部分。代謝物的分析平臺(tái)主要分兩類，分別是質(zhì)譜（Mass Spectrometry，MS）和核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）技術(shù)分析平臺(tái)。對(duì)于代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法，一種新的多維分離技術(shù)如二級(jí)氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜的檢測(cè)范圍更為廣泛，但由于其花費(fèi)較大沒(méi)能得到推廣。對(duì)于氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS），此方法需要對(duì)揮發(fā)性較低的代謝物進(jìn)行衍生化預(yù)處理，容易引起樣品的變化且花費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)。液相質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）在檢測(cè)過(guò)程中無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，這大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，也使得其在黑曲霉代謝學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。此外，毛細(xì)管HPLC-MS、UPLC-MS在微生物代謝組學(xué)研究中漸漸得到應(yīng)用，明顯提高了分辨率、靈敏度和通量。目前市場(chǎng)上出現(xiàn)的AbsoluteIDQTM p180試劑盒，可同時(shí)鑒定和定量180種代謝物，包括氨基酸、生物胺、?；鈮A、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、鞘磷脂和己糖總和（一種產(chǎn)生的代謝物）等，可廣泛用于代謝組學(xué)研究。AbsoluteIDQTMp180試劑盒通過(guò)與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的液相色譜（LC）分析氨基酸和生物胺，使用耦合到串聯(lián)質(zhì)譜法的流動(dòng)注射（FIA）分析其他代謝物，采用新挑選的內(nèi)標(biāo)和多重化合物反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）進(jìn)行鑒定和定量。例如，這種試劑盒用于人類代謝組的第一個(gè)大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)研究中鑒定和定量血清樣品中的163種代謝物以及研究酒精誘導(dǎo)的代謝組學(xué)差異。因此，開(kāi)發(fā)更廣泛的標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒對(duì)于定量代謝組學(xué)的進(jìn)展是不可或缺的。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)分析是代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需要對(duì)原始數(shù)據(jù)預(yù)先進(jìn)行處理，消除相關(guān)干擾因素，從而得到代謝組學(xué)研究的可利用正確格式。代謝物組學(xué)分析從數(shù)據(jù)預(yù)處理開(kāi)始，可根據(jù)質(zhì)譜分析儀器所配套的軟件進(jìn)行譜峰提取、譜峰對(duì)齊、歸一化和數(shù)據(jù)質(zhì)量分析。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行提取，以內(nèi)標(biāo)做參照，通過(guò)使用配套研發(fā)的專利軟件，對(duì)質(zhì)譜峰進(jìn)行對(duì)齊，得出校正后的數(shù)據(jù)，然后運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，計(jì)算每種化合物在不同樣品組中差異的顯著性。常見(jiàn)的分析方法以PCA分析、PLS-DA分析和OPLS-DA分析為主。在對(duì)代謝物進(jìn)行分析時(shí)也要參照相關(guān)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，但就目前代謝組學(xué)相關(guān)研究數(shù)據(jù)來(lái)看，代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)仍不完善，因此需要更多的科研工作者共同努力構(gòu)建完整的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 代謝組學(xué)在黑曲霉領(lǐng)域的研究進(jìn)展

近年來(lái)黑曲霉的代謝研究有顯著的發(fā)展，結(jié)合基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)代謝組學(xué)有了進(jìn)一步的了解。在工業(yè)微生物領(lǐng)域，對(duì)于代謝組學(xué)的研究主要集中在酵母菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌等微生物上。近期對(duì)黑曲霉代謝組學(xué)的研究報(bào)道較多，由于黑曲霉有豐富的代謝產(chǎn)物，目前基因簇所發(fā)現(xiàn)的化合物仍然有限，因此對(duì)黑曲霉代謝產(chǎn)物組的研究可從中發(fā)現(xiàn)新的代謝化合物，并能提高對(duì)代謝組學(xué)的認(rèn)識(shí)。

2.1 黑曲霉代謝組學(xué)研究

在黑曲霉FGSC A1279次級(jí)代謝調(diào)控研究試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)突變黑曲霉菌株進(jìn)行代謝物的提取與檢測(cè)。選取全局性調(diào)控因子lae A缺失及過(guò)量表達(dá)菌株為研究對(duì)象，以硅膠柱色譜、正反相薄層板、葡聚糖凝膠柱SephadexLH-20和液相等色譜方法對(duì)黑曲霉（A.niger）lae A過(guò)表達(dá)菌株的乙酸乙酯萃取物進(jìn)行分離，從中分離得到4種化合物。采用核磁共振譜、紅外光譜、質(zhì)譜等譜學(xué)手段確定了羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸以及鄰苯二甲酸二異丁酯3種化合物的結(jié)構(gòu)，除此之外還有一種化合物的結(jié)構(gòu)待定。對(duì)所得到的化合物相關(guān)合成途徑進(jìn)行了初步分析，為進(jìn)一步研究黑曲霉次級(jí)代謝基因簇的調(diào)控提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

此外基于13C代謝流和基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型的黑曲霉產(chǎn)糖化酶代謝調(diào)控機(jī)理研究，采用同位素稀釋法（IDMS）的代謝物組學(xué)和13C代謝流關(guān)聯(lián)分析技術(shù)研究了黑曲霉高產(chǎn)菌A.niger DS 03043和模式菌A.niger CBS 513.88的代謝差異及調(diào)控機(jī)制。發(fā)現(xiàn)黑曲霉高產(chǎn)菌A.niger DS 03043有相對(duì)較高的生長(zhǎng)速率，產(chǎn)酶速率和糖耗速率以及較低的草酸和檸檬酸分泌速率。原因在于與野生型模式菌A.niger CBS 513.88相比，高產(chǎn)菌中胞內(nèi)代謝流分布出現(xiàn)調(diào)整即更多的碳源流向了PP途徑而其三羧酸循環(huán)（TCA）途徑通量相對(duì)較低，從而使得糖化酶的產(chǎn)量得到提高。這一研究結(jié)果表明，黑曲霉中能量和還原力代謝在細(xì)胞主要代謝途徑通量分布調(diào)控中起著重要的作用。

在黑曲霉高產(chǎn)檸檬酸機(jī)制及代謝調(diào)控研究中，為進(jìn)一步對(duì)黑曲霉產(chǎn)檸檬酸菌株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立，運(yùn)用基因組學(xué)代謝組學(xué)相結(jié)合完成試驗(yàn)。在對(duì)胞外代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量分析時(shí)，采用HPLC技術(shù)檢測(cè)胞外代謝產(chǎn)物。樣品經(jīng)13 000 r/min離心5 min收集上清液，并用孔徑0.45 μm濾膜過(guò)濾，-20℃凍存。利用Amethyst C18-H色譜柱（Sepax technoligies，Inc.），以0.01%H3PO4為流動(dòng)相，流速0.8 mL/min，溫度30℃，利用紫外檢測(cè)器在210 nm處進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)任一酶過(guò)量均會(huì)造成細(xì)胞的損傷使胞外代謝產(chǎn)物增加。

2.2 鏈霉菌代謝組學(xué)研究

相比于黑曲霉代謝組學(xué)研究，鏈霉菌的代謝組學(xué)研究正逐漸走向成熟。在對(duì)灰色鏈霉菌JSD-1發(fā)酵工藝及代謝產(chǎn)物研究中，運(yùn)用GC/TOFMS（Leco Corp.,St.Joseph，MI）對(duì)處理后的樣品進(jìn)行測(cè)試，檢測(cè)到JSD-1菌體生長(zhǎng)代謝1 000多個(gè)分離峰，然后利用SIMCA軟件進(jìn)行PCA和OPLS分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)JSD-1生長(zhǎng)代謝中轉(zhuǎn)化氨基酸的能力最強(qiáng)，這些前體物質(zhì)一部分通過(guò)轉(zhuǎn)化成TCA循環(huán)的中間物質(zhì)參與到菌體TCA循環(huán)中，一部分作為氮源直接被菌體吸收利用促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)繁殖。

此外對(duì)于天藍(lán)色鏈霉菌代謝物組測(cè)定方法優(yōu)化及其代謝特征中提到，以天藍(lán)色鏈霉菌為研究對(duì)象，對(duì)其代謝物組樣品制備方法進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，并利用GC-MS分析平臺(tái)分析了該菌株的主要代謝特征。經(jīng)檢測(cè)結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑（PPP）和三羧酸循環(huán)（TCA）在對(duì)數(shù)期有較高的代謝強(qiáng)度。在對(duì)鏈霉菌代謝組學(xué)研究的技術(shù)方法了解后，能夠更有效地為黑曲霉代謝組學(xué)研究提供可靠的技術(shù)參考。

2.3 黑曲霉代謝組學(xué)研究技術(shù)進(jìn)展

在Francisca Lameiras等人的研究下，開(kāi)發(fā)一種恒化器，用于常規(guī)渦輪攪拌生物反應(yīng)器中進(jìn)行黑曲霉均勻穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)和絲狀真菌的快速取樣，并且進(jìn)行冷甲醇淬滅結(jié)合冷過(guò)濾的系統(tǒng)研究，使這種方法運(yùn)用于代謝組學(xué)研究中。采用恒化器培養(yǎng)的黑曲霉生長(zhǎng)均勻且菌絲不會(huì)出現(xiàn)附著培養(yǎng)器壁生長(zhǎng)的現(xiàn)象。運(yùn)用這種快速采樣裝置和高效的冷甲醇淬滅方法，同時(shí)結(jié)合快速冷卻過(guò)濾、快速采樣、收集和洗滌菌絲體，從而實(shí)現(xiàn)精確的定量代謝組學(xué)研究。研究發(fā)現(xiàn)在-20℃下，40%甲醇水溶液混合物能實(shí)現(xiàn)最小的代謝物泄漏?？傊ㄟ^(guò)這項(xiàng)技術(shù)能為進(jìn)一步研究代謝組學(xué)和代謝物運(yùn)輸研究作出貢獻(xiàn)。

3 問(wèn)題與展望

目前，代謝組學(xué)日益成為科研工作者關(guān)注的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者也逐漸對(duì)代謝組學(xué)的研究加以重視，然而代謝組學(xué)還面臨著許多問(wèn)題有待于解決。①缺乏建立標(biāo)準(zhǔn)的滅活和代謝物提取方法，以及對(duì)滅活過(guò)程中引起的胞內(nèi)代謝物泄漏問(wèn)題的評(píng)價(jià)與分析方法。②在代謝物的檢測(cè)技術(shù)方面仍有缺陷，新的多維分離技術(shù)如二級(jí)氣相色譜分析時(shí)間譜的檢測(cè)范圍更為廣泛，但由于此方法檢測(cè)過(guò)程中的費(fèi)用昂貴沒(méi)得到大規(guī)模的推廣；氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）使用時(shí)，需要對(duì)有較強(qiáng)揮發(fā)性的代謝產(chǎn)物進(jìn)行衍生化預(yù)處理，此過(guò)程消耗的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)且容易引起樣品發(fā)生一些化學(xué)變化。代謝產(chǎn)物分析平臺(tái)的缺乏，由于代謝產(chǎn)物的理化性質(zhì)復(fù)雜，對(duì)分析平臺(tái)的要求十分嚴(yán)格，目前還沒(méi)有一個(gè)很好的分析平臺(tái)能夠完成。③隨著代謝組學(xué)的發(fā)展，對(duì)于代謝組學(xué)研究的數(shù)據(jù)庫(kù)并沒(méi)有得到很好的完善，包括代謝輪廓、代謝標(biāo)志物等信息的缺乏。這些問(wèn)題使得代謝組學(xué)的發(fā)展受到限制。同樣對(duì)黑曲霉代謝組學(xué)的研究，仍處于發(fā)展階段，在對(duì)黑曲霉復(fù)雜多樣的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離、分析檢測(cè)方面仍存在技術(shù)缺陷，目前還沒(méi)能找到更為理想的技術(shù)方法，并且代謝組學(xué)研究數(shù)據(jù)庫(kù)有待于進(jìn)一步完善。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相信代謝組學(xué)技術(shù)也將會(huì)逐漸得到完善，黑曲霉代謝組學(xué)研究也將取得巨大的進(jìn)步。代謝組學(xué)未來(lái)將開(kāi)發(fā)出更靈敏、更廣譜、更通用的檢測(cè)方法，對(duì)各譜峰所對(duì)應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，進(jìn)而有助于全面闡釋細(xì)胞內(nèi)部的工作機(jī)理；代謝組學(xué)與其他系統(tǒng)生物學(xué)組學(xué)技術(shù)緊密結(jié)合?；蚺c蛋白質(zhì)的表達(dá)相聯(lián)系，而代謝組學(xué)能夠更好地反應(yīng)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境等外界因素的響應(yīng)，通過(guò)與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合進(jìn)一步弄清楚生物機(jī)體的工作原理和相互之間的聯(lián)系。此外將代謝組學(xué)的研究運(yùn)用在黑曲霉這類真菌上，能夠使復(fù)雜的代謝產(chǎn)物清晰的構(gòu)建出其代謝網(wǎng)絡(luò)圖譜，并且能全面深入地揭示黑曲霉機(jī)體自身的調(diào)控能力，為今后黑曲霉的研究與利用提供更為可靠的數(shù)據(jù)。

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