發(fā)酵溫度與pH兩段式組合策略對(duì)α-溶血性鏈球菌生物量和甘露聚糖肽的影響

許翠 (廣州萬(wàn)孚生物科技有限公司，廣東 廣州 510530)

楊曉茹，夏帆 (長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

徐洪宣，董平 (湖北欣愷生物科技有限公司，湖北 荊州 434020)

高夢(mèng)祥 (長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

發(fā)酵溫度與pH兩段式組合策略對(duì)α-溶血性鏈球菌生物量和甘露聚糖肽的影響

許翠
(廣州萬(wàn)孚生物科技有限公司，廣東 廣州 510530)

楊曉茹，夏帆
(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

徐洪宣，董平
(湖北欣愷生物科技有限公司，湖北 荊州 434020)

高夢(mèng)祥
(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

溫度和pH是影響微生物生長(zhǎng)代謝的重要因素。以α-溶血性鏈球菌(α-hemolyticStreptococci)為發(fā)酵菌種，在5L發(fā)酵罐中，采用調(diào)整發(fā)酵溫度與pH兩段式組合策略，即0～8h控制pH 7.5，8h后將pH調(diào)至7.0；0～11h控制溫度37℃，11h后將溫度調(diào)至33℃，以探討發(fā)酵溫度與pH兩段式組合策略對(duì)α-溶血性鏈球菌生長(zhǎng)及甘露聚糖肽產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明:采用這一策略，α-溶血性鏈球菌最大生物量為15.344g/L，比恒定發(fā)酵溫度37℃和pH 7.5控制模式下提高了11.2%，比單獨(dú)調(diào)控發(fā)酵溫度條件下提高了33.8%；甘露聚糖肽的最大產(chǎn)量為1.305g/L，比發(fā)酵溫度恒37℃和恒pH 7.5控制模式下提高了35.9%，比單獨(dú)調(diào)控發(fā)酵溫度條件下提高了17.2%。

α-溶血性鏈球菌(α-hemolyticStreptococci)；甘露聚糖肽；發(fā)酵溫度；發(fā)酵pH；組合策略

發(fā)酵溫度和pH是影響微生物繁殖和代謝最重要的2個(gè)因素，主要包括對(duì)其生物活性的影響、微生物細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能力的改變以及改變環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可給性及有害物質(zhì)的毒性[1]。不同微生物只能在一定的溫度和pH范圍內(nèi)生長(zhǎng)和代謝[2]。分階段控制溫度和pH能很好地增強(qiáng)微生物發(fā)酵效率，使目標(biāo)代謝產(chǎn)物增加[1，2]。

α-溶血性鏈球菌(α-hemolyticStreptococcus)又稱甲型溶血性鏈球菌，它一方面能導(dǎo)致人體引發(fā)多種疾病，而另一方面，它經(jīng)深層發(fā)酵培養(yǎng)提煉精制可得到的一種具有多種生物活性的糖肽類物質(zhì)——甘露聚糖肽。甘露聚糖肽是我國(guó)獨(dú)立研制的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型免疫增強(qiáng)劑[2，3]。臨床證明，甘露聚糖肽作為治療腫瘤的輔助藥，能減輕放療、化療的毒副作用[4]，對(duì)再生障礙性貧血、血細(xì)胞減少癥[5]、感染過(guò)敏性關(guān)節(jié)炎[6]、多種口腔粘膜病[7]等非腫瘤疾患均有較好的療效；還可用于治療各種腫瘤，與化療、放療聯(lián)合治療肺癌、胃癌、腸癌、食道癌、乳腺癌、白血病等。同時(shí)，甘露聚糖肽還可以最大限度地激活畜禽機(jī)體免疫細(xì)胞和免疫器官，充分發(fā)揮機(jī)體免疫系統(tǒng)抗病機(jī)能，增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)各種環(huán)境的應(yīng)激機(jī)能，在提高生產(chǎn)性能的同時(shí)，還可有效降低抗生素使用頻率和劑量，減輕畜產(chǎn)品中獸藥殘留量，增強(qiáng)畜產(chǎn)食品安全性，對(duì)保證人類健康，環(huán)境保護(hù)和畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展都具有重要的意義[8]。

然而，目前α-溶血性鏈球菌經(jīng)深層發(fā)酵產(chǎn)生甘露聚糖肽的產(chǎn)率只有萬(wàn)分之六，提高產(chǎn)率成為該領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。目前通過(guò)優(yōu)化其培養(yǎng)基和發(fā)酵條件提高甘露聚糖肽產(chǎn)率的報(bào)道很有限[3，9]。利用發(fā)酵罐研究提高甘露聚糖肽產(chǎn)率的發(fā)酵組合控制策略鮮有報(bào)道。本研究在α-溶血性鏈球菌的發(fā)酵過(guò)程中，利用調(diào)控發(fā)酵溫度和pH，研究了兩階段組合發(fā)酵策略對(duì)該菌生長(zhǎng)及甘露聚糖肽產(chǎn)量的影響，旨在找到高產(chǎn)甘露聚糖肽的最優(yōu)條件，為甘露聚糖肽的大量生產(chǎn)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

菌種:α-溶血性鏈球菌由長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

主要設(shè)備:Biotech-5BGG-7000A型自動(dòng)發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備工程有限公司產(chǎn)品)；HVE-50型高壓蒸汽滅菌器(華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品)；HFsafe-1200型生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品)；TE124S型電子分析天平、PB-10型酸度計(jì)(均為賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品)；HYC-360型醫(yī)用冷藏箱(青島海爾特種電器有限公司產(chǎn)品)；THZ-312型臺(tái)式恒溫振蕩器(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品)；UV-3300PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品)；TL-18M型臺(tái)式告訴冷凍離心機(jī)(上海市離心機(jī)械研究所產(chǎn)品)。

無(wú)菌生理鹽水:稱取0.9g氯化鈉溶解于100mL蒸餾水中，轉(zhuǎn)入250mL的錐形瓶加塞封口后于立式壓力蒸汽滅菌器中121℃滅菌25min。滅菌后低溫保藏備用。

0.1mol/L的NaOH溶液:稱取0.4gNaOH溶解于100mL蒸餾水中，封好瓶口，低溫保藏備用。

試管液體培養(yǎng)基:葡萄糖0.5%，胰蛋白胨0.5%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%，牛肉膏0.5%，氯化鈉0.5%，pH 7.2。每支試管裝量l0mL，121℃滅菌25min。

搖瓶種子培養(yǎng)基:葡萄糖2.0%，蛋白胨1.0%，酵母膏1.0%，牛肉膏0.5%，氯化鈉1.0%，pH 7.5。每瓶裝6mL，121℃滅菌25min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨0.3%，酵母膏0.7%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5%，pH 7.2。121℃滅菌25min。

1.2 菌種預(yù)處理

菌種活化:將血平板中的菌種于超凈工作臺(tái)上接入試管液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)18～24h，經(jīng)無(wú)菌考查和形態(tài)學(xué)鑒定合格后再接入試管液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24h，反復(fù)2次。挑選生長(zhǎng)旺盛、活力強(qiáng)、形態(tài)特征等符合要求的菌種，將其在2～4℃冰箱中保存。

搖瓶種子的制備:將試管液體菌種按0.2%的接種量在無(wú)菌條件下接入搖瓶培養(yǎng)基中，靜置37℃，培養(yǎng)24h，備用。

1.3 試驗(yàn)方法

將長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)雜菌的搖瓶種子液按1%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過(guò)控制溫度、pH單因素變化及溫度、pH兩因素組合對(duì)菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。分別在發(fā)酵0、2、4、6、8、11、14、17、20、23、25、27、30、32h時(shí)測(cè)定生物量和代謝產(chǎn)物甘露聚糖肽的含量。

1)溫度兩階段轉(zhuǎn)換發(fā)酵 將搖瓶種子液按1%的接種量倒入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，控制溫度為37℃，pH為7.5，無(wú)菌空氣量以能翻動(dòng)培養(yǎng)液為宜，轉(zhuǎn)速為150r/min培養(yǎng)。在發(fā)酵11h時(shí)調(diào)節(jié)溫度為33℃，pH保持7.5不變。

2)pH兩階段轉(zhuǎn)換發(fā)酵 將搖瓶種子液按1%的接種量倒入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，控制溫度為37℃，pH為7.5，無(wú)菌空氣量以能翻動(dòng)培養(yǎng)液為宜，轉(zhuǎn)速為150r/min培養(yǎng)。在發(fā)酵8h時(shí)調(diào)節(jié)pH為7.0，溫度保持37℃不變。

3)溫度和pH兩因素組合發(fā)酵 將搖瓶種子液按1%的接種量倒入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，控制溫度為37℃，pH為7.5，無(wú)菌空氣量以能翻動(dòng)培養(yǎng)液為宜，轉(zhuǎn)速為150r/min培養(yǎng)。在發(fā)酵8h時(shí)調(diào)節(jié)pH為7.0，溫度37℃不變；發(fā)酵11h時(shí)調(diào)節(jié)溫度為33℃，pH保持7.0不變。

4)恒溫與恒pH發(fā)酵 將搖瓶種子液按1%的接種量倒入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，控制溫度為37℃，pH為7.5，無(wú)菌空氣量以能翻動(dòng)培養(yǎng)液為宜，轉(zhuǎn)速為150r/min培養(yǎng)。

1.4 試驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定方法1.4.1 菌體生物量的測(cè)定

生物量采用菌體干重法測(cè)定量。將各組發(fā)酵液取出后，在80℃的水浴鍋滅菌30min后，冷卻至室溫，并分裝在無(wú)菌離心管中，在8000r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min，此為一次離心；再將上清液倒去，用蒸餾水洗滌沉淀2～3次，同樣轉(zhuǎn)速下經(jīng)二次離心后，再次倒去上清液，洗滌后將沉淀即菌體放入105℃的烘箱中烘干至恒重，并用分析天平稱重并記錄數(shù)據(jù)，其與空管重量差值即為菌體干重。

1.4.2 甘露聚糖肽含量的測(cè)定

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取經(jīng)105℃恒重的D-甘露糖10mg，置100mL容量瓶中，加水使溶解至刻度，搖勻得100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。再分別精確量取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL置試管中，用水稀釋至2mL，各加3%苯酚溶液1.0mL，加入濃硫酸4.5mL，快速搖勻，待冷卻至適溫后在490nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，測(cè)定其光密度，以光密度為橫坐標(biāo)、甘露糖濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

2)發(fā)酵液中甘露聚糖肽含量的測(cè)定 精確量取20mL發(fā)酵液于離心管經(jīng)離心機(jī)10000r/min、4℃離心10min，去除菌體留取上清液；上清液中加入3倍體積量的無(wú)水乙醇，充分?jǐn)嚢桁o置后10000r/min、4℃離心10min，去除上清液即得到沉淀物；將所得沉淀物用10mL蒸餾水溶解，用15%的三氯乙酸調(diào)pH為1.5～3.5，充分?jǐn)嚢桁o置后10000r/min、4℃離心10min，去除雜質(zhì)即得到上清液；向去除雜質(zhì)的上清液中緩慢加入40mL的無(wú)水乙醇，充分?jǐn)嚢桁o置后10000r/min、4℃離心10min去除上清液即得到沉淀物；重復(fù)上述方法2次，得到的沉淀物為粗糖肽；將所得沉淀物用10mL蒸餾水充分?jǐn)嚢枞芙庀♂?。精確吸取不同時(shí)間離心后的糖液0.1mL，用無(wú)菌水稀釋至2mL，以無(wú)菌水作對(duì)照，各加3%苯酚溶液1.0mL，加入濃硫酸4.5mL，快速搖勻，待冷卻至適溫后在490nm處進(jìn)行比色，測(cè)定光密度，由回歸方程計(jì)算甘露聚糖肽含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露聚糖肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

圖1 甘露聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以甘露聚糖肽在490nm處的甘露聚糖濃度為橫坐標(biāo)，以光密度為縱坐標(biāo)作圖，得到線性回歸方程:y=0.0794x+0.0026，R2=0.9998，表明其擬合效果很好，因此該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于甘露聚糖肽含量的確定。

2.2 兩段式發(fā)酵溫度與pH轉(zhuǎn)換對(duì)生物量的影響

由圖2可知，在發(fā)酵過(guò)程中轉(zhuǎn)換pH，α-溶血性鏈球菌的生物量上升先變慢后加快，在發(fā)酵過(guò)程中轉(zhuǎn)換溫度對(duì)菌種生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。兩階段pH轉(zhuǎn)換，發(fā)酵8h將pH 7.5轉(zhuǎn)換為7.0后，生物量在11h時(shí)開(kāi)始加速增加，30h達(dá)到最大，為16.347g/L，至發(fā)酵結(jié)束仍無(wú)明顯衰退現(xiàn)象。兩階段溫度轉(zhuǎn)換，發(fā)酵11h后，菌體的生長(zhǎng)受到了抑制，生物量增加明顯減緩，一直處于較低水平，為11.465g/L，比恒溫與恒pH對(duì)照組的最大生物量13.805g/L降低了2.340g/L。而溫度與pH兩段式組合策略極大地促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng)，發(fā)酵8h轉(zhuǎn)換pH，生物量增加加快，在17h進(jìn)入穩(wěn)定期，在25h達(dá)到15.344g/L，比其他條件下的最大生物量平均多了1.472g/L，并且穩(wěn)定期相比更長(zhǎng)?？梢?jiàn)，兩階段溫度轉(zhuǎn)換對(duì)α-溶血性鏈球菌的生長(zhǎng)沒(méi)有促進(jìn)作用，兩階段pH轉(zhuǎn)換和發(fā)酵8h轉(zhuǎn)換pH、11h轉(zhuǎn)換溫度的組合策略才能明顯地促進(jìn)其生長(zhǎng)。

圖2 不同調(diào)控條件下的菌體生物量

圖3 不同調(diào)控條件下的菌體比生長(zhǎng)速率

圖4 不同調(diào)控條件下的甘露聚糖肽比合成速率

2.3 兩段式溫度與pH轉(zhuǎn)換對(duì)菌體比生長(zhǎng)速率及甘露聚糖肽比合成速率的影響

圖3和圖4反映了通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中溫度和pH進(jìn)行不同調(diào)控策略，對(duì)α-溶血性鏈球菌的比生長(zhǎng)速率及代謝產(chǎn)物甘露聚糖肽的比合成速率的影響。

從圖3可以看出，在發(fā)酵過(guò)程的前8h，因發(fā)酵條件都是37℃和pH 7.5，所以前8h菌體的比生長(zhǎng)速率的變化基本一致。8h后不同的轉(zhuǎn)換條件對(duì)菌體比生長(zhǎng)速率有不同的影響。兩階段pH轉(zhuǎn)換和溫度與pH兩段式組合策略實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵8h將pH 7.5轉(zhuǎn)換為7.0后，在8～20h菌體的比生長(zhǎng)速率均高于其他條件下的。而兩階段溫度轉(zhuǎn)換試驗(yàn)中，發(fā)酵11h將溫度37℃轉(zhuǎn)換為33℃后，對(duì)菌體的比生長(zhǎng)速率無(wú)明顯影響，其與恒溫與恒pH對(duì)照條件下的比生長(zhǎng)速率無(wú)明顯差異。所以，兩階段pH轉(zhuǎn)換和溫度與pH兩段式組合策略可以促進(jìn)發(fā)酵過(guò)程中甲型溶血性鏈球菌的比生長(zhǎng)速率，而兩階段溫度轉(zhuǎn)換對(duì)菌體的比生長(zhǎng)速率無(wú)明顯影響。

從圖4可以看出，在發(fā)酵過(guò)程的前8h，因發(fā)酵條件一樣，都是37℃和pH 7.5，所以前8h比合成速率變化基本無(wú)差異。8h后，不同的轉(zhuǎn)換條件對(duì)甘露聚糖肽的影響不同。兩階段pH轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)中，8h時(shí)轉(zhuǎn)換pH 7.5至7.0后，甘露聚糖肽的比合成速率與恒溫與恒pH組無(wú)明顯差異。兩階段溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)中，甘露聚糖肽的比合成速率在8～17h均高于相同時(shí)間段的其他條件下的比合成速率，在發(fā)酵14h時(shí)達(dá)到最大值0.170h-1。溫度與pH兩段式組合策略實(shí)驗(yàn)中，甘露聚糖肽的比合成速率在發(fā)酵前期處于較低水平，在發(fā)酵中后期有所提高，在17～27h比合成速率維持在較高水平，20h時(shí)甘露聚糖肽的比合成速率為0.082h-1，其他條件下的同時(shí)段的甘露聚糖肽的比合成速率平均僅為0.034h-1。整體來(lái)說(shuō)，兩段式pH轉(zhuǎn)換對(duì)甘露聚糖肽的比合成速率無(wú)明顯影響，兩段式溫度轉(zhuǎn)換在發(fā)酵中期會(huì)增加代謝產(chǎn)物甘露聚糖肽的比合成速率，溫度與pH兩段式組合策略在發(fā)酵后期能有效的提高代謝產(chǎn)物甘露聚糖肽的比合成速率。

2.4 兩段式溫度與pH轉(zhuǎn)換對(duì)甘露聚糖肽產(chǎn)量的影響

發(fā)酵溫度與pH單因素調(diào)整以及溫度與pH組合轉(zhuǎn)換策略對(duì)甘露聚糖肽產(chǎn)量的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可以看出，發(fā)酵8h轉(zhuǎn)換pH和發(fā)酵11h單獨(dú)轉(zhuǎn)換溫度甘露聚糖肽產(chǎn)量都有明顯的增加。兩階段pH轉(zhuǎn)換試驗(yàn)中，發(fā)酵8h將pH 7.5轉(zhuǎn)換至7.0后，代謝產(chǎn)物甘露聚糖肽的產(chǎn)量增加加快，在8～25h維持在較高水平，到14h后產(chǎn)量增加減慢，25h達(dá)到最大合成量1.278g/L。兩階段溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵11h將溫度37℃轉(zhuǎn)換為33℃后，甘露聚糖肽的產(chǎn)量增加同樣加快，在15～27h合成量處于較高水平，25h達(dá)到最大量1.114g/L。溫度與pH兩段式組合策略實(shí)驗(yàn)中，在8h轉(zhuǎn)換pH，11h轉(zhuǎn)換溫度后，11～17h過(guò)程中沒(méi)有明顯變化，等到17h后，甘露聚糖肽產(chǎn)量增加速度不斷加快，27h時(shí)達(dá)到最大值，為1.305g/L，分別比恒溫與恒pH和兩階段溫度轉(zhuǎn)換條件下的甘露聚糖肽最大值分別增加了35.9%、17.2%，與兩階段pH轉(zhuǎn)換條件沒(méi)有統(tǒng)計(jì)差異。以上結(jié)果表明，單獨(dú)調(diào)整溫度或pH都可以有效地提高甘露聚糖肽的產(chǎn)生，而溫度與pH的兩段式組合策略能更大限度地提高甘露聚糖肽的產(chǎn)量。

圖5 不同調(diào)控條件下的甘露聚糖肽合成量

3 結(jié)論

采用發(fā)酵8h將pH 7.5轉(zhuǎn)換至7.0，11h將溫度37℃轉(zhuǎn)換為33℃的溫度和pH兩段式組合策略可以有效地促進(jìn)α-溶血性鏈球菌的生長(zhǎng)并提高其代謝產(chǎn)物甘露聚糖肽的產(chǎn)量。最大生物量比恒定發(fā)酵溫度37℃和pH 7.5控制模式下提高了11.2%，比單獨(dú)調(diào)控發(fā)酵溫度條件下提高了33.8%；甘露聚糖肽的最大產(chǎn)量比發(fā)酵溫度恒37℃和恒pH 7.5控制模式下提高了35.9%，比單獨(dú)調(diào)控發(fā)酵溫度條件下提高了17.2%。

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[編輯] 余文斌

2016-10-31

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013CFB392)；湖北省重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目。

許翠(1988-)，女，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锎x及分子生物學(xué)。通信作者:高夢(mèng)祥，mxgao0398@163.com。

Q939.97

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1673-1409(2017)02-0046-06

[引著格式]許翠,楊曉茹，夏帆,等.發(fā)酵溫度與pH兩段式組合策略對(duì)α-溶血性鏈球菌生物量和甘露聚糖肽的影響[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2017，14(2)：46～51.