豬藍耳病診斷技術研究進展

陳 紅 方 英 徐春志 袁翠霞 景書灝

（貴陽市動物疫病預防控制中心，貴州貴陽 550000）

豬藍耳病診斷技術研究進展

陳 紅 方 英 徐春志 袁翠霞 景書灝

（貴陽市動物疫病預防控制中心，貴州貴陽 550000）

豬藍耳病又被成為豬繁殖與呼吸障礙綜合癥，這種疾病在臨床上能夠引發(fā)發(fā)燒、耳朵發(fā)紫以及伴有咳嗽的呼吸困難等癥，具有極高致死率的傳染性疾病，一旦發(fā)生，危害性極大，可能導致母豬的流產、繁殖障礙，大大增加了豬仔的死亡率。目前在豬藍耳病上，并沒有有效手段與藥物進行治療，所以能夠提前診斷，找到快速診斷的技術顯得非常的關鍵。本文對豬藍耳病病毒的分離鑒定，分子生物學等診斷方法的研究進展進行了綜述，為豬藍耳病的診斷和防控提供了一定理論依據(jù)。

豬藍耳病；病原學診斷；血清學診斷；分子生物學診斷

由病毒引起的豬藍耳病，會導致妊娠期母豬的早產、死胎、弱胎，導致豬的呼吸困難，不進食等問題，這種病毒被稱作豬繁殖與呼吸綜合征病毒。楊漢春認為我國目前流行的這種病毒屬于美洲型的毒株，湯德元將美洲型的毒株分為四種亞群，我國流行其中的三種，這三種病毒的傳播速度很快，在養(yǎng)豬密集、頻繁流轉的經濟發(fā)達國家，這種病毒更加危險。豬繁殖與呼吸綜合征病毒導致的病證較為復雜，包括病毒的繼發(fā)感染等臨床癥狀。在診斷時，應當借助實驗室的診斷技術幫助，從而為豬藍耳病提供診斷與防控的技術支持。

1 病毒的分離鑒定

病毒的分離鑒定，是一種比較切合實際的鑒定方法，能夠診斷PRRSV分離細胞，例如豬肺泡巨噬細胞、HS.2H克隆細胞等。對于用歐洲株來進行分離PRRSV，只可以利用PAM細胞進行。這種細胞來源于血清、脾臟、扁桃體、肺臟。在進行PRRSV分離中，我們可以快速的從急性感染的豬身上得到。PRRSV的分布也有所不同，死胎脾臟、淋巴巨噬細胞分布多存在于流產的情況，新生的豬多分布在肺臟之中。冷藏冷凍能夠在遠距離運輸中保證采集的樣品的活性，在進行特殊處理后，使其接種在單層PAMs細胞后，等待4d左右，就可以看到細胞病變。一開始病變細胞出現(xiàn)膨大、圓形，而后開始脫落、皺縮。接種在CL-2621細胞后，細胞病變變得遲緩很多，需要等待6d左右出現(xiàn)細胞的感染。接種在Marc-145細胞2d左右，則呈現(xiàn)激烈的細胞病變。在進行毒株的細胞病變實驗中，一些毒株不能夠為實驗帶來理想的實驗結果，不能出現(xiàn)明顯的細胞病變。而且，還應當加強對間接免疫熒光試驗、免疫過氧化物酶單層試驗方法的驗證。

2 血清學診斷方法

血清學試驗應用廣泛，是比較傳統(tǒng)的PRRSV診斷方法。血清學試驗方法可以有較為明顯的特異性，但是缺乏足夠的敏感度。

2.1 中和試驗

通過中和試驗，可以發(fā)現(xiàn)PRRSV抗體的特異性比較突出，但是敏感度不足，常常需要在等待將細胞感染后5周左右才能夠出現(xiàn)VN抗體，10周之后才可以達到最多。這主要是因為中和抗體出現(xiàn)的時間比較晚。與IPMA、IFA、ELISA等比較，可以發(fā)現(xiàn)中和試驗的敏感度較低，不能夠很好的運用到PRRSV感染的早期診斷之中。后人對這種情況進行了研究與改進，增加20%的豬的新鮮血清，從而提高了檢測的敏感程度，在10d左右的時間里得到了滴度較高的VN抗體。

2.2 間接熒光抗體試驗

間接熒光抗體試驗的特性與敏感度相似于免疫過氧物酶單層試驗，并廣泛應用在許多歐美發(fā)達國家之中。我國也在進行相應的IFA與微量IFA的試劑供應。這種試劑能夠檢測到受到PRRSV感染6d之后的豬的抗體。抗體在30到50d左右達到峰值，然后逐漸下降，最后再4到6個月逐漸消失。這種方法在細胞培養(yǎng)上比較困難，對環(huán)境和人員的水平提出了很大的要求，而且只能得到PRRSV分離株。

2.3 免疫過氧化物酶單層試驗

免疫過氧化物酶單層試驗在眾多PPRSV抗體檢測中出現(xiàn)的最早，廣泛應用在歐洲國家，其敏感度和特異性得到了普遍認可。該方法能夠在感染病毒6d后的豬身上檢測到PRRSV抗體，這種方法是根據(jù)PAMs、CI-2621、Marc-145等完成的，然而這種方法的結果不能夠自動顯示，需要人工觀察評判，其結果也容易受到背景著色的影響，出現(xiàn)偏差，而且還應具備較高的細胞培養(yǎng)環(huán)境與倒置顯微鏡的觀測，成本較高，難以進行大范圍的推廣。

3 PRRSV的分子生物學診斷

3.1 RT-PCR檢測

RT-PCR檢測在進行PRRSV的檢測中，以其較高的敏感度得到了廣泛的應用。其敏感度為pg水平。Suarez研究出了敏感度較高的RT-PCR方法，達到對隱性感染進行檢測的水平。趙耘等運用RT-PCR的診斷方法，能夠進行更加簡便的操作來增強檢測的敏感性。顧海洋等通過實驗發(fā)現(xiàn)并驗證了高致病性豬藍耳病在基因上的87bp的連續(xù)缺失，這對豬的高致病性藍耳病的預測檢驗方法提供了方向，建立了區(qū)別高致病性與低致病性豬藍耳病的一套方法。

3.2 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR技術源于美國20世紀90年代，能夠合理的添加熒光基團，通過熒光信號來監(jiān)測PCR過程，再根據(jù)標準曲線得到定量分析結果。這種方法能夠提高靈敏度、特異性、實時性，還可以實現(xiàn)DNA模版的定量化。當前世界先進領域例如分子生物學、醫(yī)學研究等各個領域都在使用這種技術。

[1]胡玲玲，湯德元，曾智勇，等.豬繁殖與呼吸綜合征診斷技術的研究進展[J].豬業(yè)科學，2017，34（6）：113-116.

[2]陳叢琳.豬藍耳病診斷方法研究進展[A].中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會全國會員代表大會暨第十五次學術研討會[C].2013：3.