基于質(zhì)譜的差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在植物逆境脅迫研究中的應(yīng)用

唐 穎,高步紅，楊世龍

(1.南京林業(yè)大學(xué)現(xiàn)代分析測試中心，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

基于質(zhì)譜的差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在植物逆境脅迫研究中的應(yīng)用

唐 穎1,2,高步紅1，楊世龍1,2

(1.南京林業(yè)大學(xué)現(xiàn)代分析測試中心，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)在林業(yè)學(xué)科中得到了極大的發(fā)展，差異蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為目前林業(yè)學(xué)科的研究熱點(diǎn)之一。通過對國內(nèi)外植物蛋白質(zhì)組學(xué)在林業(yè)學(xué)科逆境脅迫中的相關(guān)應(yīng)用文獻(xiàn)的整理總結(jié)，對蛋白質(zhì)組學(xué)在干旱脅迫、鹽脅迫和生物脅迫等方面研究的系統(tǒng)綜述，總結(jié)植物蛋白質(zhì)組學(xué)在林業(yè)學(xué)科逆境脅迫中應(yīng)用的研究現(xiàn)狀和研究進(jìn)展，并對蛋白質(zhì)組學(xué)在林業(yè)學(xué)科中的應(yīng)用作出展望。

蛋白質(zhì)組學(xué)；液質(zhì)聯(lián)用；逆境脅迫

蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，因此要深入了解生命的復(fù)雜活動(dòng)，就需要從蛋白質(zhì)的整體水平上進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)組學(xué)主要研究某一類型細(xì)胞、組織、體液中的所有蛋白質(zhì)組成、功能，以及蛋白質(zhì)之間的相互作用，是對蛋白質(zhì)翻譯和修飾水平等研究的一種補(bǔ)充，可以深入地揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)，從蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系與功能上回答生命過程的規(guī)律[1]，解釋遺傳和環(huán)境是如何通過相互作用控制細(xì)胞的功能[2]。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的具體過程包括蛋白質(zhì)樣品的制備、二維凝膠電泳分離、染色、成像分析，蛋白質(zhì)鑒定和定量，其研究的核心是蛋白質(zhì)的分離、鑒定和定量[3]。蛋白質(zhì)組學(xué)的科學(xué)研究取得蓬勃的發(fā)展，主要依賴于高通量分離、分析技術(shù)和定量技術(shù)的進(jìn)步。隨著生物質(zhì)譜、飛行時(shí)間質(zhì)譜、電噴霧質(zhì)譜等技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)在林業(yè)學(xué)科中也得到了極大的發(fā)展。目前，草本模式植物，如擬南芥、煙草、水稻等的生長發(fā)育、組織器官分化，以及激素和逆境調(diào)節(jié)機(jī)制的研究較為深入，而木本植物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究則主要集中于楊樹、松樹、云杉[4]等樹種，植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究已成為后基因組時(shí)代的熱點(diǎn)之一。

1 基于質(zhì)譜的差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

作為細(xì)胞功能的執(zhí)行者，多數(shù)蛋白質(zhì)都參與細(xì)胞功能的行使以及對環(huán)境刺激的反應(yīng)，當(dāng)細(xì)胞功能或所處的環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，細(xì)胞中相應(yīng)蛋白的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，以能動(dòng)應(yīng)對各種環(huán)境[5]，即生物體的蛋白質(zhì)組會(huì)隨著細(xì)胞類型的差別或所處環(huán)境的變化而變化。因此，當(dāng)生物體受到脅迫時(shí)，研究蛋白表達(dá)譜能實(shí)時(shí)反映植物細(xì)胞和組織在特定的時(shí)間和環(huán)境下所處的實(shí)際狀態(tài)[6]，因此探討植物基因和蛋白表達(dá)譜的變化也就成為植物響應(yīng)逆境脅迫機(jī)制研究中的重要內(nèi)容。由于蛋白質(zhì)較為復(fù)雜的識(shí)別、鑒定的原則，導(dǎo)致很難在短時(shí)間內(nèi)完成植物蛋白質(zhì)組學(xué)“完備的”數(shù)據(jù)庫，所以從不同應(yīng)激因子誘導(dǎo)對生物體內(nèi)蛋白質(zhì)造成的表達(dá)差異研究著手，鑒定特定因素下的蛋白質(zhì)組表達(dá)，即差異蛋白質(zhì)組學(xué)。

質(zhì)譜技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組研究中發(fā)展最快，也最具活力和潛力的技術(shù)。質(zhì)譜通過測量帶電離子質(zhì)荷比，從而得到所分析離子的分子量信息，具有迅速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，并能進(jìn)行蛋白序列分析和翻譯后修飾分析[7]。目前蛋白質(zhì)組學(xué)所使用的質(zhì)譜電離技術(shù)主要還是采用ESI和MALDI，兩種電離技術(shù)都是軟電離，ESI檢測的特點(diǎn)是生物大分子帶多個(gè)電荷，質(zhì)荷比范圍基本在2000Da以下區(qū)間，從而能檢測幾萬乃至更大的生物分子；而MALDI常得到單電荷峰，與飛行間(TOF)分析器搭配，檢測范圍可以到幾十萬道爾頓。

差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究在植物逆境差異蛋白組學(xué)中的研究過程，通常是從正常植物和對照植物中分別提取蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行蛋白的分離和鑒定。目前常用的研究方法主要可分為分別基于凝膠和非凝膠的兩條蛋白質(zhì)組學(xué)研究線路。基于凝膠的研究路線是指通過雙向凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，然后利用質(zhì)譜對分離后的蛋白質(zhì)逐一進(jìn)行鑒定。雙向電泳是根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的差異，進(jìn)行兩次電泳，第1次是等電聚焦，第2次是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，這樣在二維平面上會(huì)出現(xiàn)許多大小不等的點(diǎn)，而每一個(gè)點(diǎn)一般代表一種或一種以上蛋白質(zhì)。具有高分辨率的特點(diǎn)，通常能分辨出 1 000個(gè)～3 000個(gè)蛋白點(diǎn)，還可以對翻譯后修飾(如糖基化、磷酸化等)進(jìn)行分析。

基于非凝膠的研究線路是指借助液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定蛋白的新技術(shù)，大致可又分為標(biāo)記(Label-based)和非標(biāo)記(Label-free)定量技術(shù)[8]。其中，同位素親和標(biāo)簽(ICAT)技術(shù)是利用同位素親和標(biāo)簽試劑來預(yù)先選擇性地標(biāo)記某一類蛋白質(zhì)，經(jīng)分離純化后再用質(zhì)譜鑒定的技術(shù)，它能夠直接定性和定量低豐度蛋白。同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)則是利用4種～8種活性試劑對酶解肽段進(jìn)行標(biāo)記，然后結(jié)合色譜-質(zhì)譜進(jìn)行蛋白鑒定的技術(shù)。無標(biāo)記定量(Label-free)則是直接利用樣品酶切后經(jīng)質(zhì)譜產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，根據(jù)鑒定蛋白的肽段數(shù)或質(zhì)譜峰強(qiáng)度進(jìn)行蛋白定量的方法。

2 逆境脅迫應(yīng)答機(jī)制的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究

植物適應(yīng)脅迫的各個(gè)階段所發(fā)生的生理代謝水平改變，均能體現(xiàn)在其蛋白質(zhì)組構(gòu)成中[9]，高通量的植物逆境蛋白質(zhì)組學(xué)研究不但能揭示逆境脅迫相關(guān)代謝應(yīng)答機(jī)制，而且還能反映不同脅迫因子作用的特異性，因此，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究備受人們關(guān)注。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)在植物響應(yīng)逆境脅迫方面的研究取得許多成果，為深入研究植物對非生物脅迫的響應(yīng)機(jī)制提供了重要信息。

植物在生長發(fā)育過程中會(huì)遭遇干旱、水澇和高鹽等非生物脅迫，以及病原菌侵染和蟲害等生物脅迫，植物感受逆境信號后，可以通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗逆相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而調(diào)整自身的生理狀態(tài)或形態(tài)來提高對逆境的耐受能力[10]。在蛋白水平對發(fā)生變化的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量測定，探討植物在逆境脅迫條件下的調(diào)控機(jī)制，是研究植物抗逆性的重要手段之一。

2.1 干旱脅迫

我國干旱半干旱地區(qū)占國土面積的45%，林木抗旱性的強(qiáng)弱往往成為限制林木正常生長成林的重要因素[11]。嚴(yán)重的土壤水分虧缺會(huì)對林木產(chǎn)生傷害，使葉片細(xì)胞失去膨壓，并產(chǎn)生萎蔫現(xiàn)象。研究表明，干旱脅迫下林木會(huì)在形態(tài)特征，生理生化，細(xì)胞代謝等方面發(fā)生變化以適應(yīng)不利環(huán)境，目前研究較多的是滲透調(diào)節(jié)，光合作用，氧化應(yīng)激反應(yīng)以及誘導(dǎo)抗旱相關(guān)蛋白質(zhì)的合成[12]。如干旱脅迫信號可以通過激活位于細(xì)胞質(zhì)膜上的鈣離子通道，產(chǎn)生胞質(zhì)內(nèi)特異性的鈣信號，傳遞至鈣信號感受蛋白，如鈣調(diào)素、鈣依賴蛋白激酶和類鈣調(diào)磷酸酶B蛋白等，進(jìn)而引起胞內(nèi)一系列生理生化變化，最終對脅迫做出響應(yīng)[13]。

郭偉志[14]利用雙向電泳技術(shù)，對干旱脅迫下不同杉木無性系差異蛋白組分析，并運(yùn)用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定及Mascot蛋白數(shù)據(jù)庫檢索后，獲得5個(gè)已知功能的蛋白：與光合作用的光反應(yīng)和碳反應(yīng)相關(guān)的捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶；與滲透保護(hù)物質(zhì)合成有關(guān)的肌醇-1-磷酸合成酶；與物質(zhì)代謝有關(guān)顆粒結(jié)合型淀粉合成酶Ⅰ；與抗氧化作用密切相關(guān)過氧化物酶。在干旱脅迫下，這些差異表達(dá)的蛋白之間可能形成了信號傳遞系統(tǒng)和互作體系，調(diào)節(jié)杉木細(xì)胞的光合作用、細(xì)胞膜透性、物質(zhì)代謝、抗氧化代謝等過程。

韓莎[15]通過對桑樹在干旱脅迫下的差異表達(dá)蛋白質(zhì)的研究，鑒定出35個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，分別參與逆境防御過程，碳水化合物代謝，蛋白質(zhì)代謝和光合作用4個(gè)過程。如磷酸甘油激酶參與糖酵解過程，催化1,3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油酸。結(jié)果中磷酸甘油激酶的表達(dá)上升，說明桑樹通過分解利用碳水化合物來抵制干旱脅迫。

蛋白組學(xué)研究也被應(yīng)用于耐旱品種機(jī)制研究，祁建民等[16]以鑒定出的耐旱性紅麻品種為材料，在5葉期設(shè)置正常供水與控水比較試驗(yàn)，運(yùn)用雙向電泳分析紅麻在干旱脅迫和正常供水條件下葉片蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)變化。在干旱脅迫下出現(xiàn)65個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，選擇表達(dá)量明顯上調(diào)的9個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，通過質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出6個(gè)差異表達(dá)蛋白。紅麻GA42表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐旱性，與上述6個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)明顯上調(diào)有關(guān)。

2.2 鹽脅迫

土壤鹽分過多是影響植物生長發(fā)育、導(dǎo)致農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的主要因素之一。土壤中過多的鹽分和因此產(chǎn)生的高離子濃度農(nóng)業(yè)用水均會(huì)影響植物正常的代謝和生長發(fā)育[17]，植物對鹽脅迫的生理反應(yīng)表現(xiàn)為組織和器官的分化生長均受到抑制，發(fā)育緩慢等。目前，對植物鹽脅迫誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究主要有鹽過敏感信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、鈣依賴型蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)途徑、脫落酸信號通路、磷脂信號通路和絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)途徑等[18],[19],[20]。各種脅迫誘導(dǎo)信號彼此交叉，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)控植物的耐鹽生理響應(yīng)。已經(jīng)鑒定出的與鹽脅迫相關(guān)的差異蛋白的功能，主要與光合作用、呼吸作用、蛋白合成、離子轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)，最常見的有核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶、熱休克蛋白、鐵蛋白、真核翻譯起始因子、ATP 結(jié)合蛋白、超氧化物歧化酶等[21]。

王秀麗[22]通過對照組和鹽脅迫處理的銀葉樹幼苗葉片的蛋白斑點(diǎn)比較，鑒定出3個(gè)表達(dá)差異蛋白：同源異黃酮還原酶、光系統(tǒng)Ⅱ捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白和Cu,Zn-SOD。綠色植物可通過捕光葉綠素結(jié)合蛋白接受太陽能并同化CO2，說明銀葉樹幼苗通過提高光合作用能力來提高其對鹽脅迫的適應(yīng)性。銀葉樹幼苗體內(nèi)增加合成Cu，Zn-SOD，來清除植物體內(nèi)由于鹽脅迫而積累的過多的氧自由基，以提高其對鹽脅迫的適應(yīng)能力。

青楊是評估對鹽脅迫的響應(yīng)的常用樹種，ZHU J K等[23]確定了38個(gè)蛋白響應(yīng)輕度和重度(NaCl)鹽脅迫。16 個(gè)蛋白受鹽脅迫誘導(dǎo)，在重度鹽脅迫下有3個(gè)受誘導(dǎo)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，信使RNA加工和細(xì)胞周期調(diào)控的蛋白質(zhì)也包括其中。

丁鵬[24]對鹽脅迫處理后的綠竹，運(yùn)用質(zhì)譜鑒定技術(shù)對挑選的高表達(dá)鹽脅迫響應(yīng)蛋白進(jìn)行鑒定，分析得出15種蛋白，其中11種為己知功能蛋白，在其中含有熱休克蛋白、DNA修復(fù)酶、DNA引發(fā)酶、tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)酶、糖酵解酶、ATP合成酶、電化學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、翻譯修飾蛋白、轉(zhuǎn)錄后修飾蛋白、基因調(diào)控有關(guān)蛋白和一些假定蛋白，主要具有參與DNA合成與修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、無機(jī)態(tài)碳的固定、mRNA和蛋白翻譯加工以及調(diào)控生物膜內(nèi)能量物質(zhì)合成與水解等生物學(xué)功能。

2.3 生物脅迫

以往關(guān)于模式植物抗病分子機(jī)制研究表明，植物寄主應(yīng)答病原菌脅迫時(shí)，寄主細(xì)胞自身免疫受體(抗病蛋白)能夠識(shí)別病原菌效應(yīng)因子，進(jìn)而誘發(fā)寄主細(xì)胞自身抗病反應(yīng)，植株體內(nèi)的蛋白質(zhì)在種類和表達(dá)量上發(fā)生巨大的變化，從而實(shí)現(xiàn)對病原菌脅迫信號的響應(yīng)、傳遞以及生物學(xué)防御[25],[26]。在真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等不同生物逆境脅迫下，多種不同植物體內(nèi)出現(xiàn)了幾類應(yīng)答頻率極高的共性誘導(dǎo)蛋白[27]。PR蛋白家族目前研究較多的一類蛋白，其是植物受病原物侵染或非生物因子刺激后產(chǎn)生的一類水溶性蛋白，可能是通過攻擊病原物，降解細(xì)胞壁大分子和病原物毒素，從而達(dá)到抑制病毒外殼蛋白與植物受體分子結(jié)合的目的。熱激蛋白最初是細(xì)胞在高溫刺激下發(fā)現(xiàn)的一類蛋白質(zhì)，逆境脅迫會(huì)改變生物的膜結(jié)構(gòu)[28]，影響膜的通透性和流動(dòng)性；而熱激蛋白作為一種分子伴侶，在逆境脅迫發(fā)生時(shí)，不但能保護(hù)蛋白結(jié)構(gòu)，而且能穩(wěn)定膜的穩(wěn)定性。過氧化物酶在植物對病原菌防衛(wèi)反應(yīng)中的詳細(xì)作用機(jī)制目前還不是非常清楚，目前研究認(rèn)為過氧化物酶可能是通過提高了植物細(xì)胞壁的韌性，從而提高了抵御病菌的強(qiáng)度，達(dá)到了抗擊病害的目的。

由歐文氏細(xì)菌侵染而引發(fā)的火疫病，是蘋果及其他薔薇科植物的毀滅性病害。關(guān)于蘋果屬植物寄主與火疫病致病菌互作方面的研究，主要集中于病原菌致病機(jī)理，尤其是互作過程中效應(yīng)蛋白的分泌及其轉(zhuǎn)運(yùn)途徑研究[29]。張彩霞[30]等以蘋果葉片與斑點(diǎn)落葉病菌為研究對象，提取總蛋白后雙向電泳分離，質(zhì)譜測定搜庫鑒定出5個(gè)下調(diào)蛋白和15個(gè)上調(diào)蛋白，經(jīng)功能分析將其參與的相關(guān)功能分為5類，分別為過敏原蛋白、防御反應(yīng)、光合作用、能量代謝相關(guān)蛋白，以及參與蛋白合成的蛋白。SAMS是植物細(xì)胞應(yīng)答逆境脅迫的關(guān)鍵蛋白，SAMS3和SAMS1均明顯下調(diào)表達(dá)，植物清除ROS的關(guān)鍵酶APX和GPX均屬病程相關(guān)蛋白，發(fā)生明顯上調(diào)。而蛋白Mal d1下調(diào)表達(dá)至消失，表明該蛋白也參與蘋果葉片應(yīng)答病原菌侵染的防御反應(yīng)，通過下調(diào)表達(dá)，降低病原菌對寄主的傷害程度。

Maserti等[31]以柑橘屬的果樹為材料，對二斑葉螨侵染后和茉莉酸甲酯處理后的葉片進(jìn)行了蛋白表達(dá)差異分析，分別檢測出了110個(gè)和67個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。應(yīng)用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定出50個(gè)蛋白，大部分都屬于光合和代謝相關(guān)蛋白。其中有5個(gè)與氧脅迫相關(guān)的酶，包括磷脂谷胱甘肽過氧化物酶、1個(gè)鹽脅迫相關(guān)蛋白、抗壞血酸過氧化物酶和錳超氧化物歧化酶。有7個(gè)防御相關(guān)蛋白，包括與發(fā)病相關(guān)的酸性幾丁質(zhì)酶、蛋白酶抑制劑類奇蛋白和低密度脂蛋白等。

桉樹是聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的速生豐產(chǎn)多用途樹種。陳全助[32]在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，運(yùn)用iTRAQ技術(shù)對經(jīng)焦枯病菌誘導(dǎo)尾細(xì)桉M1葉片差異蛋白組進(jìn)行研究，焦枯病菌接種后12 h，尾細(xì)桉葉片的差異基因及差異蛋白均顯著富集于苯丙烷類代謝，類黃酮生物合成，亞麻酸代謝及代謝途徑，而24h的差異基因和蛋白則顯著富集在亞麻酸代謝，次生代謝物質(zhì)合成，萜類化合物生物合成，半乳糖代謝，外芪類化合物、二芳基庚醇及姜辣素生物合成，類黃酮生物合成以及代謝途徑，這些代謝途徑均直接或間接地參與了植物的抗病反應(yīng)。

綜上所述，作為后基因時(shí)代的一個(gè)重要研究手段，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)在植物研究中廣泛開展，并獲得了豐碩的成果，是對傳統(tǒng)植物生理學(xué)及功能基因組學(xué)研究的補(bǔ)充。然而，植物的生理過程是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，人們對植物復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)都還知之甚少，在這方面的研究還處于初步階段。隨著越來越多植物全基因組測序的完成、EST數(shù)據(jù)庫的日益豐富，以及研究手段的不斷改進(jìn)，相信將會(huì)有更多相關(guān)的基因和蛋白被挖掘，更全面地揭示植物生長、發(fā)育、抗逆的本質(zhì)，為植物品種的選擇和培育奠定基礎(chǔ)。

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ApplicationofDifferentialProteomicsBasedonMassSpectrometryintheStudyofPlantStress

TANG Ying1,2GAO Bu-hong1YANG Shi-long1,2

(1.Advanced Analysis and Testing Center，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China；2.Co-Innovation Center for the Sustainable Forestry in Southern China， Nanjing Forestry University，Nanjing 210037， China)

With the development of mass spectrometry，plant proteomics had become one of the highlights techniques in agro-scientific research in the forestry science at present.This paper reviewed current progress of plant adversity stress proteomics，and summarized the commonly used proteomic methods in drought stress,salt stres and biotic stress.The research progress of proteomics in forestry discipline development trends and application prospects were discussed，and the developing orientation for further research was presented.

Protemics，LC/MS，Adversity stress

2017-07-11

唐 穎(1983-)，女，博士生，主要從事植物資源化學(xué)成分和生物活性研究工作。E-mail:tying07@ sina.com

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.05.006

Q946.1

A

1003-5508(2017)05-0028-05