基于TOF MS-IDA-MS/MS分析穿山甲炮制前后的成分變化

袁娟娟,劉 遜

1.江蘇省昆山市中醫(yī)醫(yī)院(昆山215300)，2.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術學院(蘇州 215009)

·方藥縱橫·

基于TOF MS-IDA-MS/MS分析穿山甲炮制前后的成分變化

袁娟娟1,劉 遜2△

1.江蘇省昆山市中醫(yī)醫(yī)院(昆山215300)，2.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術學院(蘇州 215009)

目的：探討穿山甲炮制增效的機理。方法：采用TOF MS-IDA-MS/MS對穿山甲炮制前后成分變化進行研究，Waters C18色譜柱(2.1 mm × 150 mm，1.7 μm)；柱溫40 ℃。流動相為0 min，乙腈-水(5∶95)，30min乙腈-水(95∶5)；體積流量0.4 ml/min。質譜定性采用電噴霧離子源(ESI)的飛行時間質譜，負離子模式下采集數(shù)據(jù)，利用Markerview分析軟件對化合物進行篩選，通過精確相對分子質量和二級質譜裂解碎片鑒定監(jiān)測到的化學成分。結果：經過PCA分析，可以很好地區(qū)分穿山甲炮制前后成分的變化，穿山甲經炮制后，新增絲-酪環(huán)二肽及苯丙-脯環(huán)二肽等四種成分。結論：穿山甲經高溫炮制后環(huán)二肽等親水性成分含量顯著增加。

穿山甲為鯪鯉科動物穿山甲(Manispentadactyla)的鱗甲，性咸，微寒，具有通經下乳，消腫排膿，搜風通絡的作用[1]。穿山甲對諸多急慢性疾病均有良好療效，例如不孕癥、月經不調、產婦乳汁不下、乳腺疾病婦科疾病等；夜啼、厭食癥等兒科疾??；血管神經性頭痛、震顫麻痹、心絞痛、高脂血癥、白細胞減少癥、泌尿系及膽道結石、血栓性靜脈炎、前列腺增生癥等其他疾病。在中藥傳統(tǒng)方劑和古代醫(yī)書中穿山甲起主治療效的方劑多達489個[2]。穿山甲主要含有硬脂酸、膽固醇、二十三酸丁胺、脂肪族酰胺等脂溶性成分以及蛋白質類大分子成分，而且穿山甲鱗片的蛋白質是是由α角蛋白和β角蛋白兩種結構組成。主要成分是β角蛋白，以及部分α角蛋白[3]。前期對穿山甲炮制的研究主要集中在傳統(tǒng)工藝改良上，如對穿山甲大小分檔，炮制輔料和砂燙溫度，時間的研究[4]，或是將傳統(tǒng)砂燙工藝改良為微波炮制，膨化炮制及烘法炮制[5]。目前，國內學者針對于炮制前后穿山甲成分變化的研究多是紅外[6]，X衍射譜圖的變化[7]，炮制前后氨基酸含量的變化[8]，肽類譜圖的變化[9]，較少涉及到炮制前后短肽類成分的變化[10]，穿山甲在炮制過程中成分有沒有發(fā)生變化，有哪些成分發(fā)生變化，是本實驗的研究重點，所以本文擬對穿山甲的生品和炮制品，利用TOF MS-IDA-MS /MS分析其炮制前后具體化學成分的變化[11]，為穿山甲炮制增效的研究提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

1 材 料 本實驗所用材料中國穿山甲(Manis pentadactyla) 藥材樣品1份，來源于蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術學院館藏標本，炮制品為同批藥材經作者砂燙加工，樣品均由作者鑒定，憑證樣品保存于蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術學院標本館。

2 方 法

2.1 色譜條件：Waters C18色譜柱(2．1 mm × 150 mm，1．7 μm)；柱溫40 ℃；流動相為0 min，乙腈-水(5：95)，30 min乙腈-水(95：5)；體積流量為0．4 ml/min。

2.2 質譜條件：采用TOF MS-IDA-MS /MS模式；負離子檢測模式；電噴霧離子源(ESI)；離子源溫度 (TEM)550℃；霧化器電壓(GS1)55 psi；輔助加熱器電壓(GS2)55 psi；氣簾氣(Curtain Gas) 36 psi；噴霧電壓(IS)-4500 eV；去簇電壓(DP)-100 eV；碰撞電壓(CE) -40 eV；碰撞電壓差15 eV；掃描范圍控制在m/z 50-800。

2.3 供試品溶液的配制：取本品藥材粗粉0．2 g，精密稱定，置10 ml容量瓶中，加入50 %甲醇，并定容至10 ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)60 min，取出，放冷，用50 %甲醇補足減失重量，搖勻。取適量，離心(12000 r/min，5 min)，取上清液，過0．45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 統(tǒng)計學方法：利用Analyst TF 1． 6軟件采集數(shù)據(jù)，通過Markerview 1．2．1軟件進行處理，通過PCA分析尋找炮山甲與生品譜圖之間的差異，同時檢索質譜數(shù)據(jù)庫，對成分進行快速鑒定。

結 果

譜圖中各色譜峰分離度良好，炮山甲與藥材的譜圖存在差異。通過PCA分析，炮制品組，藥材組差異明顯，說明穿山甲經過炮制化學物質譜發(fā)生了較明顯的改變。通過穿山甲炮制品組，藥材組的載荷矩陣圖對圖中各個變量進行分析，搜索穿山甲炮制前后變化的化學成分。圖中的各點表示各個m/z質荷比，tR為保留時間的變量，點與圖中心點的距離表示了該變量對樣品分型所做出的貢獻大小，偏離越遠的點，其在不同樣品中的含有量變化越大，經過比較，發(fā)現(xiàn)穿山甲經砂燙炮制后顯著變化的有6個成分(見表1)。通過質譜數(shù)據(jù)分析，結合文獻研究，推測化合物1、5分別是絲-酪環(huán)二肽[4]及苯丙-脯環(huán)二肽[12]。對此6種差異性成分進行提取，得到相應的積分值，比較穿山甲炮制前后相關成分的變化趨勢可知，砂燙后，出現(xiàn)了絲-酪環(huán)二肽及苯丙-脯環(huán)二肽以及兩個未知成分另外兩種成分量顯著升高。

討 論

穿山甲生品不入藥，經炮制后才具有通經下乳，消腫排膿等功效，作為極具中藥特色的傳統(tǒng)炮制，在影響中藥臨床療效及質量上起著極其重要的作用。目前對于穿山甲炮制機理的研究主要集中在砂炒、醋炒、挫碎等穿山甲炮制品的氨基酸含量或是浸出物的比較。醋山甲的水溶性浸出物比燙山甲的水溶性浸出物增加28.99%～40.94%，穿山甲經炮制后，蛋白質含量會隨著溫度的升高而降低，并且經醋制后炮山甲中蛋白質含量會變低低。挫碎的穿山甲與砂炒、醋炒后的游離氨基酸相比，含量最少。醋炒比砂炒的氨基酸量稍高。炮山甲水煎液中沒有分子量4000 Da以下的多肽。對于炮制前后穿山甲環(huán)肽類成分的變化很少。穿山甲炮制后藥效的改變這可能是由于穿山甲鱗片中的特殊高酪氨酸蛋白發(fā)揮著作用，穿山甲片在砂燙高熱處理過程中，角質層和釉質層產生了不同程度的破壞，可能致使大量高酪氨酸角蛋白降解，角蛋白會被分解為各種多肽及其他產物，含有酪氨酸或是其他碎片的基團在反應中從肽鍵中釋放出來，從而形成絲-酪環(huán)二肽等產物。而這些變化的成分，主要集中在極性較大的親水性部位，這就有利于炮甲片有效成分的煎出，就有可能是穿山甲炮制品增效的物質基礎。

本實驗基于飛行時間質譜聯(lián)用技術所提供的高質量質譜數(shù)據(jù)，對穿山甲藥材及其炮制品中的成分變化進行全面分析，為穿山甲炮制后變化的化學成分鑒定提供了一種高效、準確的的分析方法。同時為炮甲片的藥效物質基礎的深入研究提供了相關基礎。

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[2] 吳芝園，劉 遜.穿山甲現(xiàn)代臨床應用淺談[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2016,12(4)：77-80.

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[4] 王樹春，張 麗，吳云山，等.藥材穿山甲的X射線衍射Fourier譜分析鑒定[J]．藥物分析雜志，2003增刊：19-22．

[5] 羅憲堂，錢 進，李 瑛，等．豬蹄甲與穿山甲片中化學元素和氨基酸的分析比較[J]．中醫(yī)藥學刊， 2002， 20(5)：604-605．

[6] 許重遠，張 焜，李亦蕾，等．高效毛細管蛋白電泳法對雞內金和穿山甲的鑒別[J]．解放軍藥學學報，2007，23(6)：464-466．

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(收稿：2017-03-07)

TOF MS-IDA-MS/MS based analysis on material base of Manis pentadactyla stir fried with sand

Yuan Juanjuan，Liu Xun.

Kunshan Hospital of Traditional Chinese Medicine in Jiangsu Province(Kunshan 215300)

Objective：To conduct a preliminary research on the synergistic mechanism of pangolin scales. Methods：The components of pangolin scales were analyzed by TOF MS-IDA-MS/MS before and after processing. The target compounds were also analyzed using analysis software such as Markerview. The compounds were then screened and the chemical constituents detected by the relative molecular mass and MS2 were identified. Results：The results have shown that PCA analysis conducted was able to effectively distinguish the changes that occurred before and after processing pangolin scales. After undergoing processing, four (4) new components occurred.An increase on the level of Cyclo-(Ser-Tyr) and Cyclo-(Phe-Pro), two components already present in pangolin scales. Conclusion：The Hydrophilic substances present on the cyclo-dipeptide are increased after processing pangolin scales. Hydrophilic contents of cyclo-dipeptide are known to be an important material basis of synergism of pangolin scales.

Manis pentadactyla Processing TOF MS-IDA-MS/MS Component analysis

*江蘇省蘇州市科技發(fā)展計劃項目(SYSD2013067)

穿山甲 炮制 TOF MS-IDA-MS/MS 成分分析

R684.3

A DOI 10.3969/j.issn.1000-7369.2017.06.058

△通訊作者