不同產(chǎn)地蟬花中腺苷、蟲草素和麥角甾醇的含量比較

張洪梅 史曉颯 劉騰飛 馬維維 張艷聰 史新元

·論著·

不同產(chǎn)地蟬花中腺苷、蟲草素和麥角甾醇的含量比較

張洪梅 史曉颯 劉騰飛 馬維維 張艷聰 史新元

目的 分析比較10批不同產(chǎn)地蟬花中腺苷、蟲草素和麥角甾醇的含量，為蟬花的質(zhì)量評價(jià)及生產(chǎn)用藥的篩選提供方法和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。方法 采用高效液相色譜法分別測定不同產(chǎn)地蟬花中腺苷、蟲草素和麥角甾醇的含量。結(jié)果 腺苷以江蘇茅山的蟬花含量最高，為44.957 μg/g，廣西玉林的最低，為11.331 μg/g；蟲草素以四川宜賓的含量最高，為191.725 μg/g，江西九江的蟬花含量最低，為25.437 μg/g；各產(chǎn)地麥角甾醇含量差異相對較小，范圍為120.024～301.652 μg/g。結(jié)論 不同產(chǎn)地蟬花中的腺苷、蟲草素和麥角甾醇的含量差異較大；該方法適用于蟬花中腺苷、蟲草素和麥角甾醇的含量測定，為其質(zhì)量評價(jià)提供參考。

蟬花； 腺苷； 蟲草素； 麥角甾醇； 高效液相色譜法

蟬花又名蟬蛹草、蟬茸等，是蟬擬青霉等真菌寄生于一些蟬若蟲后形成的菌蟲復(fù)合體，隸屬真菌門、子囊菌綱、麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬，是傳統(tǒng)中藥材之一[1-3]。現(xiàn)代研究表明，蟬花具有調(diào)節(jié)人體免疫[4-6]、改善腎功能[7-9]、抗菌[10-11]、抗腫瘤[12-14]、抗氧化等多種藥理活性。

作為一種傳統(tǒng)的藥用真菌，蟬花富含多種必需氨基酸、多糖、腺苷、麥角甾醇、蟲草素等活性物質(zhì)[15-16]。其中，腺苷是一種嘌呤核苷，其含量已被用作多種蟲草的質(zhì)控指標(biāo)。有報(bào)道表明，蟬花中的腺苷含量約為冬蟲夏草中的4倍[17]。腺苷涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多種生理過程的調(diào)節(jié)，具有防止心律失常、降低血壓、抑制血小板凝集等作用[18]。蟲草素是第一個(gè)從真菌中分離出來的核苷類成分，具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、提高人體免疫力等生理活性[19]，在醫(yī)藥方面具有廣泛的應(yīng)用前景。麥角甾醇是真菌類細(xì)胞膜上的特征甾醇，在蟲草類真菌中含量相對穩(wěn)定，專一性強(qiáng)，通常作為質(zhì)量控制指標(biāo)之一，它是維生素D2的前體物質(zhì)，其次生代謝產(chǎn)物可產(chǎn)生麥角甾醇氧化物，對真菌具有重要的生理功能，且具有抗癌、減毒等廣泛的生物學(xué)活性[20]。

目前，利用HPLC法對蟬花中核苷類成分進(jìn)行測定已有較多文獻(xiàn)報(bào)道[17,21-23]，但對其麥角甾醇含量測定的研究較少，蟬花的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)較為單一；且現(xiàn)有研究多集中于對蟬花和其他蟲草類活性成分的比較，缺少對不同產(chǎn)地蟬花中有效成分的差異性研究。中國蟬花資源分布廣泛，由于各產(chǎn)地的環(huán)境差異較大，蟬花中的活性成分也存有一定差異，導(dǎo)致蟬花品質(zhì)參差不齊。因此，分析比較各產(chǎn)地蟬花中的有效成分，科學(xué)評價(jià)各產(chǎn)地蟬花的質(zhì)量十分有意義。本文收集了安徽、浙江、福建等十個(gè)產(chǎn)地的蟬花藥材，采用HPLC法對腺苷、蟲草素、麥角甾醇的含量進(jìn)行了測定，以了解不同產(chǎn)地蟬花中活性成分的含量是否存在差異、綜合評價(jià)不同產(chǎn)地蟬花的質(zhì)量，以期為蟬花的質(zhì)量評價(jià)提供方法和依據(jù)，并為臨床與生產(chǎn)用藥的篩選提供參考。

1 儀器與材料

1.1 供試樣品

安徽、福建、廣東、廣西玉林、江蘇、九江、四川北川、四川綿陽、四川宜賓、浙江十個(gè)產(chǎn)地的蟬花，均為干品。將其粉碎為粉末，裝入密封袋，置于干燥器中保存。

1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：腺苷(批號：110879-200202，中國食品藥品檢定研究院)；蟲草素(批號：58-200202，中國藥品生物制品檢定所)；麥角甾醇(批號：20150905，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；甲醇為色譜醇(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(PDA檢測器，美國沃特世公司)；超聲波清洗器(昆山市一波超聲儀器有限公司)；電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；電熱恒溫水浴鍋HW SY21-KP4型(北京市長風(fēng)儀器儀表公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

2.1.1 腺苷標(biāo)準(zhǔn)液的制備 精密稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品2.32 g，置于20 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，溶解搖勻，作為儲備液。精密吸取腺苷儲備液，用甲醇依次稀釋成濃度為5.8、11.6、23.2、58.0、116.0 μg/mL的系列溶液，作為腺苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.2 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)液的制備 精密稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，溶解搖勻，即為1 mg/mL蟲草素儲備液。精密吸取蟲草素儲備液，用甲醇依次稀釋濃度為25.0、50.0、75.0、100.0、125.0 μg/mL的系列溶液，作為蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.3 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液的制備 精密稱取麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品3.80 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，溶解搖勻，作為麥角甾醇儲備液。精密吸取麥角甾醇儲備液，用甲醇依次稀釋成濃度為9.28、18.56、37.13、74.25、148.50 μg/mL的系列溶液，作為麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 腺苷供試品溶液的制備 稱取各產(chǎn)地蟬花粉末(過50目篩)約0.20 g置于具塞錐形瓶中，精密加入20%乙醇溶液25 mL，超聲提取30分鐘，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，按色譜條件進(jìn)行含量測定。

2.2.2 蟲草素供試品溶液的制備 稱取各產(chǎn)地蟬花粉末(過50目篩)約0.25 g置于錐形瓶中，精密加入蒸餾水20 mL，在70℃水浴鍋中浸提5小時(shí)，冷卻，過濾，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，按色譜條件進(jìn)行含量測定。

2.2.3 麥角甾醇供試品溶液的制備 稱取各產(chǎn)地蟬花粉末(過50目篩)約0.25 g置于錐形瓶中，精密加入88%乙醇溶液50 mL，在80℃水浴鍋中提取45分鐘，冷卻，過濾，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，按色譜條件進(jìn)行含量測定。

2.3 色譜條件

2.3.1 腺苷含量測定 色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫：0～10分鐘，1%A～5%A；10～15分鐘，5%A～15%A；15～20分鐘，15%A～20%A；20～30分鐘，20%A；30～35分鐘，20%A～35%A；35～40分鐘，35%A～1%A，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為260 nm，進(jìn)樣量為20 μL。腺苷對照品及樣品HPLC測定結(jié)果見圖1。

圖1 腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(A)和江蘇茅山產(chǎn)地蟬花樣品(B)色譜圖

2.3.2 蟲草素含量測定 色譜柱同2.3.1。流動相為甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫：0～5分鐘，15%A～20%A；5～10分鐘，20% A；10～15分鐘，20% A～15% A，流速為0.8 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為260 nm，進(jìn)樣量為20 μL。蟲草素對照品及樣品HPLC測定結(jié)果見圖2。

圖2 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品(A)和四川宜賓產(chǎn)地蟬花樣品(B)色譜圖

2.3.3 麥角甾醇含量測定 色譜柱同2.3.1。流動相為甲醇-水(98∶2)，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為283 nm，進(jìn)樣量為20 μL。麥角甾醇對照品及樣品HPLC測定結(jié)果見圖3。

2.4 線性關(guān)系考察

依次吸取腺苷系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液各20 μL，根據(jù)2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。同法，按2.3.2、2.3.3項(xiàng)下色譜條件分別得蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品和麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程，見表1。

結(jié)果表明，腺苷在線性范圍5.8～116.0 μg/mL、蟲草素在線性范圍25.0～125.0 μg/mL、麥角甾醇在線性范圍9.28～148.5 μg/mL內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，符合試驗(yàn)要求。

圖3 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(A)和安徽產(chǎn)地蟬花樣品(B)色譜圖

成分回歸方程相關(guān)系數(shù)(R2)線性范圍(μg/mL)腺苷Y=44.9407X-0.01090.9995.8～116.0蟲草素Y=25.1982X+0.80050.99925.0～125.0麥角甾醇Y=87.0091X-0.09740.9999.28～148.5

2.5 精密度考察

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液腺苷23.2 μg/mL、蟲草素25.0 μg/mL、麥角甾醇37.13 μg/mL，分別按2.3項(xiàng)下相應(yīng)色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，進(jìn)樣6次，每次20 μL，測定峰面積，并計(jì)算RSD分別為腺苷0.98%、蟲草素1.32%、麥角甾醇1.55%，表明儀器精密度符合試驗(yàn)要求。

2.6 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量蟬花粉末(過50目篩)0.2 g，共6份，分別加入濃度為腺苷5.8 μg/mL、蟲草素25.0 μg/mL、麥角甾醇37.13 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，按照上述制備方法及色譜條件制樣、測定，并計(jì)算回收率、RSD值分別為腺苷95.7%、2.04%，蟲草素98.4%、1.72%，麥角甾醇100.2%、1.79%，結(jié)果表明，準(zhǔn)確度符合試驗(yàn)要求。

2.7 重復(fù)性考察

取安徽產(chǎn)地蟬花粉末(過50目篩)按上述供試品溶液制備方式制備6份供試品溶液，精密吸取20 μL，注入色譜儀，測定并計(jì)算。結(jié)果樣品中腺苷、蟲草素、麥角甾醇平均含量分別為39.04 μg/g、140.52 μg/g、301.65 μg/g，RSD分別為2.32%、1.27%、1.73%，重復(fù)性符合試驗(yàn)要求。

2.8 穩(wěn)定性考察

取安徽產(chǎn)地蟬花供試品溶液20 μL，分別測定0、5、10、15、20、25小時(shí)腺苷、蟲草素、麥角甾醇的峰面積值，計(jì)算RSD值分別為1.78%、1.46%、1.53%，表明供試品溶液中腺苷、蟲草素、麥角甾醇成分在25小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 樣品測定

精密吸取供試品溶液20 μL，分別進(jìn)樣，記錄峰面積，外標(biāo)定量測得各產(chǎn)地蟬花中腺苷、蟲草素、麥角甾醇的含量。見表2。

從表中可以看出，各產(chǎn)地蟬花中腺苷、蟲草素和麥角甾醇含量均存在一定差異，其中，腺苷和蟲草素含量差異較大。腺苷以江蘇茅山的蟬花含量最高，為44.957 μg/g，廣西玉林的最低，為11.331 μg/g，相差近4倍；蟲草素以四川宜賓的含量最高，為191.725 μg/g，江西九江的含量最低，僅為25.437 μg/g，相差8倍左右。相較而言，各產(chǎn)地麥角甾醇含量差異較小，范圍為120.024～301.652 μg/g。

表2 不同產(chǎn)地蟬花中腺苷、蟲草素和麥角甾醇的含量

整體而言，四川綿陽、四川宜賓和安徽大別山的蟬花中三種成分含量較高，一定程度上反映了這三個(gè)產(chǎn)地的蟬花質(zhì)量較好。

3 討論

近年來，蟬花由于其豐富的營養(yǎng)價(jià)值和廣泛的藥理活性備受關(guān)注，有研究表明，蟬花是一種不亞于冬蟲夏草和蛹蟲草的優(yōu)質(zhì)蟲草[17]，顯示了蟬花廣闊的藥用前景。其中，有效成分的研究是開發(fā)并評價(jià)蟬花藥用價(jià)值的基礎(chǔ)，本文采用HPLC法分別對安徽、浙江、江西等十個(gè)產(chǎn)地的蟬花中腺苷、蟲草素和麥角甾醇的含量進(jìn)行了測定。通過對標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性和重復(fù)性的考察，證明了該方法的適用性。

不同產(chǎn)地蟬花供試品中腺苷、蟲草素和麥角甾醇成分含量存在明顯差異，這可能與各地的環(huán)境不同、菌種差異及產(chǎn)品保存時(shí)間和方式等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)檢測對比了蟬花中三種成分的含量差異，為綜合評價(jià)各地蟬花質(zhì)量提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并可為將來蟬花的臨床應(yīng)用與生產(chǎn)用藥提供一定參考。

但由于條件所限，本研究僅對十個(gè)產(chǎn)地蟬花中核苷類成分的腺苷、蟲草素進(jìn)行了定量分析，不能反映蟬花中整體核苷成分信息；對于蟬花甾醇類成分檢測，也僅對麥角甾醇進(jìn)行了簡單定量研究，沒有考慮其他甾醇類物質(zhì)。此外，目前對于各產(chǎn)地蟬花的藥理藥效的差異尚不了解，可于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中將其與活性成分差異相結(jié)合，為蟬花資源的進(jìn)一步開發(fā)利用甚至不同用途的蟬花的選擇提供理論上的依據(jù)及可行性分析。

[1] 任潁芳，朱戎.中藥蟬花藥物考證及其防治腎病的研究進(jìn)展[J].河南中醫(yī)，2013，33(5)：781-784.

[2] 陳顯群，羊悅，楊勝利.中藥蟬花菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J].浙江化工，2015，46(2)：18-21.

[3] 裘潔，宋捷民.蟬花的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國民族民間醫(yī)藥，2009，18(9)：4-6.

[4] 宋捷民，陳玲，陳瑋，等.蟬花對免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2007，14(1)：37-38.

[5] Takano F，Yahagi N，Yahagi R，et al. The liquid culture filtrates of Paecilomycestenuipes(Peck )Samson (=Isaria japonica Yasuda )and Paecilomyces cicadae (Miquel)Sam son(=Isariasinclairii(Berk.)Llond)regulate Th1 and Th2 cytokine response in murine Peyer s' patch cells in vitro and ex vivo[J]. IntImmunopharmacol，2005，5(5)：903-916.

[6] Kuo Y C, Weng S C, Chou C J, et al. Activation and proliferation signals in primary human T lymphocytes inhibited by ergosterol peroxide isolated from Cordyceps cicadae[J]. British Journal of Pharmacology, 2003, 140(5):895-906.

[7] 謝煒，郭月芳，盛雨辰.蟬花菌絲體對慢性腎功能衰竭大鼠的治療作用[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2011，42(10)：770-772.

[8] 劉玉寧，陳以平，王立紅，等. 蟬花菌絲抗大鼠腎小管間質(zhì)纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2011，12(3)：243-245.

[9] Zhu R，Chen Y P，Deng Y Y，et al. Cordyceps cicadae extracts ameliorate renal malfunction in a remnant kidney model[J]. Journal of Zhejiang Universityence B，2011，12(12)：1024-1033.

[10] 徐紅娟，莫志宏，余佳文，等.蟬花抗真菌活性成分的分離純化研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22(5)：794-797.

[11] Sharma S K，Gautam N，Atri N S. Optimized extraction，composition，antioxidant and antimicrobial activities of exo and intracellular polysaccharides from submerged culture of Cordycepscicadae[J]. Bmc Complementary & Alternative Medicine，2015，15(1)：1-10.

[12] 蔡菊芬，姜志明，盧紅陽，等.蟬擬青霉不同純化組分對體外抗腫瘤作用的基礎(chǔ)研究[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28(4)：760-764.

[13] Wang H，Zhang J，Sit W H，et al. Cordyceps cicadae induces G2/M cell cycle arrest in MHCC97H human hepatocellular carcinoma cells：A proteomic study[J]. Chinese Medicine，2014，9(1)：15-15.

[14] Wang J，Zhang D M，Jia J F，et al. Cyclodepsipeptides from the ascocarps and insect-body portions of fungus Cordyceps cicadae[J]. Fitoterapia，2014，97(17)：23-27.

[15] 王琪，劉作易.藥用真菌蟬花的研究進(jìn)展[J].中草藥，2004，34(4)：469-471.

[16] Wang S X，Liu Y，Zhang G Q，et al. Cordysobin，a novel alkaline serine protease with HIV-1 reverse transcriptase inhibitory activity from the medicinal mushroom Cordycepssobolifera[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering，2012，113(1)：42-47.

[17] 溫魯，唐玉玲，張平.蟬花與有關(guān)蟲草活性成分檢測比較[J].江蘇中醫(yī)藥，2006，27(1)：45-46.

[18] 趙京林.腺苷與心臟保護(hù)的研究進(jìn)展[J].中國心血管病研究雜志，2004，2(8)：658-661.

[19] SJ Park，YJ Ahn，SG Lee，et al. Cordycepin：selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordycepsmilitaris against Clostridium spp[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48(7)：2744-2748.

[20] 韋會平，肖波，胡開治.蛹蟲草藥用價(jià)值考[J].中藥材，2004，27(3)：215-217

[21] 呂慧慧，楊安倫，張浩. HPLC-DAD同時(shí)測定金蟬花中8種核苷類成分的含量[J].實(shí)用藥物與臨床，2015，18(12)：1466-1469.

[22] 周堯，滕曄，宋玉良，等.HPLC法測定金蟬花及半野生培養(yǎng)品中腺苷成分的含量[C]//2013第六次臨床中藥學(xué)學(xué)術(shù)年會暨臨床中藥學(xué)學(xué)科建設(shè)經(jīng)驗(yàn)交流會論文集，2013.

[23] 陳安徽，陳宏偉，徐洋，等.蟬花蟲草中核苷類成分的分離純化和鑒定[J]. 食品科學(xué)，2013，34(1)：131-134.

(本文編輯： 董歷華)

Comparing research on contents of adenosine, cordycepin and ergosterol in cordyceps cicadae

ZHANGHongmei，SHIXiaosa，LIUTengfei，etal.

SchoolofChineseMaterialMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China

Correspondingauthor：SHIXinyuan，E-mail：xyshi@126.com

Objective The contents of adenosine、cordycepin and ergosterol in cordyceps cicadae from 10 different areas were compared to provide basis for the quality evaluation and utilization of cordyceps cicadae. Methods The high performance liquid chromatography(HPLC) was used to measure the contents of adenosine、cordycepin and ergosterol in cordyceps cicadae from different areas. Results The highest content of adenosine in cordyceps cicadae was 44.957 μg/g from Jiangsu，and the lowest was 11.331 μg/g from Guangxi. The highest content of cordycepin was from Sichuan and the content was 191.725 μg/g，and that from Jiangsu was 25.437 μg/g，which was the lowest. The content of ergosterol in cordyceps cicadae from different areas varied from 120.024 μg/g to 301.652 μg/g. Conclusion There is difference among the contents of adenosine、cordycepin and ergosterol in Cordyceps cicadae from different areas；the method can be used to determine them in cordyceps cicadae，and to provide the reference for the quality evaluation of cordyceps cicadae.

Cordyceps cicadae； Adenosine； Cordycepin； Ergosterol； HPLC

100102 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院[張洪梅(碩士研究生)、史曉颯(碩士研究生)、劉騰飛(博士研究生)、馬維維(碩士研究生)、張艷聰(碩士研究生)、史新元]

張洪梅(1993- )，女，2016級在讀碩士研究生。研究方向：中藥生物技術(shù)研究。E-mail：lovvendy@126.com

史新元(1974- )，女，博士，教授。研究方向：中藥生物技術(shù)研究。E-mail：xyshi@126.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.03.010

2016-08-22)