高效液相色譜法測定黃芪赤風(fēng)湯提取物中萜類和色酮類成分的含量

谷雨龍 劉斌 姜艷艷

·論著·

高效液相色譜法測定黃芪赤風(fēng)湯提取物中萜類和色酮類成分的含量

谷雨龍 劉斌 姜艷艷

目的 建立HPLC法測定黃芪赤風(fēng)湯提取物中萜類和色酮類成分的含量。方法 采用Venusil MP-C18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈(A)-水(B)為流動相進(jìn)行梯度洗脫(0～45 min，10%→18% A；45～100 min，18%→45% A)；檢測波長：220 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；LCMS-IT-TOF法指認(rèn)萜類和色酮類成分，分別以芍藥苷和毛蕊異黃酮苷為參比計(jì)算兩類成分含量。結(jié)果 芍藥苷和毛蕊異黃酮苷的線性范圍分別為0.279～6.696 μg和0.192～4.608 μg(r=0.999 8)；平均回收率(n=6)分別為98.83%和98.21%，RSD分別為3.06%和3.24%；經(jīng)LCMS-IT-TOF法指認(rèn)萜類成分4個，色酮類成分12個。結(jié)論 所建立的方法快速、簡單、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，精密度好，可用于黃芪赤風(fēng)湯提取物的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法； 黃芪赤風(fēng)湯提取物； 芍藥苷； 毛蕊異黃酮苷

經(jīng)典方劑黃芪赤風(fēng)湯源自清代王清任的《醫(yī)林改錯》，由黃芪、赤芍和防風(fēng)組成。其中，黃芪補(bǔ)氣活血、宣通營衛(wèi)，為君藥；赤芍清熱涼血、活血祛瘀，助黃芪使氣足血行，周流全身，為臣藥；佐以防風(fēng)祛風(fēng)解表、勝濕解痙止痛?！叭缰沃T瘡、諸病，或因病虛弱，服之皆效。無病服之，不生疾病。此方治諸病皆效者，能使周身之氣通而不滯，血活而不瘀，氣通血活，何患疾病不除?！爆F(xiàn)代研究表明，黃芪皂苷及黃酮部位可以抑制滑膜成纖維細(xì)胞的增殖，發(fā)揮保護(hù)關(guān)節(jié)損傷的作用，黃芪黃酮具有免疫調(diào)節(jié)作用[1-3]；赤芍單萜苷具有消炎鎮(zhèn)痛、改善血液流變學(xué)和免疫調(diào)節(jié)的作用[4,5]；防風(fēng)色原酮有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎和降低血漿黏度活性[6,7]，上述四類成分系該方的主要有效部位或組分。為此，采用大孔吸附樹脂分離純化技術(shù)，分離富集了黃芪皂苷與黃酮部位、赤芍單萜苷部位、防風(fēng)色原酮部位，制得黃芪赤風(fēng)湯提取物，先期采用不同方法對該方提取物中主要成分含量進(jìn)行了測定[8-9]。為全面控制該方提取物質(zhì)量，采用LCMS-IT-TOF對其化學(xué)成分進(jìn)行分析(另文發(fā)表)，同時以芍藥苷作為萜類(黃芪皂苷、赤芍單萜苷)的指標(biāo)性成分，以毛蕊異黃酮苷作為色酮類(黃芪黃酮、防風(fēng)色原酮)的指標(biāo)性成分，建立HPLC方法同時測定兩類成分的相對含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

LCMS-IT-TOF儀(日本島津公司)，SIL-20AC自動進(jìn)樣器，SPD-20A檢測器，LabSolutions工作站；FC104型十萬分之一電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)，KQ-500E超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)，Milli-Q超純水儀(密理博公司)。

黃芪赤風(fēng)湯提取物(自制)。色譜級乙腈(Fisher Scientific)，超純水，其他試劑均為分析純。

芍藥苷(批號BBT0148-20111122)和毛蕊異黃酮苷(批號20121334)對照品購自天津一方科技有限公司。黃芪(批號120505)產(chǎn)地為內(nèi)蒙古，購自北京亞威中藥飲片有限公司，赤芍(批號120201)、防風(fēng)(批號120301)產(chǎn)地分別為內(nèi)蒙古和黑龍江，購自湖北金貴中藥飲片有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉春生教授鑒定，分別為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var. mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根、毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根、傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.) Schischk.未抽花莖的干燥根。

1.2 溶液制備

1.2.1 對照品溶液制備 稱取芍藥苷和毛蕊異黃酮苷對照品適量，加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為490 μg/mL和558 μg/mL的對照品儲備液。分別吸取對照品儲備液2 mL和2.5 mL，用甲醇定容至5 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為196 μg/mL、279 μg/mL的芍藥苷、毛蕊異黃酮苷混合對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液 取黃芪赤風(fēng)湯提取物干燥粉末約20 mg，精密稱定，加入70%乙醇(v/v)5 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)60分鐘，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇(v/v)補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3 色譜條件

Venusil MP-C18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈(A)-水(B)為流動相進(jìn)行梯度洗脫(0～45 min，10%→18% A；45～100 min，18%→45% A)；檢測波長：220 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。在上述色譜條件下，分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣。在混合對照品溶液和供試品溶液色譜圖相應(yīng)位置上，有相同保留時間的色譜峰，且各成分分離良好(見圖1)。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液1、2、4、8、12、16、24 μL進(jìn)樣，分別以芍藥苷和毛蕊異黃酮苷的含量為橫坐標(biāo)，以其峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程。芍藥苷的回歸方程為：Y=347 900X+3 526.7，r=0.999 8；毛蕊異黃酮苷的回歸方程為：Y=1 997 543X-58 026，r=0.999 8。結(jié)果表明：芍藥苷在0.279～6.696 μg質(zhì)量范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系；毛蕊異黃酮苷在0.192～4.608 μg質(zhì)量范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

1.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一份黃芪赤風(fēng)湯提取物供試品溶液，在“1.3”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算芍藥苷和毛蕊異黃酮苷峰面積的RSD(n=6)分別為0.54%和1.32%。

1.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份黃芪赤風(fēng)湯提取物供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24小時注入液相色譜儀，計(jì)算芍藥苷和毛蕊異黃酮苷峰面積的RSD(n=6)分別為3.18%和1.95%。

1.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批黃芪赤風(fēng)湯提取物干燥粉末6份，每份約20 mg，精密稱定，按照“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“1.3”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣測定。計(jì)算芍藥苷和毛蕊異黃酮苷平均含量(n=6)分別為97.22 mg/g和40.26 mg/g，RSD分別為2.83%和3.39%。

1.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批黃芪赤風(fēng)湯提取物干燥粉末6份，每份約10 mg，精密稱定，分別精密加入一定量的芍藥苷(490 μg/mL)和毛蕊異黃酮苷(558 μg/mL)對照品溶液，按照“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，分別計(jì)算回收率。結(jié)果芍藥苷和毛蕊異黃酮苷平均回收率(n=6)分別為98.83%和98.21%，RSD分別為3.06%和3.24%。

注：1.氧化芍藥苷；2. 芍藥苷；3. 升麻素苷；4. 毛蕊異黃酮苷；5. 升麻素；6. 5-O-甲基維斯阿米醇苷；7. 芒柄花苷； 8. 毛蕊異黃酮-7-O-β-D-(6″-乙?；?-葡萄糖苷；9. 9, 10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-葡萄糖苷；10. 亥茅酚苷；11. 異槲皮苷； 12. 毛蕊異黃酮；13. 芒柄花素；14. 黃芪皂苷乙；15. 珊瑚菜素；16. 黃芪皂苷Ⅱ(或異黃芪皂苷Ⅱ)

圖1 黃芪赤風(fēng)湯提取物中對照品(A)和供試品(B)高效液相色譜圖

1.5 測定方法

采用LCMS-IT-TOF法指認(rèn)萜類和色酮類成分，分別以芍藥苷和毛蕊異黃酮苷為參比計(jì)算兩類成分含量。

2 結(jié)果

2.1 LCMS-IT-TOF法指認(rèn)萜類和色酮類部位主要色譜峰

精密吸取黃芪赤風(fēng)湯提取物供試品溶液注入LCMS-IT-TOF，按照“1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測，根據(jù)黃芪赤風(fēng)湯提取物總離子流圖各色譜峰的保留時間，結(jié)合各色譜峰的一級、二級質(zhì)譜信息及紫外光譜信息，確定主要色譜峰結(jié)構(gòu)。同時通過對照品質(zhì)譜比對和文獻(xiàn)查閱[10-12]，指認(rèn)出16個色譜峰，其中萜類成分4個，分別為氧化芍藥苷(1號峰)、芍藥苷(2號峰)、黃芪皂苷乙(14號峰)和黃芪皂苷Ⅱ(或異黃芪皂苷Ⅱ)(16號峰)；色酮類成分12個，分別為升麻素苷(3號峰)、毛蕊異黃酮苷(4號峰)、升麻素(5號峰)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(6號峰)、芒柄花苷(7號峰)、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-(6″-乙酰基)-葡萄糖苷(8號峰)、9, 10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-葡萄糖苷(9號峰)、亥茅酚苷(10號峰)、異槲皮苷(11號峰)、毛蕊異黃酮(12號峰)、芒柄花素(13號峰)和珊瑚菜素(15號峰)。

2.2 萜類和色酮類成分含量測定

經(jīng)LCMS-IT-TOF法指認(rèn)的萜類和色酮類成分，分別以芍藥苷和毛蕊異黃酮苷的含量為參比計(jì)算出相對含量，并計(jì)算出黃芪赤風(fēng)湯提取物中可測總色酮類和可測總萜類成分的相對含量。結(jié)果見表1和表2。

表1 黃芪赤風(fēng)湯提取物中色酮類成分相對含量測定結(jié)果(n=3)

表2 黃芪赤風(fēng)湯提取物中萜類成分相對含量測定結(jié)果(n=3)

2.3 芍藥苷和毛蕊異黃酮苷含量測定結(jié)果

取3批黃芪赤風(fēng)湯提取物樣品，按照“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算芍藥苷和毛蕊異黃酮苷的含量。結(jié)果見表3。

表3 黃芪赤風(fēng)湯提取物樣品含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用SPD檢測器，分別在203、220、254、280、330 nm波長下考察黃芪赤風(fēng)湯提取物樣品HPLC圖譜，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)樣品在220 nm下的吸收峰最全、最多，故選擇220 nm下檢測樣品的萜類和色酮類成分。

經(jīng)LCMS-IT-TOF法指認(rèn)的16個成分中，來源于黃芪的成分9個，分別是毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-(6″-乙?；?-葡萄糖苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-葡萄糖苷、異槲皮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷乙和黃芪皂苷Ⅱ(或異黃芪皂苷Ⅱ)；來源于赤芍的成分2個，分別是氧化芍藥苷和芍藥苷；來源于防風(fēng)的成分5個，分別是升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷和珊瑚菜素。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-SPD法同時測定黃芪赤風(fēng)湯提取物中芍藥苷和毛蕊異黃酮苷的含量，并以二者為參比，分別計(jì)算樣品中16個萜類和色酮類成分的相對含量，可基本全面反映復(fù)方提取物質(zhì)量，方法簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，可用于黃芪赤風(fēng)湯提取物的質(zhì)量控制。

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(本文編輯： 董歷華)

RP-HPLC analysis of terpenoids and chromones in the extractive ofHuangqiChifengdecoction

GUYulong，LIUBin，JIANGYanyan.

KeyLaboratoryofChineseMinorityTraditionalMedicine(MinzuUniversityofChina)，StateEthnicAffairsCommissionandMinistryofEducation，Beijing100081，China

Correspondingauthor：GUYulong，E-mail：guyulong@muc.edu.cn

Objective To develop an HPLC method for determination of terpenoids and chromones in the extractive ofHuangqichifengdecoction. Methods Venusil MP-C18(4.6×250 mm，5 μm) was used to detect. The mobile phase was composed of acetonitrile(A) and water(B) with gradient elution(0～45 min，10%→18% A；45～100 min，18%→45% A) and the flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was 220 nm. The column temperature was 35℃. Terpenoids and chromones were identified by LCMS-IT-TOF method, paeoniflorin and calycosin-7-glucoside was regarded as reference to calculate. Results The linear ranges of paeoniflorin and calycosin-7-glucoside were 0.279～6.696 μg and 0.192 ～ 4.608 μg(r=0.999 8) respectively. The average recovery was 98.83% and 98.21 % (RSD<3.24%，n=6) respectively. Four terpenoids and twelve chromones were identified by LCMS-IT-TOF. Conclusion The method is simple, accurate, repeatable and can be used to control the quality of the extractive ofHuangqichifengdecoction.

HPLC； Extractive ofHuangqichifengdecoction； Paeoniflorin； Calycosin-7-glucoside

國家自然科學(xué)基金(81603278)；教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”(IRT_13R63)；中央民族大學(xué)青年教師科研專項(xiàng)(2016KYQN51)

100081 北京，中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(谷雨龍)；北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院(劉斌、姜艷艷)

谷雨龍(1982- )，博士，實(shí)驗(yàn)師。研究方向：傳統(tǒng)藥物分析。E-mail：guyulong@muc.edu.cn

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.03.009

2016-09-20)