Keap1、Nrf2和HO—1在大鼠應(yīng)激性胃潰瘍中的表達(dá)

黃攀++陸瀚文++周崢嶸++宋廣浩++安珂++張莊 丁威

摘要：探討Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）/核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）/血紅素氧合酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）信號通路在應(yīng)激性胃潰瘍發(fā)生及發(fā)展中的作用。建立大鼠水浸束縛應(yīng)激性（water immersion and restraint stress，WRS）胃潰瘍模型，按Guth[JP2]標(biāo)準(zhǔn)計算潰瘍指數(shù)（ulcer index，UI），應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測Keap1、Nrf2、HO-1在胃黏膜組織中的定位和表達(dá)情況。結(jié)果表明，WRS處理7 h后，大鼠胃黏膜出現(xiàn)明顯的點線狀出血；WRS處理前后，Keap1、Nrf2、HO-1蛋白均主要定位于大鼠胃底腺細(xì)胞胞質(zhì)中，其中Nrf2在潰瘍周圍胃底腺細(xì)胞胞核中也有表達(dá)；WRS處理7 h后，Keap1表達(dá)量顯著降低（P<0.05），于7 d后恢復(fù)至正常水平，而HO-1表達(dá)量顯著升高（P<0.05），于3 d后恢復(fù)至正常水平；Nrf2恢復(fù)3 d后表達(dá)量顯著升高（P<0.05），隨后出現(xiàn)下降。WRS處理后，Keap1、Nrf2、HO-1在大鼠胃黏膜中的定位和表達(dá)量均出現(xiàn)變化，提示Keap1/Nrf2/HO-1信號通路可能在應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮了一定抗應(yīng)激作用。

關(guān)鍵詞：應(yīng)激性胃潰瘍；Keap-1；Nrf2；HO-1；大鼠

中圖分類號： S858.91文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0280-03

收稿日期：2015-11-02

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：81300287）；江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK2011499、BK20140541）；江蘇大學(xué)高級人才項目（編號：12JDG084）。

作者簡介：黃攀（1984—），男，安徽安慶人，博士，講師，主要從事消化道潰瘍病研究。E-mail：phuang@ujs.edu.cn。

通信作者：丁威，博士，副教授，主要從事動物繁殖育種研究。E-mail：qishi6598@126.com。

應(yīng)激性胃潰瘍是動物受到環(huán)境應(yīng)激后，交感神經(jīng)系統(tǒng)（SNS）興奮性升高，血管收縮，引起胃黏膜缺血、缺氧、抵抗力下降，從而產(chǎn)生的急性出血性損傷[1]。應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)生及發(fā)展與細(xì)胞氧化應(yīng)激密切相關(guān)，應(yīng)激后下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）敏感性升高，引起胃酸、胃蛋白酶、胃泌素分泌增加[2-3]；同時，皮質(zhì)醇與兒茶酚胺的釋放可誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的生成，從而引起氧化應(yīng)激[4]。Keap1/Nrf2/HO-1信號通路在細(xì)胞抗氧化損傷和炎癥損傷過程中發(fā)揮重要作用[5]。生理狀態(tài)下，Nrf2與胞漿伴侶分子蛋白Keap1偶聯(lián)并被錨定在胞漿中，Nrf2處于相對失活狀態(tài)；當(dāng)細(xì)胞暴露于氧自由基時，Keap1的構(gòu)象發(fā)生改變，Nrf2從二聚體上解離并轉(zhuǎn)移進入細(xì)胞核，與核內(nèi)抗氧化應(yīng)答元件（antioxidant responsive element，ARE）結(jié)合，啟動ARE調(diào)控的下游抗氧化基因HO-1等的表達(dá)，清除多余的氧自由基，從而發(fā)揮抗應(yīng)激作用[6]。王菲等研究發(fā)現(xiàn)，Keap1和Nrf2在熱應(yīng)激造成的大鼠肝臟損傷中發(fā)揮抗應(yīng)激作用[7]。沈錫中研究發(fā)現(xiàn)，HO-1在乙酸誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍中表達(dá)明顯增強，對胃黏膜具有一定保護作用[8]。在胃潰瘍的發(fā)生及發(fā)展過程中，HO-1是否受上游Keap1/Nrf2/ARE信號通路的調(diào)控有待驗證。通過研究Keap1/Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白在大鼠應(yīng)激型胃潰瘍中的表達(dá)情況，初步探討其在應(yīng)激性胃潰瘍中可能發(fā)揮的作用。

1材料與方法

1.1試劑

Keap1抗體、Nrf2抗體、HO-1抗體均購自大連寶生物公司，ABC試劑盒購自武漢博士德生物公司，DAB購自 Sigma公司（美國），動物切片石蠟（熔點為60～62 ℃）、多聚甲醛購自上海凌鋒化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗動物處理

采用28只9～11周齡、體質(zhì)量200～220 g的雄性SD大鼠作為試驗動物，購自江蘇大學(xué)試驗動物中心。試驗前對大鼠饑餓處理24 h，然后采取束縛處理并浸泡于（20±2）℃的水中，水位達(dá)到大鼠劍突部[9]。分別于應(yīng)激后7 h、恢復(fù)3 d、恢復(fù)7 d時采樣。采用乙醚麻醉，頸椎脫臼致死。

1.3潰瘍指數(shù)的測定

剖腹將胃取出，結(jié)扎賁門和幽門，從腺胃部注入10 mL 1%多聚甲醛，并將全胃放入1%多聚甲醛溶液中浸泡 10 min；沿胃大彎將胃剪開，用生理鹽水輕輕沖洗胃黏膜面，按Guth標(biāo)準(zhǔn)評估胃黏膜損傷UI，并按以下標(biāo)準(zhǔn)累計積分[10]。按黏膜潰瘍或糜爛長度（mm）計算，斑點狀糜爛為1分；糜爛長度不足1 mm為2分，介于1～2 mm為3分，2～4 mm為4分，超過4 mm為5分；糜爛寬度超過1 mm則分值加倍。全胃得分之和為胃潰瘍指數(shù)。

1.4樣品處理與免疫組織化學(xué)

選取病變及與其交界處胃壁全層的胃組織，采用石蠟切片法制作成厚度為7 μm的切片，將切片進行免疫組織化學(xué)染色，觀察胃黏膜組織HO-1、Keap1、Nrf2的定位與表達(dá)。

1.5免疫組織化學(xué)陽性結(jié)果的判定

Keap1、Nrf2、HO-1蛋白陽性表達(dá)時，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色著色呈棕褐色。對上述結(jié)果采用雙評分半定量法進行統(tǒng)計，在顯微鏡下隨機觀察5個高倍鏡視野，每個視野計數(shù)的細(xì)胞≥1 000個，并統(tǒng)計陽性細(xì)胞的平均百分比，以此作為評分標(biāo)準(zhǔn)。具體評分方法為：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞占0～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。以染色程度作為評分標(biāo)準(zhǔn)，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將以上2種評分結(jié)果相加，作為該切片的表達(dá)強弱得分。每只大鼠選取10張切片，計算每組的平均得分。整個計數(shù)及評分過程均由2位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師協(xié)助完成。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”（x[TX-*5]±s）表示，所有試驗均重復(fù)4次以上。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，經(jīng)單因素方差分析（ANOVA），差異顯著性檢驗采用Turkey檢驗法進行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1WRS處理對大鼠胃黏膜UI的影響

由圖1可知，WRS處理7 h后，大鼠胃黏膜出現(xiàn)點線狀潰瘍出血和少量血凝塊，UI為39.7±6.8；恢復(fù)3 d時UI為 30.6±6.1，與WRS 7 h組相比差異不顯著（P>0.05）；恢復(fù) 7 d 時UI為10.4±5.0，顯著低于WRS 7 h組和恢復(fù)3 d組（P<0.05）。

2.2免疫組織化學(xué)檢測Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的定位

由圖2可知，WRS處理前后，Keap1（圖2-A）、Nrf2（圖2-B）、HO-1（圖2-C）3種蛋白均主要定位于大鼠胃底腺細(xì)胞胞質(zhì)中，其中Nrf2在潰瘍周圍胃底腺細(xì)胞胞核中也有表達(dá)。

2.3Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)水平

[CM（24]由圖3可知，WRS處理7[KG*3]h后，Keap1表達(dá)量顯著降低[CM）]

[FK（W12][TPHP1.tif]

[FK（W19][TPHP2.tif]

（P<0.05），7 d后恢復(fù)至正常水平。WRS處理7 h后，Nrf2表達(dá)量無顯著變化，但恢復(fù)3 d后其表達(dá)量顯著升高（P<0.05）；與恢復(fù)3 d組相比，恢復(fù)7 d時Nrf2表達(dá)量出現(xiàn)下降（P<0.05），但仍顯著高于正常水平（P<0.05）。WRS處理7 h后，HO-1表達(dá)量顯著升高（P<0.05），3 d后恢復(fù)至正常水平。

[TPHP3.tif]

3結(jié)論與討論

WRS處理大鼠被廣泛應(yīng)用于應(yīng)激性胃潰瘍病理機制的研究，具有簡單、高效、重復(fù)性高等特點，是理想的試驗動物模型。本試驗中，WRS處理7 h后，大鼠胃黏膜出現(xiàn)明顯的潰瘍病變，表明應(yīng)激性胃潰瘍模型建立成功。

動物受到環(huán)境應(yīng)激后，SNS、HPA敏感性升高，腎上腺素、糖皮質(zhì)激素、兒茶酚胺等激素的分泌增加，誘導(dǎo)氧自由基大量產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的生成，引起氧化應(yīng)激。大量研究表明，Keap1/Nrf2/HO-1信號通路在細(xì)胞抗氧化損傷和炎癥損傷等過程中發(fā)揮重要作用[5]。其中，核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2屬于CNC-bZIP（cap‘ncollar subfamily of basic leucine-zipper），即CNC亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族，能夠誘導(dǎo)一系列抗氧化劑保護蛋白的編碼，參與調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，是CNC家族成員中最強的轉(zhuǎn)錄因子[11]。大量研究表明Nrf2與多種疾病的發(fā)生有關(guān)[11-15]。很多因素可影響Nrf2的表達(dá)。Keap1是一種E3泛素連接酶，在胞漿中錨定于肌動蛋白，可調(diào)節(jié)Nrf2的泛素化過程，是氧化應(yīng)激反應(yīng)的主調(diào)節(jié)器[13]。生理狀態(tài)下，Nrf2與Keap1偶聯(lián)被錨定在胞漿中，Nrf2被泛素化修飾并快速降解，從而維持細(xì)胞基礎(chǔ)的氧化還原平衡；當(dāng)細(xì)胞暴露于氧自由基時，Keap1的構(gòu)象發(fā)生改變，Nrf2從二聚體上解離并轉(zhuǎn)移進入細(xì)胞核，調(diào)控下游抗氧化基因HO-1等表達(dá)，清除多余的氧自由基，從而發(fā)揮抗應(yīng)激作用[6，13]。通過免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，WRS處理前后，Keap1和Nrf2均主要定位于大鼠胃底腺細(xì)胞胞質(zhì)中，其中Nrf2在胃潰瘍組織周圍胃底腺細(xì)胞胞核中也有表達(dá)。蛋白表達(dá)半定量分析發(fā)現(xiàn)，WRS處理7 h后，Keap1表達(dá)量明顯下降，Nrf2在恢復(fù)3 d后表達(dá)量顯著升高。提示W(wǎng)RS處理可能導(dǎo)致大鼠胃底腺細(xì)胞胞質(zhì)中的Nrf2從二聚體解離，并轉(zhuǎn)移進入細(xì)胞核，從而起到了抗應(yīng)激作用。

HO-1為誘導(dǎo)性血紅素加氧酶，別稱熱體克蛋白32，很多誘導(dǎo)因素均可引起其活性及蛋白量增加。已有研究證實，HO-1作為一種應(yīng)激蛋白，在應(yīng)激和疾病條件下對消化道具有抗炎、抗組織損傷、抗氧化、保護細(xì)胞黏膜、調(diào)節(jié)胃腸運動等積極作用。目前已從動物和人的組織器官中分離純化出3種血紅素氧合酶（HO）的同工酶，HO-1為誘導(dǎo)型，HO-2、HO-3 為結(jié)構(gòu)型[16]。生理狀態(tài)下，消化道中的HO同工酶主要為HO-2，而HO-1在腸組織中不表達(dá)，僅在缺血、缺氧等刺激下才開始分泌HO-1。在消化道疾病中，HO-1的水平增加，發(fā)揮抗炎、抗氧化等細(xì)胞保護作用[17]。沈錫中在乙酸誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍模型中發(fā)現(xiàn)，HO-1蛋白定位于胃黏膜細(xì)胞中，胃潰瘍大鼠的胃黏膜HO-1基因表達(dá)水平顯著高于正常大鼠[8]。本試驗通過免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，WRS處理前后，HO-1均主要定位于大鼠胃底腺細(xì)胞胞質(zhì)中；蛋白表達(dá)半定量分析發(fā)現(xiàn)，WRS處理7 h后，HO-1表達(dá)量出現(xiàn)明顯升高的現(xiàn)象。提示應(yīng)激性胃潰瘍發(fā)生后，HO-1可能參與了胃黏膜抗損傷機制。

在應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)生及發(fā)展過程中，Keap1、Nrf2、HO-1出現(xiàn)了表達(dá)量和蛋白定位的改變，表明這3種蛋白可能均參與了胃黏膜的抗氧化損傷機制。由于調(diào)控Nrf2和 HO-1的信號通路非常多，Keap1/Nrf2/HO-1信號通路在應(yīng)激性胃潰瘍中的作用機制有待進一步驗證。

[HS2*5][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：[HT8.SS]

[1]Brzozowski T，Zwirska-Korczala K，Konturek P，et al. Role of circadian rhythm and endogenous melatonin in pathogenesis of acute gastric bleeding erosions induced by stress[J]. Journal of Physiology and Pharmacology，2007，58（6）：53-64.

[2]Yi S X，Peng Y，Chang X R，et al. Effect of pre-moxibustion on apoptosis and proliferation of gastric mucosa cells[J]. World Journal of Gastroenterology，2007，13（15）：2174-2178.

[3]Nie S N，Qian X M，Wu X H，et al. Role of TFF in healing of stress-induced gastric lesions[J]. World Journal of Gastroenterology，2003，9（8）：1772-1776.

[4]Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function[J]. Physiological Reviews，2002，82（1）：47-95.

[5]胡勇，張愛華. PKC-Nrf2/Keap1-ARE抗氧化通路與肝臟疾病[J]. 癌變·畸變·突變，2012，24（2）：151-156.

[6]劉芳，杜志銀，王應(yīng)雄. Keap1在氧化應(yīng)激方面的研究進展[J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2010，15（5）：596-600.[HJ1.77mm]

[7]王菲，黃毅，李延森，等. Keap1/Nrf2/ARE通路相關(guān)基因在熱誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激小鼠肝臟中的表達(dá)[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2014，30（3）：284-290.

[8]沈錫中. Heme Oxygenase-1對乙酸誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍的保護作用[J]. 世界華人消化雜志，2000，8（10）：1109-1112.

[9]Adachi M，Horiuchi G，Ikematsu N，et al. Intragastrically administered lysophosphatidic acids protect against gastric ulcer in rats under Water-Immersion restraint stress[J]. Digestive Diseases and Sciences，2011，56（8）：2252-2261.

[10]Guth P H，Aures D，Paulsen G. Topical aspirin plus HCl gastric lesions in the rat：cytoprotective effect of prostaglandin，cimetidine，and probanthine[J]. Gastroenterology，1979，76（1）：88-93.

[11]崔俁，馬海英，孔力. Nrf2/ARE通路與機體抗氧化機制的研究進展[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2011，37（1）：187-190.

[12]曹寶山，朱翔，陳森，等. Keap1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與化療療效相關(guān)性的研究[J]. 中國肺癌雜志，2012，15（10）：591-596.

[13]李雪麗，唐云，許雪珠. 核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2最新研究進展[J]. 中國組織工程研究，2012，16（24）：4530-4534.

[14]童霞，何曉彬. Nrf-2-ARE信號通路在胃癌治療研究中的作用及機制[J]. 中國醫(yī)藥科學(xué)，2013，3（4）：32-34.

[15]王怡，劉偉，趙鴻雁，等. 鎘對大鼠成骨細(xì)胞OPG/RANKL表達(dá)的影響[J]. 揚州大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2014，35（1）：9-12.

[16]馬小華，游曉星，吳移謀. HO-1在免疫調(diào)節(jié)中的作用及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進展[J]. 中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2011，39（6）：705-709.

[17]吳本娟，宋紅麗. 血紅素加氧酶-1與消化道疾病[J]. 天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，18（4）：526-528.